吳曉翠，陳壬寅，張　嵐，孟　輝

(1.河南省人民醫(yī)院放療科，河南 鄭州 450003；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052)

乳腺導管原位癌和早期微浸潤癌灶中HER-2/neu癌基因擴增及其臨床意義

吳曉翠1，陳壬寅2，張嵐2，孟輝2

(1.河南省人民醫(yī)院放療科，河南 鄭州 450003；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052)

[摘要]目的探討HER-2/neu癌基因在乳腺導管原位癌及早期微浸潤灶中的擴增情況及臨床意義。方法采用FISH法檢測了存檔的168例乳腺癌石蠟包埋組織標本HER-2/neu基因的擴增情況。結果單純導管原位癌9例，導管原位癌伴早期微浸潤癌83例，浸潤性導管癌29例，小葉原位癌6例，浸潤性小葉癌41例。單純導管原位癌病例中HER-2/neu基因擴增率66.7%(6/9)；導管原位癌伴早期微浸潤病例中HER-2/neu基因擴增率61.4%(51/83)；浸潤性導管癌中HER-2/neu基因擴增率34.5%(10/29)；小葉原位癌HER-2/neu基因擴增率0.0%(0/6)；浸潤性小葉癌中HER-2/neu基因擴增率12.2%(5/41)。結論HER-2/neu基因在導管原位癌和早期微浸潤病灶中擴增狀態(tài)無明顯差異，導管旁微浸潤病灶中HER-2/neu基因擴增情況基本與導管內一致；導管癌HER-2/neu基因擴增率高于小葉癌。

[關鍵詞]乳腺癌；HER-2/neu；導管原位癌；微浸潤

在美國，乳腺導管原位癌Ⅲ級占新診斷乳腺癌的12%～14%，50%未經治療的原位癌在24 a內均發(fā)展成為同側浸潤性乳腺癌。但目前其浸潤發(fā)生的生物機制人們還未完全理解。HER-2/neu基因通常在正?；蛄夹匀橄俨∽冎胁怀蔬^度表達，而在原位癌病變中呈過度表達。HER-2/neu基因的表達在侵襲性癌中比原位癌中大大降低[1-2]。但很少研究比較HER-2/neu基因在乳腺導管原位癌與乳腺導管原位癌合并浸潤癌組織中的表達[1,3-5]。原位癌組織中過度表達的HER-2/neu基因是否參與或決定了腫瘤惡性侵襲性及原位癌向浸潤癌的發(fā)展尚未得到證實。本研究中，我們對照研究了HER-2/neu基因在乳腺導管原位癌和早期導管微浸潤灶癌中擴增的頻率。其評價可能幫助識別存在進一步惡變潛能的原位癌，并為赫賽汀預防干預治療提供潛在的分子靶標。

1材料與方法

1.1標本來源及入選標準選擇2009年9月至2011年12月我院乳腺外科手術切除的乳腺癌組織標本168例，患者年齡(46.0±2.7)歲；導管原位癌9例，導管內癌伴早期微浸潤83例，浸潤性導管癌29例，小葉原位癌6例，浸潤性小葉癌41例。然后對每個原位癌病灶進行分級。

1.2FISH法檢測HER-2/neu基因擴增FISH法參照原位雜交試劑盒說明書進行，略加改進。HER-2/neu熒光原位雜交探針由北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供。使用前，DNA探頭先于病例組與對照組的HE染色標本中找到有乳腺導管原位癌區(qū)域及浸潤的癌灶部位。在找到的癌灶部位對標志基因進行檢測。具體步驟：切片預處理4～5 μm石蠟切片65 ℃烤片3 min，常規(guī)脫蠟至水，滴加已復溫的酶預處理液，室溫孵育5～10 min，蒸餾水洗3次，每次2 min，中性甲醛室溫固定10 min。梯度乙醇脫水(75%,85%,100%乙醇各2分鐘脫水)，自然干燥或電吹風吹30S。變性與雜交:每片滴加10 μL HER-2/neu探針混合物，立即用專用雜交蓋片覆蓋81 ℃ 變性6～10 min，42 ℃，雜交過夜(超過10 h)；洗滌:浸入0.4×SSC/0.3% NP-40洗滌液1.5 min，后浸入2×SSC/0.1% NP-40洗滌液0.5 min。70%乙醇洗滌5 min，自然干燥。10～15 μL DAPI復染。

1.3熒光顯微鏡判讀標準以萊卡DMBRX熒光顯微鏡，顯微鏡由DAPI，綠色光譜，橘色光譜3通道濾過光源觀察3種不同熒光信號。以FISH3.0成像系統(tǒng)進行圖像獲取及處理。紅色信號代表HER-2/neu基因，綠色信號代表17號染色體著絲粒探針。以紅綠信號比值來判斷HER-2/neu基因擴增狀況。比值<2.0為無擴增，比值≥2.0為基因擴增，紅信號顯示密集以致無法辨認為簇狀擴增[5]。首先在HE染色切片上確認浸潤性癌區(qū)域，然后在10倍物鏡下，于FISH切片上相同的組織細胞結構，要求至少找到2個浸潤性癌區(qū)域。然后在40倍物鏡下掃描整張切片，觀察是否存在HER-2/neu表達的異質性以及切片的質量，再于100倍物鏡下通過特異單通道濾光片觀察癌細胞核的FISH結果。每個靶視野計數(shù)60個腫瘤細胞核信號。

1.4微浸潤灶尋找方法乳腺浸潤癌是WHO(2003)乳腺腫瘤組織中分類提出的新名稱，是指在大量導管內癌背景下，乳腺(非特化的小葉)間質內出現(xiàn)一個或幾個鏡下明確分離的微小浸潤灶。浸潤癌多為浸潤性導管癌。單個浸潤性病灶最大直徑不超過2 mm，或者有2～3個浸潤灶，每個最大直徑不超過1 mm。首先在HE染色切片上確認導管內癌及微浸潤灶成份，結合HER-2/neu指標免疫組化結果，及結合SMA、CK5/6、Calponin、P63、S-100等免疫組化指標確認導管完整性及幫助辨認導管旁微浸潤成分，并注意尋找脂肪等間葉成分中浸潤的少量癌細胞。再于100倍物鏡下通過特異單通道濾光片觀察腫瘤細胞核的FISH結果。每個靶視野計數(shù)60個腫瘤細胞核信號。

1.5基因擴增率計算基因擴增率按照以下公式計算：HER-2/neu陽性病例數(shù)目/HER-2/neu陰性病例數(shù)目。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，全部分組標志定量數(shù)據(jù)以±s表示，比較采用單因素方差分析和t檢驗；定性數(shù)據(jù)以百分數(shù)表示，比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1大體觀察結果168例乳腺癌標本中，導管內癌9例，腫塊直徑為1.2～9.0 cm，均未見淋巴結轉移；導管內癌伴微浸潤83例，腫塊直徑0.6～16.0 cm，未見淋巴結轉移。

2.2光學顯微鏡下觀察情況導管原位癌表現(xiàn)為：乳頭狀、粉刺癌、實性、篩性、微乳頭狀等。導管顯著擴大，細胞有明顯多形性和異型性，排列紊亂極向消失。導管原位癌級別依據(jù)2012年版WHO乳腺腫瘤組織分類。低級別：核只有輕度多形性和異型性，無壞死。中級別：核有輕度多形性，和異型性伴或不伴壞死。高級別：核有明顯細胞學異型性及高分裂活性及壞死。經典型小葉癌組織學特點為：膨大的腺管內充滿均勻一致的瘤細胞；細胞通常較小，形態(tài)溫和，圓或多邊形，核深染，無明顯核仁，可有核溝；細胞漿較少，細胞輪廓不清，核分裂象、壞死及鈣化少見。微小浸潤灶為浸潤性導管癌，伴有導管周圍炎細胞和硬化性間質。腺管基膜和肌上皮可不完整。浸潤成分缺乏肌上皮。

2.3HER-2/neu基因擴增結果單純導管原位癌病例中，3例為擴增，擴增病例均為高級別導管原位癌，6例為無擴增；無擴增病例中2例為低級別導管原位癌，1例為乳頭狀癌(表1)。83例導管內癌伴早期微浸潤病例中，33例為簇狀擴增(圖1)，其中14例為17號染色體多倍體，余為整倍體；18例為點狀擴增(圖2)，其中1例為17號染色體單倍體，6例為17號染色體多倍體(圖3)，余為整倍體。32例未擴增病例中，2例為17號染色體多倍體，余為整倍體。所有擴增病例中，40例為高級別導管原位癌，且微浸潤癌灶絕大多數(shù)(49/51,96.1%)與導管原位癌同時擴增，微浸潤癌灶未擴增的2例(2/51,3.9%)表現(xiàn)為導管內癌成分小部分為HER-2/neu基因擴增，大部分為HER-2/neu基因未擴增。除這2例導管原位癌為部分擴增的病例表示導管原位癌擴增狀態(tài)外，其余均表示導管原位及微浸潤癌部分的共同的擴增狀態(tài)。

在擴增病例中，導管原位癌的HER-2/neu基因的平均擴增率與導管內癌伴早期微浸潤病例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；導管原位癌HER-2/neu基因的平均擴增率高于小葉原位癌，浸潤性導管癌HER-2/neu基因的平均擴增率高于浸潤性小葉癌(P<0.05)。

表1　乳腺導管內癌和早期浸潤癌HER-2/neu基因擴增比較　n(%)

圖1　乳腺導管內癌伴早期微浸潤癌灶HER-2/neu基因擴增情況

圖2　乳腺導管內癌伴早期微浸潤癌灶HER-2/neu基因點狀擴增情況 (FISH,×1 000)

圖3　導管內HER-2/neu基因表達情況(FISH,×1 000)

A：HER-2/neu基因顯示簇狀擴增(橘紅色信號)，17號染色體多倍體，簇狀表達(綠色信號)；B：導管內HER-2/neu基因顯示簇狀擴增，17號染色體二倍體

3討論

約20%～25%的乳腺癌患者呈HER-2/neu過表達或基因擴增，其生物學行為惡性度高，預后不良。隨著分子生物學的迅速發(fā)展，對原癌基因HER-2/neu的研究及其相關治療已越來越受到重視[6]。本研究采用熒光原位免疫雜交的方法檢測了存檔案的92例乳腺癌石蠟包埋組織標本，其中單純導管原位癌9例，導管內癌伴早期微浸潤83例。

結果發(fā)現(xiàn)在導管內癌伴早期微浸潤癌灶中，導管旁微浸潤病灶中HER-2/neu的表達與同一病例中導管內成份較一致。所有導管內癌伴微浸潤的擴增病例中，微浸潤癌灶絕大多數(shù)(49/51,96.1%)與導管內癌同時擴增。微浸潤癌灶未擴增的2例病例表現(xiàn)為導管內癌成分大部分未擴增，小部分擴增。未發(fā)現(xiàn)微浸潤癌灶HER-2/neu基因單獨擴增的情況，即導管內癌組織成份HER-2/neu基因擴增的生物學行為可能早于微浸潤癌灶，且與Latta等[6]發(fā)現(xiàn)結果一致，HER-2/neu基因在導管原位癌中的表達高于導管旁微浸潤癌灶中的表達(本實驗未觀察到顯著統(tǒng)計學差異)，理論上微浸潤癌灶應具有惡性程度高及侵襲性高的特征，但微浸潤癌灶的HER-2/neu基因較導管原位癌表達低的原因，HER-2/neu原癌基因在乳腺導管原位癌發(fā)展至浸潤癌過程中的生物學行為尚需進一步臨床及基礎研究的證據(jù)。

導管原位癌，特別是高級別導管原位癌中HER-2/neu的過表達和擴增比率較高(50%～60%)，本研究中導管原位癌中HER-2/neu擴增比率為33.3%，可能原因為本研究統(tǒng)計樣本源為我院某時間段庫存單純導管原位癌，且只有9例，臨床上這種病例并不常見，大多伴有微浸潤成分。但研究發(fā)現(xiàn)單純導管原位癌中擴增病例的HER-2/neu基因的平均擴增率較導管內癌伴早期微浸潤病例的HER-2/neu基因擴增率高，由于樣本量(單純導管原位癌9例)原因，未作統(tǒng)計分析。

HER-2/neu 基因過度表達的乳腺癌惡性程度高，復發(fā)和轉移發(fā)生早，預后差，對某些化療藥物有抵抗，且患者的無病生存和總生存期短。HER-2/neu基因作為獨立預后指標，對于乳腺癌的預后評價及指導治療有極其重要的價值。HER-2/neu過表達型乳腺癌有其特殊的生物學特性，在乳腺癌的4個分子亞型中 HER-2/neu 過表達型乳腺癌腫瘤細胞侵襲力強，容易發(fā)生轉移，惡性程度高。

本研究中，除了觀察導管原位癌伴或不伴早期微浸潤的病例，研究者還同時觀察了其余病理類型HER-2/neu基因的擴增情況，結果如下：浸潤性導管癌伴導管內癌22例(浸潤性導管癌占大多數(shù)，伴導管內癌成分，腫塊直徑0.6～9.0 cm)，導管內癌伴浸潤性導管癌7例(導管內癌占大多數(shù)，伴浸潤癌成分，直徑2～5 mm)，均未見淋巴結轉移；小葉原位癌6例(其中1例為導管原位癌與小葉原位癌并存，未見淋巴結轉移)，浸潤性小葉癌41例(大多為浸潤性小葉癌伴浸潤性導管癌)，腫塊直徑0.9～6.5 cm，可見前哨淋巴結轉移，轉移率為23.08%。22例浸潤性導管癌為主伴導管內癌中7例HER-2/neu基因擴增，擴增率為31.81%。7例導管內癌為主伴浸潤性導管癌中3例HER-2/neu基因擴增，擴增率為42.86%。研究發(fā)現(xiàn)小葉原位癌HER-2/neu表達普遍低于導管內癌的HER-2/neu表達，且多為陰性表達，故無足夠FISH數(shù)據(jù)驗證HER-2/neu基因擴增。浸潤性小葉癌HER-2/

neu蛋白表達低于浸潤性導管癌中的表達，且前者的HER-2/neu蛋白的表達多集中在0～+之間。小葉癌中HER-2/neu蛋白表達的低相關性是否與其高侵襲浸潤的生物學行為表現(xiàn)(如小葉癌E鈣黏素的低表達和高淋巴結轉移率)不一致尚需進一步探討。

本研究中關于HER-2/neu在導管內癌伴或不伴微浸潤組織中的FISH研究將幫助確認臨床難以診斷的疑似微浸潤的部位，以指導臨床治療。HER-2/neu基因在乳腺導管原位癌中及其伴早期微浸潤癌灶中的擴增的評價可能幫助識別存在進一步惡變潛能的原位癌，并為赫賽汀預防干預治療提供潛在的分子靶標。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.05.002

[中圖分類號]R737.9；R730.23

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5412(2015)05-0372-05

(收稿日期：2015-06-13)

Role of HER2/neu Amplification in the Pure Ductal
Carcinoma in Situ and Micro Invasive Ductal Carcinoma of the Breast

Wu Xiaocui1,Chen Renyin2,Zhang Lan2,Meng Hui2

(1.DepartmentofRadiotherapy,HenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003,China;

2.DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the HER2/neu gene amplification in pure ductal carcinoma in situ and micro invasive ductal carcinoma of the breast and the clinical significance.MethodsThe HER2/neu gene amplification in the 168 cases of breast cancer were detected by using FISH technology.ResultsPure ductal carcinoma in situ,micro invasive of ductal carcinoma in situ,invasive ductal carcinoma,lobular carcinoma in situ,invasive lobular carcinoma were 9,83,29,6,41 cases,respectively.The HER-2/neu amplification ratios were 66.7% (6/9) in pure ductal carcinoma in situ,61.4% (51/83) in micro invasive of ductal carcinoma in situ,34.5% (10/29) in invasive ductal carcinoma,0.0% (0/6) in lobular carcinoma in situ,12.2% (5/41) in invasive lobular carcinoma.ConclusionHER-2/neu gene amplification has no significant differences between pure ductal carcinoma in situ and micro invasive lesions;HER-2/neu expressions in pure ductal carcinoma in situ and micro invasive lesions are consentaneous in most samples.HER-2/neu gene amplification ratio was higher in ductal carcinoma than lobular cases.

[Key words]breast cancer;HER-2/neu;ductal carcinoma in situ;micro invasive