作者單位：524001 湛江，廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所 廣東省衰老相關(guān)心腦血管疾病重點實驗室(李文，趙斌，馮杜)；524001 湛江,廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科(胡喆，楊玥)，神經(jīng)內(nèi)科(林智君，陳煜森，鐘望濤，林春霞)

miR-137對Parkin誘導(dǎo)的線粒體自噬的影響

李文胡喆林智君楊玥陳煜森鐘望濤林春霞趙斌馮杜

【摘要】目的探討miR-137對Parkin誘導(dǎo)的線粒體自噬的影響。方法將miR-137 mimics和miR-137 inhibitor分別轉(zhuǎn)染進(jìn)HeLa細(xì)胞8 h后，再轉(zhuǎn)染pEGEPC1-Parkin，24 h之后加羰基-氰-對-三氟甲氧基本腙(FCCP)處理4 h或者不加FCCP，利用免疫熒光和蛋白免疫印跡技術(shù)分析 miR-137對線粒體自噬的影響。用實時定量PCR方法檢測帕金森病患者與健康對照者血液樣本中miRNAs的表達(dá)情況。結(jié)果在FCCP作用下，Parkin的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞自噬分子LC3由LC3Ⅰ型變?yōu)長C3Ⅱ型，Parkin蛋白從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體。而細(xì)胞先經(jīng)外源過表達(dá)miR-137處理之后，Parkin引起的細(xì)胞自噬受到顯著抑制(P=0.003)。miR-137在帕金森病患者血液中的表達(dá)水平顯著高于健康對照組(P<0.001)。結(jié)論在FCCP作用下，miR-137抑制Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬。miR-137在帕金森病患者血液樣本中高表達(dá)，提示miR-137可能通過調(diào)控Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，參與帕金森病的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】miRNA；線粒體自噬；Parkin；帕金森?。霍驶?氰-對-三氟甲氧基本腙

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.05.003

基金項目:國家自然科學(xué)青年

通訊作者，馮杜， E-mail: feng-du@foxmail.com

收稿日期：(2014-11-27)

Effect of miR-137 on Parkin-induced mitophagyLiWen,HuZhe,LinZhijun,YangYue,ChenYusen,ZhongWangtao,LinChunxia,ZhaoBin,FengDu.DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege(InstituteofNeurology,GuangdongKeyLaboratoryofAge-relatedCardiac-cerebralVascularDisease),Zhanjiang524001,China

Correspondingauthor,FengDu,E-mail:feng-du@foxmail.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of miR-137 upon Parkin-induced mitophagy. Me-thodsmiR-137 mimics and inhibitors were transfected into Hela cells for 8 h. pEGFPC1-Parkin was then transfected for another 24 h. Hela cells were treated with or without carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) for 4 h before being harvested. Immunofluorescence and Western blot were used for detecting the effect of miR-137 on mitophagy. Expression of miRNAs in blood sample from patients with Parkinson’s disease (PD) and healthy donors were measured with Real-time quantitative PCR. ResultsUnder the intervention of FCCP, the expressed Parkin promoted the conversion of LC3Ⅰ into LC3Ⅱ and translocated the Parkin protein from cytoplasm to mitochondria. After in vitro cell treatment with over-expressed miR-137, Parkin-induced mitophagy was significantly inhibited (P=0.003). The expression of miR-137 in the blood of PD patients was significantly higher than that of normal controls (P<0.001). ConclusionsmiR-137 could suppress Parkin-mediated mitophagy in the presence of FCCP. The high expression level of miR-137 in PD patients indicates that miR-137 may be involved in the incidence of PD via regulating Parkin-mediated mitophagy.

【Key words】miRNA; Mitophagy; Parkin; Parkinson disease;

Carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone

miRNA是一類非編碼小RNA分子，大量研究表明，miRNA在發(fā)育、分化、細(xì)胞增殖與調(diào)亡、激素分泌、腫瘤形成以及神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生過程中起重要作用[1-3]。miRNA可參與調(diào)控細(xì)胞自噬，可通過相關(guān)的自噬途徑調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的正常自噬水平及其存活、抑制低氧誘導(dǎo)的線粒體自噬，例如miR-137通過抑制線粒體自噬受體FUNDC1和NIX的表達(dá)進(jìn)而抑制低氧誘導(dǎo)的線粒體自噬[4-6]。帕金森病是一種慢性神經(jīng)退行性疾病， Parkin編碼基因的突變是常染色體隱性帕金森病的主要病因，其表達(dá)產(chǎn)物Parkin是一個E3泛素連接酶，其通過泛素蛋白酶體途徑降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)。Parkin突變后，E3酶活性喪失，不能降解一些錯誤折疊或者未折疊的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致具有細(xì)胞毒性的底物在細(xì)胞內(nèi)大量堆積，從而引起細(xì)胞死亡。除此之外，Parkin能抑制凋亡應(yīng)激活化的蛋白激酶途徑，對黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元有保護(hù)作用，還可通過減弱微管相關(guān)蛋白激酶的活性，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受微管解聚劑的影響[7-8]。

在正常條件下，Parkin絕大部分定位于胞質(zhì)。在線粒體去極化劑羰基-氰-對-三氟甲氧基本腙(FCCP)處理下，Parkin從細(xì)胞質(zhì)中遷移到線粒體中，并激活自噬以清除受損的線粒體[9]。線粒體自噬對于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能的維持十分重要。神經(jīng)細(xì)胞依賴于自噬來控制蛋白的質(zhì)量并且移除損傷的線粒體。Parkin對于維持線粒體的正常功能至關(guān)重要，線粒體功能的喪失可能在帕金森病的發(fā)生中起著重要作用[10-11]。本文通過研究miR-137對Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的影響，以及比較帕金森病患者與對照組血液樣本中miR-137的表達(dá)情況，探討帕金森病的發(fā)病機(jī)制。

材料與方法

一、材料來源

選用2013年1月至2014年1月在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的確診為帕金森病的26例患者 [男15例、女11例，年齡(62±8)歲]及同期在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診體檢的26名健康對照者[男15名、女11名，年齡(60±9)歲]的血液樣本(空腹12～14 h，取血3 ml)。帕金森病患者及健康對照者的一般資料具可比性，P均>0.05。健康對照者否認(rèn)有家族性及遺傳性帕金森病。本研究經(jīng)廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均知情同意。

二、主要試劑

HeLa細(xì)胞為本實驗室保存細(xì)胞株，培養(yǎng)基和血清均購自Hyclone公司，胰酶、細(xì)胞消化液、雙抗、抗熒光淬滅液購自碧云天公司。Trizol(Life Technology，15596-026)，DNA酶I(包含10×反應(yīng)緩沖液和氯化鎂)，pEGFPC1-Parkin由本實驗室構(gòu)建。線粒體內(nèi)膜易位酶(TIM23)抗體 (BD Biosciences，611222)，線粒體外膜受體(TOM20)抗體 (BD Biosciences，612278)，LC3B 多克隆抗體 (Sigma，L7543)，電壓依賴性電離子通道(VDAC1) 單克隆抗體 (Abcam，ab14734)，Tubulin 單克隆抗體 (Earthox，E021040)，綠色熒光蛋白抗體(Santa Cruz，sc-9996)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 (Earthox，E030110)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G (Earthox，E030120) 用于蛋白免疫印跡檢測。Alexa fluor 555 標(biāo)記的驢抗小鼠免疫球蛋白G(Life Technologies，A31570) 用于免疫熒光檢測。

三、主要方法

1.實時定量PCR檢測相關(guān)miRNAs的表達(dá)

用實時定量PCR檢測受試者血液樣本中的10個已被報道的與帕金森病發(fā)病相關(guān)的miRNAs的表達(dá)情況(包括miR-137、miR-34b和miR-34c等)。實驗操作步驟均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，具體方法為：先用Trizol法提取全血總RNA，然后行RNA樣本的基因組DNA降解和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR試劑盒(TaKaRa，RR716)檢測U6和miRNAs的表達(dá)。所有被檢測的miRNAs引物和U6引物均訂自廣州銳博公司，檢測儀器為ROCHE LightCycler480Ⅱ?qū)崟r定量PCR系統(tǒng)，用2-△△CT法計算結(jié)果。

2. 在不同處理條件下，用免疫熒光檢測Hela細(xì)胞發(fā)生自噬的情況

準(zhǔn)備3個放有方玻片的35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，接種Hela細(xì)胞于上述培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞完全鋪展開至密度達(dá)到80%時分別作如下處理：第1組(MOCK組)為空白對照，不做任何處理；第2組(FCCP組)用FCCP(終濃度為20 μm)處理4 h；第3組(Parkin+FCCP組)轉(zhuǎn)染pEGFPC1-Parkin 24 h后，再用FCCP(終濃度為20 μm)處理4 h，收集細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測，用Tom20抗體標(biāo)記線粒體，于熒光顯微鏡下觀察FCCP對Parkin轉(zhuǎn)位的影響。

準(zhǔn)備1個放有方玻片的6孔板，將Hela細(xì)胞接種于上述6孔板中，待細(xì)胞完全鋪展開密度達(dá)到80%時做轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時分組如下：第1排和第2排的3個孔都分別轉(zhuǎn)染scramble NC(NC)、 miR-137 mimics(137)、miR-137 inhibitor(in-137)，轉(zhuǎn)染8 h后，再轉(zhuǎn)染pEGFPC1-Parkin于上述6個孔中。轉(zhuǎn)染24 h后，第1排的3個孔用FCCP(終濃度為20 μm)處理4 h，第2排的3個孔不用FCCP處理，作為對照。以上6組分別記為：Parkin+NC+FCCP組、Parkin+ 137+FCCP組、Parkin+ in-137+FCCP組、Parkin+ NC組、Parkin+137組、Parkin+ in-137組。上述處理結(jié)束后，用4%甲醛固定細(xì)胞30 min，用磷酸鹽緩沖液洗4次，每次5 min。0.1% Triton X-100(溶于磷酸鹽緩沖液)打孔10～15 min，1%牛血清白蛋白 (溶于磷酸鹽緩沖液)封閉30 min，Tom20抗體室溫孵育1 h，磷酸鹽緩沖液洗4次，熒光二抗Alexa fluor 555 標(biāo)記的驢抗小鼠免疫球蛋白G室溫孵育1 h，磷酸鹽緩沖液洗4次，抗熒光淬滅液封片。用TCS SPF5 II Leica 共聚焦顯微鏡拍照，免疫熒光檢測結(jié)果的分析參照文獻(xiàn)[12-13]。

3. 蛋白免疫印跡檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

蛋白免疫印跡檢測的細(xì)胞分組與上述免疫熒光檢測6孔板的分組操作一致，其后收集細(xì)胞，細(xì)胞加入裂解液冰上裂解30 min，測蛋白濃度，于100℃加入6×上樣緩沖液煮樣10 min。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V轉(zhuǎn)膜120 min，5%脫脂牛奶(溶于磷酸鹽緩沖液)室溫封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗于4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液洗4次，每次10 min。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，磷酸鹽緩沖液洗4次，每次10 min。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白FUNDC1、NIX、Tom20、Tim23、VDAC1、LC3等的表達(dá)情況，免疫印跡檢測結(jié)果分析參照文獻(xiàn)[14]。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。在FCCP作用下，miR-137抑制Parkin誘導(dǎo)的線粒體自噬的統(tǒng)計結(jié)果先行總體方差分析，總體有差異后，兩兩比較采用LSD-t檢驗；健康對照者與帕金森病患者血液中miRNAs的表達(dá)情況比較行獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、miR-137抑制Parkin誘導(dǎo)的線粒體自噬結(jié)果

在MOCK組或者在FCCP單獨作用下，未見大規(guī)模線粒體自噬性降解，而FCCP+Parkin組中，pEGFPC1-Parkin+(陽性轉(zhuǎn)染)細(xì)胞則發(fā)生明顯的線粒體自噬(圖1A)。Parkin本身不會影響線粒體自噬，Parkin只有在FCCP作用下才向線粒體轉(zhuǎn)位(圖1B)。在Parkin+137+FCCP組中，miR-137能顯著抑制Parkin的轉(zhuǎn)位，因而抑制Parkin誘導(dǎo)的線粒體自噬；相反，在Parkin+in-137+FCCP組中，in-137則增強(qiáng)Parkin的轉(zhuǎn)位，加劇Parkin誘導(dǎo)的線粒體自噬(圖1B)。隨機(jī)挑選了每個處理樣本的9個拍照視野，并統(tǒng)計了發(fā)生線粒體自噬的細(xì)胞數(shù)目，見圖1D。與Parkin+ NC+FCCP組相比，Parkin+137+FCCP組中pEGFPC1-Parkin+細(xì)胞發(fā)生Parkin轉(zhuǎn)位的細(xì)胞數(shù)目減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)。與Parkin+137+FCCP組相比，Parkin+in-137+FCCP組中pEGFPC1-Parkin+細(xì)胞發(fā)生Parkin轉(zhuǎn)位的細(xì)胞數(shù)目增多，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。其余各組間pEGFPC1-Parkin+細(xì)胞發(fā)生Parkin轉(zhuǎn)位的細(xì)胞數(shù)相互比較的數(shù)據(jù)見表1。在Parkin+137+FCCP組中，miR-137的瞬時過表達(dá)能顯著抑制線粒體蛋白如Tom20、Tim23、VDAC1的降解，并且抑制了LC3Ⅰ型向LC3Ⅱ型的轉(zhuǎn)換。相反，抑制內(nèi)源miR-137的表達(dá)之后(Parkin+ in-137+FCCP組)，Tom20、Tim23、VDAC1的表達(dá)明顯減少，伴隨LC3Ⅰ型向LC3Ⅱ型的轉(zhuǎn)換增多(圖1C)。

表1

各組間pEGFPC1-Parkin +

注：a與①比較，b與②比較，c與④比較

二、帕金森病患者與健康對照者miRNAs表達(dá)譜分析

與其它9個miRNAs相比，miR-137在帕金森病患者血液中的表達(dá)水平顯著高于健康對照者(P<0.001，圖2)。且miR-34b、miR-34c和miR-133b等9個已被報道的與帕金森病相關(guān)的miRNAs的檢測結(jié)果均與文獻(xiàn)報道相似[4-6]。各組之間相互比較的數(shù)據(jù)見表2。

討論

由于客觀原因，要獲得帕金森病患者的腦組織較為困難(不像腫瘤組織那樣可以通過手術(shù)獲得)，因此筆者選擇了帕金森病患者的外周血作為受試樣本。目前，已有通過檢測血液樣本進(jìn)行帕金森病相關(guān)研究的報道。Pihlstr?m等[15]用帕金森病患者和正常人共72例的血液樣本(各36例)以及24例的大腦皮層樣本(各12例)檢測SNCA基因的單核苷酸多態(tài)性，SNCA mRNA的表達(dá)水平以及SNCA第1個外顯子的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)腦組織中SNCA的甲基化方式與血液中SNCA的甲基化方式一致[15]。Potashkin等[16]取早期帕金森病患者、神經(jīng)退行性疾病患者和正常人的外周血樣本行mRNA芯片檢測，旨在發(fā)現(xiàn)早期帕金森病患者與正常人外周血中mRNA表達(dá)的差異。參考上述經(jīng)驗，本研究采用外周血細(xì)胞作為研究帕金森病的樣本是可行的。

圖1　miR-137抑制Parkin誘導(dǎo)的線粒體自噬

A:可見Parkin+FCCP 組中的pEGFPC1-Parkin+細(xì)胞(綠色)發(fā)生了線粒體自噬現(xiàn)象，Parkin由胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體，與線粒體標(biāo)記蛋白Tom20(紅色)形成了定位(白色箭頭)，MOCK組與FCCP組未見此現(xiàn)象。B:FCCP作用的各組中，與in-137組相反，在miR-137作用下，pEGFPC1-Parkin+細(xì)胞的線粒體自噬現(xiàn)象減少，比例尺20 μm。C:蛋白免疫印跡檢測，條帶下方數(shù)字是相對應(yīng)的灰度分析結(jié)果。D:pEGFPC1-Parkin+細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬的統(tǒng)計圖，Parkin+NC+FCCP組與Parkin+137+FCCP組比較，**P<0.01；Parkin+137+FCCP組與Parkin+in-137+FCCP組比較，***P<0.001

圖2帕金森病患者及健康對照者

血液中miRNAs表達(dá)譜分析

黑色：帕金森病患者；灰色：健康對照者，***為P<0.001

表2

帕金森病患者與健康對照者

注：A=健康對照者miRNA/健康對照者miR-137

miRNA 與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病密切相關(guān)。miR-7和miR-153能在轉(zhuǎn)錄水平負(fù)調(diào)控α-突觸核蛋白[17-18]。運用生物芯片技術(shù)，在帕金森病患者以及帕金森病小鼠模型的中腦中均檢測到miR-133b的表達(dá)減少。此外，芯片測序結(jié)果顯示，帕金森病患者的腦病變區(qū)域(包括額葉皮質(zhì)、杏仁核、黑質(zhì)和小腦)中miR-34b/34c的表達(dá)均下調(diào)，與本文在血液標(biāo)本中的檢測結(jié)果一致[19]。有研究顯示，F(xiàn)GF20 mRNA 3’UTR存在多態(tài)性位點rs12720208，而miR-433正好結(jié)合在該區(qū)域，在neuro2a神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中過表達(dá)miR-433，將抑制C等位基因的表達(dá)，而與帕金森病相關(guān)的T等位基因則不受影響[20]。LRRK2基因突變與帕金森病的發(fā)生相關(guān)，外源過表達(dá)let-7或miR-184，將減弱LRRK2帶來的病理性損傷[21]。miR-137在腦中的高表達(dá)對于胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分化至關(guān)重要[22]。Mind Bomb-1是神經(jīng)發(fā)育過程中重要的泛素連接酶，miR-137通過調(diào)節(jié)其表達(dá)來調(diào)節(jié)神經(jīng)元的成熟[23]。但是，在帕金森病患者中，miR-137作用的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

miR-137能通過抑制線粒體自噬受體FUNDC1和NIX的表達(dá)，調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)的線粒體自噬[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)，NIX是Parkin移位至線粒體的關(guān)鍵成分[24]。本研究在既往的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入探索了miR-137對于Parkin/FCCP通路誘導(dǎo)的自噬的影響。結(jié)果表明，在FCCP作用下，miR-137能抑制Parkin從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體，并抑制了線粒體蛋白如Tom20、Tim23、VDAC1的降解以及LC3Ⅰ型向LC3Ⅱ型的轉(zhuǎn)換，因而減弱了線粒體自噬程度。

miR-137在帕金森病患者血液中的表達(dá)顯著高于對照組，因此我們推測，miR-137能抑制Parkin誘導(dǎo)的線粒體自噬，miR-137表達(dá)高，則Parkin誘導(dǎo)的線粒體自噬水平低，而細(xì)胞內(nèi)低水平的自噬恰好是帕金森病的誘因之一[10-11]。綜上所述，對Parkin的進(jìn)一步研究，尤其是對其作用方式和功能的研究，將有助于闡明帕金森病的發(fā)病機(jī)制，為帕金森病的治療提供新的策略。

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(本文編輯：洪悅民)

基礎(chǔ)研究論著