張世坤

不同方法在強(qiáng)直性脊柱炎患者HLA-B27檢測(cè)中的比較

張世坤

目的探討聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-直接測(cè)序(PCR-SBT)法與磁珠酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(IMSELISA)法檢測(cè)人類白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)在強(qiáng)直性脊柱炎(AS)患者臨床診斷中的價(jià)值。方法采用上述兩種方法對(duì)150例AS患者進(jìn)行外周靜脈血HLA-B27檢測(cè),比較兩種方法檢測(cè)HLA-B27陽(yáng)性率等。結(jié)果PCR-SBT的HLA-B27陽(yáng)性檢出率為49.33%(74/150),而IMS-ELISA的HLA-B27陽(yáng)性檢出率為36.67% (55/150),兩種檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.36,P=0.027＜0.05)。結(jié)論P(yáng)CR-SBT法更適合用于AS患者的臨床診斷。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-直接測(cè)序法；磁珠酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法；人類白細(xì)胞抗原B27；強(qiáng)直性脊柱炎

HLA-B27是人體白細(xì)胞抗原HLA-B位點(diǎn)之中的一個(gè)位點(diǎn)［1］。HLA是人類主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)的表達(dá)產(chǎn)物,在免疫系統(tǒng)中主要負(fù)責(zé)細(xì)胞之間的相互識(shí)別和誘導(dǎo)免疫反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能,其中HLA-B屬于Ⅰ型MHC基因表達(dá)的抗原［2］。有研究發(fā)現(xiàn)［3］HLA-B27表達(dá)與強(qiáng)直性脊柱炎高度相關(guān),而強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)生率與HLA-B27的陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān),90%以上的強(qiáng)直性脊柱炎患者的HLA-B27抗原呈陽(yáng)性表達(dá)。本文比較不同檢測(cè)方法在強(qiáng)直性脊柱炎診斷中的具體臨床意義,報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年4月～2016年2月本院接診150例AS門診及住院患者,AS患者的診斷均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)制定的最新的AS的分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。其中男121例,女29例,年齡15～53歲,平均年齡(39.2±16.7)歲。

1.2 方法 所選研究對(duì)象均空腹采集外周靜脈血(空腹＞10 h) 4ml,采用紫色EDTA無(wú)抗凝管。然后分別用PCR-SBT法與IMS-ELISA法對(duì)患者外周血HLA-B27的表達(dá)和基因進(jìn)行檢測(cè),并比較兩種方法的陽(yáng)性率、敏感度和特異性等。

1.2.1 儀器設(shè)備與試劑 采用美國(guó)Molecular Devices公司生產(chǎn)的多功能酶標(biāo)儀SpectraMaxM5/M5e,上海求精生化試劑儀器有限公司生產(chǎn)的高精度微量移液器,日本日立公司生產(chǎn)的U-2001紫外分光光度儀,德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)的PCR儀,北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)的DYY-Ⅲ型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀以及美國(guó)伯樂(lè)公司生產(chǎn)的Gel Doc XR凝膠成像分析儀。試劑分別采用貝克曼庫(kù)爾特有限公司生產(chǎn)的HLA-B27磁酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒,上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TRNzolA＋總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、MarkerⅠ。

1.2.2 外周血HLA-B27基因表達(dá)檢測(cè) 嚴(yán)格按照PCR-SBT法檢測(cè)外周血HLA-B27的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,①先用微量移液器取250 μl EDTA抗凝的外周血進(jìn)行總RNA的提取,用分光光度計(jì)測(cè)定并調(diào)RNA濃度(ng/μl),并將總RNA提取液保存于-80℃?zhèn)溆谩＂趯⒖俁NA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物設(shè)計(jì)由上海sangong公司完成,上游引物：5'-GGTCCAAGACGAGGAGGTTC-3',下游引物：5'-CGTGGGACAGGAGGAATTAG-3',預(yù)期目的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為177 bp。③待PCR擴(kuò)增結(jié)束后,用微量移液器取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。④用凝膠成像系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物的目的片段是否在目標(biāo)位置。⑤取PCR結(jié)果進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 外周血HLA-B27檢測(cè) 嚴(yán)格按照IMS-ELISA法檢測(cè)外周血HLA-B27的試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,加稀釋過(guò)的CD45-HRPO結(jié)合體50 μl于微孔中,再分別加陰陽(yáng)對(duì)照及血樣各50 μl于微孔中,室溫下孵育10min,然后洗板5次,再加顯色液,用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值,OD值＜0.4者為HLA-B27抗原檢測(cè)陰性,OD值≥0.4者為HLA-B27抗原檢測(cè)陽(yáng)性［5］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)；敏感度和特異性采用ROC曲線分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

150例研究對(duì)象中,PCR-SBT法的HLA-B27陽(yáng)性檢出率為49.33%(74/150),而IMS-ELISA法的HLA-B27陽(yáng)性檢出率為36.67%(55/150),兩種檢測(cè)陽(yáng)性檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.36,P=0.027＜0.05)。PCR-SBT法檢測(cè)AS的敏感度和特異性分別為97.33%和96.67%,而IMS-ELISA法檢測(cè)AS的敏感度和特異性分別為69.67%和76.33%,兩種方法的ROC曲線下面積分別為0.952和0.816,說(shuō)明PCR-SBT法在檢測(cè)HLA-B27及診斷AS方面的價(jià)值高于IMS-ELISA。

3 討論

1963年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ARA)將AS與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病區(qū)分開(kāi),以AS來(lái)代替原來(lái)的類風(fēng)濕性脊柱炎。AS可累及任何關(guān)節(jié),但以脊柱關(guān)節(jié)受累為多,發(fā)病年齡多為15～30歲且男性居多,一般情況下男女比例為10:1左右,目前對(duì)于男女AS患病率的差異尚無(wú)確切解釋。目前關(guān)于AS的發(fā)病機(jī)理及病因尚未完全闡明,雖然有可能與遺傳、感染、免疫、環(huán)境等因素有關(guān),但尚無(wú)確切解釋。HLA-B27在AS的整個(gè)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都起著一定的作用,HLA-B27與AS在遺傳上具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。HLA-B27檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性的AS患者,其強(qiáng)直性脊柱炎的臨床癥狀及體征要比HLA-B27檢測(cè)結(jié)果顯示陰性的AS患者出現(xiàn)的早,因此探索更加敏感及具有特異性的HLA-B27檢測(cè)方法對(duì)于AS的早期診斷及早期治療具有很重要的意義。本研究顯示PCR-SBT法陽(yáng)性檢出率更高,說(shuō)明其更適合用于AS患者臨床診斷。

［1］洪俊,張平安,李艷.強(qiáng)直性脊柱炎患者人類白細(xì)胞抗原B27三種檢測(cè)方法的對(duì)比.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2006,21(1):1-4.

［2］王佳佳.HCV基因型分布及HLA-DP基因多態(tài)性與高危人群HCV感染轉(zhuǎn)歸的關(guān)系.南京醫(yī)科大學(xué),2014.

［3］吳麗娟,李茂圓,劉霞.外周血淋巴細(xì)胞HLA-B27表達(dá)強(qiáng)度與強(qiáng)直性脊柱炎臨床分期的關(guān)系.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2014(21): 2971-2973.

［4］Raychaudhuri SP,Deodhar A.The classification and diagnostic criteria of ankylosing spondylitis.Journal of Autoimmunity,2014,48(2):128-133.

［5］王平均,孫靈迪,梅傳忠.聚合酶鏈反應(yīng)-直接測(cè)序法在強(qiáng)直性脊柱炎患者 HLA-B27檢測(cè)中的應(yīng)用.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2015(11): 1898-1900.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.13.022

2016-04-11］

454000 焦煤集團(tuán)中央醫(yī)院檢驗(yàn)科