舒芬太尼后處理對糖尿病和非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其與PI3K/Akt通路的關系

秦詠詠，王建剛，田首元，曾麗紅，任強

摘要：目的探討舒芬太尼后處理對糖尿病和非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其與磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)通路的關系。方法健康雄性SD大鼠，體重160 g～180 g，采用腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg的方法制備糖尿病模型，取造模成功的大鼠24只，飼養(yǎng)2周后，采用隨機數(shù)字表法，將其隨機分為4組(每組6只)：糖尿病假手術組(DM-S組)、糖尿病缺血再灌注組(DM-I/R組)、糖尿病舒芬太尼后處理組(DM-SP組)和糖尿病舒芬太尼后處理+Wortmannin組(DM-SP+W組)。另取健康的正常SD大鼠24只，體重250 g～300 g，采用隨機數(shù)字表法，將其隨機分為4組(每組6只)：非糖尿病假手術組(NDM-S組)、非糖尿病缺血再灌注組(NDM-I/R組)、非糖尿病舒芬太尼后處理組(NDM-SP組)和非糖尿病舒芬太尼后處理+Wortmannin組(NDM-SP+W組)。采用結扎左冠狀動脈前降支30 min，再灌注120 min的方法制備心肌缺血再灌注模型。S組只穿線不結扎，SP組和SP+W組于再灌注前5 min經(jīng)舌下靜脈注射舒芬太尼1.0 μg/kg，SP+W組在注射舒芬太尼前注射PI3K抑制劑Wortmannin15 μg/kg。再灌注120 min時取血樣，測定乳酸脫氫酶(LDH)的活性；處死大鼠后，取心臟，采用TUNEL法測心肌細胞凋亡指數(shù)(AI)；另取心臟，測心肌梗死范圍；采用Western blot法檢測心肌組織Akt、p-Akt的表達水平。結果與S組比較，糖尿病和非糖尿病大鼠的IR組、SP組和SP+W組LDH活性升高、AI增加、心肌梗死范圍增大、p-Akt/Akt的比值略增大(P<0.05)；與I/R組比較，非糖尿病大鼠SP組LDH活性降低、AI減少、心肌梗死范圍減小、p-Akt/Akt的比值增加(P<0.05)，SP+W組上述指標差異無統(tǒng)計學意義；與I/R組比較，糖尿病大鼠SP組和SP+W組上述指標差異無統(tǒng)計學意義。結論舒芬太尼后處理可通過激活PI3K/Akt通路減輕非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷，而糖尿病因素可消除舒芬太尼后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

關鍵詞：糖尿病；舒芬太尼；后處理；磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶；心肌再灌注損傷

中圖分類號：R587R285

通訊作者：王建剛，E-mail：wjg80_2008@163.com

收稿日期：(2014-09-12)

The Role of Sufentanil Postconditioning in Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Diabetic and Non-diabetic Rats and with the PI3K-AKT Signal Pathway

Qin Yongyong，Wang Jiangang，Tian Shouyuan，Zeng Lihong，Ren Qiang

First Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

Corresponding Author：Wang Jiangang

Abstract：ObjectiveTo investigate the role of sufentanil postconditioning in myocardial ischemia-reperfusion injury in diabetic and non-diabetic rats and retation with the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-AKT signal pathway.MethodsHealthy male Sprague Dawley (SD) rats weighing 160-180 g were used in this study.Diabetes mellitus was established by intraperitoneal streptozotocin 35 mg/kg and was confirmed by blood glucose≥16.7 mmol/L.Two weeks after diabetes mellitus was induced，24 rats were randomly divided into 4 groups(n=6 each)：diabetic mellitus sham operation group(group DM-S)，diabetic mellitus ischemia-reperfusion group(group DM-IR)，diabetic mellitus sufentanil postconditioning group (group DM-SP)and diabetic mellitus sufentanil postconditioning+Wortmannin group(group DM-SP+W).Another 30 nondiabetic mellitus rats were also randomly divided into 4 group ( n=6 each)：nondiabetic mellitus sham operation group (group NDM-S)，nondiabetic mellitus ischemia-reperfusion group(group NDM-IR)，nondiabetic mellitus sufentanil postconditioning group (group NDM-SP)and nondiabetic mellitus sufentanil postconditioning+Wortmannin group(group NDM-SP+W).Myocardial ischemia-reperfusion was induced by 30 min occlusion of left anterior descending branch of coronary artery followed by 120 min reperfusion.Group S was not helgated.Sufentanil postconditioning was induced by injection of sufentanil 3.0 μg/kg at 5 min before reperfusion.Group SP+W was induced by injection of Wortmannin(P13K inhibitor)15ug/kg before sufentanil.Arterial blood samples were collected at 120 min of reperfusion for measurement of plasma lactate dehydrogenase(LDH)activities and measurement apoptosis index(AI) and myocardial infarction rang was calculated .The expression of Akt and phosphorylated Akt(p-Akt)was determined by Western blotting.ResultsCompared with group S，LDH activities and cardiomyocyte apoptosis and myocardial infarction rang increased，and p-Akt/Akt up-regulated during myocardial ischemia reperfusion in group IR and group SP and group SP+W of diabetic and nondiabetic rats(P<0.05).Compared with group IR，LDH activities and cardiomyocyte apoptosis and myocardial infarction rang decreased and p-Akt/Akt up-regulated in nondiabetic rats(P<0.05). Conciusion Sufentanil postconditioning may attenuate cardiomyocyte apoptosis by IR injury in nondiabetic rat hearts through activating PI3K/Akt.Diabetes mellitus factor can negate sufentanil postconditioning induced protection against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.

Key words：diabetes mellitus；sufentanil；postconditioning；1-phosphatidlylinositol 3-kinase/protein-serine-threonine kinase；myocardial ischemia-reperfusion injury

糖尿病嚴重威脅人類健康，是心血管疾病患者并發(fā)心肌梗死的獨立危險因素[1]，減輕糖尿病患者的心肌缺血再灌注損傷在臨床上很重要。本實驗前期研究表明[2-4]，舒芬太尼后處理可以減輕非糖尿病大鼠心肌的缺血再灌注損傷，減少心肌細胞凋亡，機制可能與PI3K1AKT信號通路有關。但舒芬太尼后處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用，目前研究尚罕見。本實驗擬研究舒芬太尼后處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及機制。

作者單位：山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院(太原 030001)

1材料與方法

1.1實驗動物健康雄性SD大鼠，體重140 g～160 g，山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2造模方法參照文獻[4]提供的方法制備糖尿病模型。高糖高脂喂養(yǎng)4周后，腹腔注射鏈脲佐菌素(批號：905B0314，Solarbio公司)35 mg/kg，注射72 h后測空腹血糖≥16.7 mmol/L，并有多飲多食多尿視為模型制備成功，成模后繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng)2周實驗。

1.3實驗分組取造模成功的糖尿病大鼠24只，采用隨機數(shù)字表法，將其隨機分為4組(n=6)：糖尿病假手術組(DM-S組)、糖尿病缺血再灌注組(DM-I/R組)、糖尿病舒芬太尼后處理組(DM-SP組)和糖尿病舒芬太尼后處理+Wortmannin組(DM-SP+W組)。另取健康正常SD大鼠24只，采用隨機數(shù)字表法，將其隨機分為4組(每組6)：非糖尿病假手術組(NDM-S組)、非糖尿病缺血再灌注組(NDM-I/R組)、非糖尿病舒芬太尼后處理組(NDM-SP組)和非糖尿病舒芬太尼后處理+Wortmannin組(NDM-SP+W組)。

腹腔注射20%的烏拉坦5 ml/kg麻醉后。針狀電極插入左前肢、右前肢和右后肢皮下，連續(xù)監(jiān)測Ⅱ導聯(lián)心電圖。頸部正中切開氣管，插管后連接HX-300動物呼吸機行機械通氣，吸入氧濃度40%，調節(jié)呼吸頻率或潮氣量，維持pH值7.35～7.45、血二氧化碳分壓(PaCO2)(30～40)mm Hg(1 mmHg=0.133 kPa)、PaO2(90～150)mm Hg。于左側胸壁第3、4肋間距離胸骨左緣0.5 cm處開胸，暴露心臟，在動脈圓錐與左心耳之間冠狀靜脈主干處用7-0縫線結扎左冠狀動脈前降支，縫線末端穿入自制圈套管，平衡10 min，制備心肌缺血再灌注模型。以結扎左冠狀動脈前降支后，心電圖Ⅱ導聯(lián)ST段抬高0.1 mV或T波高聳，心肌顏色變暗紅色為結扎成功的標志；結扎30 min后松開結扎線，再灌注120 min，以缺血區(qū)心肌變紅，抬高的ST段或T波回落為再灌注成功的標志。S組只穿線不結扎左冠狀動脈前降支；SP組和SP+W組于再灌注前5 min經(jīng)舌下靜脈注射舒芬太尼(批號：1130902，宜昌人福醫(yī)藥有限責任公司)1.0 μg/kg，SP+W組在注射舒芬太尼前注射PI3K抑制劑渥曼青霉素Wortmannin(批號：LG10O14，北京百靈威科技有限公司)15 μg/kg[5]。實驗期間維持大鼠直腸溫36.5 ℃～37.5 ℃。

1.4血生化指標測定再灌注120 min時，取腹主動脈血樣2 mL，4℃3 500 r/min離心15 min，取上清液，用大鼠LDH檢測試劑盒(酶標儀法，南京建成生物工程研究所)檢測活性。

1.5心肌凋亡指數(shù)測定再灌注120 min時，取心尖組織，4%甲醛固定4 h以上，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，按TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明書進行操作。每張切片光鏡(400倍)下隨機選取5個高倍視野，計算凋亡指數(shù)(AI)，取5個視野的平均值。

1.6心肌梗死范圍測量將心肌從結扎線下切成5份，用0.125% NBT常溫染色15 min，非梗死區(qū)被染成藍色，梗死區(qū)呈灰白色。將梗死區(qū)心肌剪下，稱重，以梗死區(qū)心肌濕重占全心肌濕重的百分比表示心肌梗死的范圍。

1.7心肌Akt、p-Akt蛋白表達測定用BCA法進行蛋白定量。根據(jù)蛋白定量結果加入總蛋白樣品和上樣緩沖液，用電轉儀將凝膠上分離到的蛋白轉移到PVDF膜上，5%BCA封閉2 h，用兔抗鼠Akt和p-Akt單克隆抗體(稀釋度1∶10 000，ABCAM公司，美國)4℃孵育過夜，次日用HRP標記的羊抗兔二抗(稀釋度1∶5000，武漢博士德生物工程有限公司)孵育2 h，ECL發(fā)光液顯影。采用凝膠成像系統(tǒng)進行分析，以目的蛋白條帶灰度值和GAPDH條帶灰度值的比值反映Akt和p-Akt的表達。

2結果

非糖尿病大鼠飲食、進水和尿量均正常，毛色白且有光澤；糖尿病大鼠飲食、進水和尿量均明顯增加，毛色發(fā)黃且易脫落。與NDM-S組比較，NDM-I/R組、NDM-SP組和NDM-SP+W組血漿LDH活性升高、AI增加、心肌梗死范圍增大、p-Akt/Akt的比值略增大(P<0.05)；與NDM-I/R組比較，NDM-SP組血漿LDH活性降低、AI減少、心肌梗死范圍減小、p-Akt/Akt的比值增加(P<0.05)；NDM-SP+W組上述各指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與DM-S組比較，DM-I/R組、DM-SP組和DM-SP+W組血漿LDH活性升高、AI增加、心肌梗死范圍增大、p-Akt/Akt的比值略增大(P<0.05)；與DM-I/R組比較，DM-SP組和DM-SP+W組上述各指標差異無統(tǒng)計學意義；與NDM-SP組比較，DM-SP組血漿LDH活性、CK-MB濃度均升高(P<0.05)。詳見表1、表2。

表1　各組大鼠LDH、AI和心肌梗死范圍的比較( ±s)

表2　各組大鼠Akt、p-Akt和p-Akt/Akt的比較( ±s)

3討論

本研究采用高糖高脂飲食誘導大鼠胰島素抵抗，聯(lián)合腹腔鏈脲佐菌素(35 mg/kg)選擇性破壞部分胰島β細胞的方法建立糖尿病大鼠模型[4]。建模后大鼠血糖≥16.7 mmol/L，提示糖尿病模型制備成功；糖尿病并發(fā)心血管疾病與病程有關，因此本研究采用糖尿病模型制備成功后2周。

采用結扎左冠狀動脈前降支30 min，恢復灌注120 min的方法制備心肌缺血再灌注損傷模型[5]；并參照文獻[2]及預實驗結果確定舒芬太尼后處理給藥時機和劑量。本研究結果表明，與S組相比，非糖尿病和糖尿病大鼠再灌注120 min時IR組LDH活性和心肌細胞凋亡指數(shù)增加，表明大鼠在體心肌缺血再灌注損傷模型制備成功。而舒芬太尼后處理可明顯減輕非糖尿病大鼠心肌細胞凋亡和心肌梗死范圍，糖尿病大鼠的上述指標沒有減輕，表明舒芬太尼后處理對非糖尿病大鼠具有心肌保護作用，而對糖尿病大鼠沒有保護作用。Wortmannin的給藥時間及劑量均參照文獻[6]。

本研究結果表明，PI3K抑制劑Wortmannin可拮抗非糖尿病大鼠舒芬太尼后處理的心肌保護作用，提示舒芬太尼后處理可能通過激活PI3K/Akt通路抑制非糖尿病大鼠心肌細胞凋亡發(fā)揮心肌保護作用。PI3K可磷酸化肌醇環(huán)上的3位羥基，生成三磷酸磷脂酰肌醇，其可磷酸化激活Akt生成p-Akt，p-Akt，進一步磷酸化調控下游靶標如糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和凋亡蛋白等，參與細胞的分化和凋亡[7]。舒芬太尼后處理激活PI3K/Akt通路的具體機制尚有待進一步研究。

糖尿病大鼠給予舒芬太尼后處理，血漿LDH活性、AI和心肌梗死范圍未降低，p-Akt/Akt的比值也未改變，提示舒芬太尼后處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷沒有保護作用，PI3K-Akt通路不參與此過程。

Yadav等[8]研究表明，糖尿病因素可通過影響GSK-3β的磷酸化水平抑制缺血預處理的心肌保護作用。因此推斷糖尿病因素可能通過影響GSK-3β的磷酸化水平阻礙舒芬太尼心肌保護作用，有待進一步研究。

舒芬太尼后處理可通過激活PI3K/Akt通路減輕非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷，而糖尿病因素可消除舒芬太尼后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

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(本文編輯王雅潔)