宋輝，南志標(biāo)，田沛

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

中國(guó)西北地區(qū)披堿草屬植物所帶內(nèi)生真菌的培養(yǎng)特征

宋輝，南志標(biāo)*，田沛

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

摘要：內(nèi)生真菌與植物所形成的共生體普遍存在于冷季禾草中，共生體有利于提高宿主植物的生物和非生物抗性。雖然目前研究者們已對(duì)禾草內(nèi)生真菌做了大量的研究，但是尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)分布于中國(guó)西北地區(qū)披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌培養(yǎng)特征的研究。本研究從中國(guó)西北地區(qū)分離出15株來(lái)自不同地理種群披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌。通過(guò)分離培養(yǎng)，測(cè)定了這15株無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌的菌落生長(zhǎng)速度，結(jié)果顯示，這15株無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落的平均生長(zhǎng)速度為(0.41～0.85) mm/d，且生長(zhǎng)速度與海拔具有相關(guān)性。分布在海拔低于3000 m的無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌的菌落生長(zhǎng)速度比生長(zhǎng)于海拔高于3000 m菌落的生長(zhǎng)速度快。觀察菌落發(fā)現(xiàn)，分布在海拔高于3000 m的菌落正面特征較為一致，而分布在海拔低于3000 m的菌落正面特征出現(xiàn)不同。另外，通過(guò)多基因聯(lián)合建樹發(fā)現(xiàn)，分布在海拔高于3000 m的無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌聚在一個(gè)分支，而分布在海拔低于3000 m的無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌呈現(xiàn)星狀分布。由于目前尚未對(duì)中國(guó)西北地區(qū)披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌命名。因此，希望本研究結(jié)果能為該菌的命名提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌；披堿草；菌落；多樣性；系統(tǒng)發(fā)育

Characteristic of asexual endophytes isolated fromElymusspecies in northwest China

SONG Hui, NAN Zhi-Biao*, TIAN Pei

KeyLaboratoryofGrasslandAgro-Ecosystems,CollegeofPastoralAgriculturalScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

Abstract:Forage grasses (Poaceae) often harbour endophytes belonging to the Neotyphodium and Epichlo? (Clavicipitaceae, Ascomycota) genera. Neotyphodium endophytes, the asexual state of Epichlo? species, helps to protect cool-season grasses against biotic and abiotic stresses including drought, disease, herbivory and parasitism and enhance aboveground and belowground vegetative and reproductive growth. There is little information on colonial diversity of asexual endophytes isolated from Elymus species in northwest Chinese. In the present study, different geographic populations of Elymus species were tested using the aniline blue screening method; 15 endophyte strains were isolated from endophyte positive plants. The average growth rate (on potato dextrose agar) of the isolated strains was 0.41-0.85 mm/day and was correlated with altitude. Endophyte strains isolated from regions below an altitude of 3000 m grew faster than strains isolated from regions above 3000 m. The colonial morphology of endophyte strains isolated from regions above 3000 m was similar whereas the colonial morphology of endophyte strains isolated from lower altitudes differed. In addition, the phylogenetic trees showed that endophytes collected above 3000 m were clustered whereas endophyte strains from lower altitudes demonstrated a star-like topology. The results will provide a theoretical basis for the identification of endophyte from northwest Chinese Elymus species.

Key words:endophyte; Elymus; colony; diversity; phylogeny

植物和其所帶真菌(或細(xì)菌)形成的共生體廣泛地分布在自然界中。這種互生共利的共生體能提高宿主植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、提高對(duì)非生物脅迫的抗性以及通過(guò)產(chǎn)生生物堿避免昆蟲的采食和病原菌的侵入[1-12]。在過(guò)去30多年中，研究者們已經(jīng)做了大量的關(guān)于宿主植物和其所帶內(nèi)生真菌(endophyte)相互作用的研究。這里的內(nèi)生真菌主要指的是子囊菌門(Ascomycota)麥角科(Clavicipitaceae)的有性世代Epichlo?和其所對(duì)應(yīng)無(wú)性世代Neotyphodium。在這些研究中，研究者們發(fā)現(xiàn)了很多不同于其他植物和微生物所組成共生體的特征。Epichlo?(Neotyphodium)內(nèi)生真菌廣泛地分布在一些重要的牧草中，由于他們的侵入一方面能提高宿主植物的生物學(xué)特征；另一方面，一些侵入宿主植物的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的生物堿又會(huì)引起家畜中毒甚至死亡。因此，在全世界范圍內(nèi)引起了對(duì)Epichlo?(Neotyphodium)內(nèi)生真菌的廣泛研究。最近，Leuchtmann等[13]根據(jù)大量的基因組測(cè)序結(jié)果并結(jié)合形態(tài)學(xué)描述，將Epichlo?(Neotyphodium)進(jìn)行了重命名。他們將所有內(nèi)生真菌均命名為Epichlo?，原本的Neotyphodium被認(rèn)為暫時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其有性階段，也被冠以Epichlo?。由于這種命名并不能很好地揭示無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌的起源和傳播。因此，在本文中仍采用原有的分類方法。

披堿草屬(Elymus)植物隸屬于禾本科小麥族，據(jù)統(tǒng)計(jì)大約有150種披堿草屬植物分布在北半球，主要分布在北極地區(qū)至亞熱帶之間[14-15]。關(guān)于披堿草屬植物內(nèi)生真菌的系統(tǒng)研究?jī)H限于分離于北美洲披堿草屬植物有性世代Epichlo?內(nèi)生真菌，研究者對(duì)該內(nèi)生真菌進(jìn)行了命名并分析了產(chǎn)生物堿的特征[16]。相反，中國(guó)特有披堿草屬植物內(nèi)生真菌的研究尚不系統(tǒng)，雖有研究者已經(jīng)分離出中國(guó)特有披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌，但尚未對(duì)其命名，也未對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。Zhang和Nan[17-18]已報(bào)道了分離于中國(guó)地區(qū)披堿草(Elymusdahuricus)無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌，并從內(nèi)生真菌產(chǎn)生物堿和對(duì)宿主植物的影響等方面進(jìn)行了研究。他們的研究表明，共生體所產(chǎn)的生物堿peramine的含量隨季節(jié)變化，其中生長(zhǎng)季末含量最高，另外，披堿草內(nèi)生真菌能提高宿主植物的耐旱性和發(fā)芽率[19]。本文的主要目的是：1) 測(cè)定已分離于中國(guó)西北地區(qū)披堿草屬植物內(nèi)生真菌菌落的生長(zhǎng)速度和觀察菌落特征，為中國(guó)西北地區(qū)披堿草屬植物內(nèi)生真菌的命名提供理論依據(jù)。2) 通過(guò)測(cè)定已分離內(nèi)生真菌微管蛋白基因(tubB)和延長(zhǎng)因子基因(tefA)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合菌落生長(zhǎng)速度，從分子生物學(xué)角度探討這些內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1材料與方法

1.1　材料

在中國(guó)西北地區(qū)共采集234株披堿草屬植物的種子和植株，采集省份包括寧夏、甘肅、青海。采集到的種子已播種到蘭州大學(xué)榆中校區(qū)試驗(yàn)田。使用苯胺藍(lán)染色法[20]檢測(cè)這些披堿草屬植物的帶菌情況，帶有內(nèi)生真菌的披堿草屬植物主要分布在甘肅和青海。詳細(xì)信息見表1。

1.2　內(nèi)生真菌的分離和培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)表面消毒的披堿草屬植物的莖稈或種子放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，25℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)。待莖稈或種子周圍有菌絲長(zhǎng)出后，使用經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理過(guò)的解剖針挑取少量菌絲于新鮮PDA培養(yǎng)。將PDA培養(yǎng)基置于25℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)4周[21]。為揭示生長(zhǎng)速度和培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系，本研究對(duì)內(nèi)生真菌菌落的生長(zhǎng)速度采用十字法進(jìn)行2次測(cè)量，第1次測(cè)量時(shí)間為內(nèi)生真菌生長(zhǎng)2周后(設(shè)置3個(gè)重復(fù))，第2次測(cè)量時(shí)間為內(nèi)生真菌生長(zhǎng)4周后采用同樣的方法進(jìn)行測(cè)量。

1.3　內(nèi)生真菌DNA的提取和擴(kuò)增

使用OMEGA公司的真菌DNA試劑盒(D3195-01)提取無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌DNA。本研究以微管蛋白基因(tubB)和延長(zhǎng)因子基因(tefA)序列為分子標(biāo)記構(gòu)建披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。其PCR引物、反應(yīng)程序以及反應(yīng)體系參照Moon等[3]的方法。擴(kuò)增tubB和tefA序列的引物為：tub-5: GAGAAAATGCGTGAGATTGT 和 tub-3: GTTTCGTCCGAGTTCTCGAC以及tef-5: GGGTAAGGACGAAAAGACTCA和tef-3: CGGCAGCGATAATCAGGATAG。PCR反應(yīng)體系為：模板DNA，1 μL；引物各1 μL；2×taq master-mix，12.5 μL；使用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，然后運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，分別是，94℃，30 s；45℃，45s(tefA：55℃，45 s)；72℃，1 min。最后，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至pMD18-T載體(Takara, 大連)，利用PCR法篩選陽(yáng)性克隆，每個(gè)樣本的每個(gè)分子標(biāo)記均挑選3～5個(gè)陽(yáng)性克隆委托蘭州勵(lì)合生物進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4　數(shù)據(jù)分析

使用MAFFT 7.0 軟件[22]對(duì)tubB和tefA序列進(jìn)行多序列比對(duì)，對(duì)其結(jié)果使用GeneDoc軟件[23]進(jìn)行手工調(diào)整。然后使用SequenceMatrix軟件[24]將2個(gè)序列合并為1條序列，并對(duì)其進(jìn)行不相合長(zhǎng)度差異檢測(cè)(incongruence length difference test， ILD test)以檢測(cè)2條序列是否適合聯(lián)合建樹。檢測(cè)結(jié)果表明，合并后的序列完全適用于多序列聯(lián)合建樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹由PAUP 4.0軟件[25]采用ML方法構(gòu)建。ML系統(tǒng)進(jìn)化樹的最佳模型為K80由Mrmodeltest軟件[26]計(jì)算。構(gòu)建的進(jìn)化樹均采用1000次隨機(jī)取樣重復(fù)，即自舉值(bootstrap value)設(shè)置為1000。

此外，使用SPSS 17.0軟件[27]對(duì)菌落生長(zhǎng)速度進(jìn)行分析。

2結(jié)果與討論

2.1　菌落生長(zhǎng)速度測(cè)定

通過(guò)對(duì)15株披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落生長(zhǎng)速度的研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落的生長(zhǎng)速度與宿主植物的生長(zhǎng)區(qū)域具有特異相關(guān)性，而與宿主植物的種類沒(méi)有特異性。分布在海拔低于3000 m不同宿主植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落的生長(zhǎng)速度(0.45～0.85) mm/d 顯著大于海拔高于3000 m不同宿主植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落的生長(zhǎng)速度(0.41～0.65) mm/d (P<0.05)。

統(tǒng)計(jì)不同種類內(nèi)生真菌菌落生長(zhǎng)速度發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌在不同時(shí)期具有不同的生長(zhǎng)速度[28]。但是，本研究的結(jié)果卻與此不同。在培養(yǎng)無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌的4個(gè)星期過(guò)程中，菌落平均生長(zhǎng)速度為(0.41～0.85) mm/d，前2周和后2周的菌落平均生長(zhǎng)速度均為(0.42～0.83) mm/d。這3組數(shù)據(jù)表明，本研究無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落在不同生長(zhǎng)時(shí)期的速度基本沒(méi)有變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，分布在海拔低于3000 m披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落前2周的平均生長(zhǎng)速度為(0.43～0.83) mm/d，而分布在海拔高于3000 m披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落前2周的平均生長(zhǎng)速度為(0.42～0.63) mm/d。分布在海拔低于3000 m披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落后2周的平均生長(zhǎng)速度為(0.43～0.83) mm/d，而分布在海拔高于3000 m披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落后2周的平均生長(zhǎng)速度為(0.42～0.63) mm/d。海拔低于3000 m無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落4周的平均生長(zhǎng)速度為(0.45～0.85)mm/d，而海拔高于3000 m無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落4周的平均生長(zhǎng)速度為(0.41～0.65) mm/d。這些結(jié)果表明：1) 海拔低于3000 m無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落的平均生長(zhǎng)速度顯著大于海拔高于3000 m無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落的平均生長(zhǎng)速度(P<0.05)。 2) 分布在不同地理區(qū)域的內(nèi)生真菌在不同生長(zhǎng)時(shí)期的平均生長(zhǎng)速度基本相同。

有性世代和無(wú)性世代內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)速度不同[28]。分離于北美洲披堿草屬植物有性世代Epichlo?elymi內(nèi)生真菌菌落的生長(zhǎng)速度為(2.0～2.9) mm/d[16]。另外，通過(guò)分析tefA和tubB序列與其他已報(bào)道的內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，本研究所分離的中國(guó)西北地區(qū)披堿草屬植物無(wú)性世代內(nèi)生真菌與分離Poapratensisssp.pratensis的有性世代Epichlo?liyangensis之間存在親緣關(guān)系，而與分離于北美洲披堿草屬植物有性世代的內(nèi)生真菌并不存在親緣關(guān)系，表明本研究分離的內(nèi)生真菌與E.liyangensis存在共同祖先(未發(fā)表)。研究表明E.liyangensi的生長(zhǎng)速率為(1.72～2.37) mm/d[29]。因此，不管是與分離于北美洲披堿草屬植物有性世代E.elymi內(nèi)生真菌相比，還是與分離于Poapratensisssp.pratensis的有性世代E.liyangensis內(nèi)生真菌相比，本研究所分離的無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落的生長(zhǎng)速度(0.41～0.85) mm/d均比較慢。這與無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)速度小于有性世代Epichlo?內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)速度的結(jié)論相一致[30]。

通過(guò)觀察披堿草屬植物內(nèi)生真菌菌落的形態(tài)特征，還發(fā)現(xiàn)一些規(guī)律。所有菌落背面形態(tài)相似，均為深褐色；但是，海拔低于3000 m無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌的正面菌落存在一個(gè)球形(NI_201203、NI_201208)、半圓形(NI_201201、NI_201206和NI_201210)或無(wú)突起(NI_201221)(圖1A)；而海拔高于3000 m無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌的正面菌落存在一個(gè)類似“蒙古包”突起(圖1B)。另外，麥賓草(Elymustangutorum)所帶無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌在不同海拔表現(xiàn)出不一樣的菌落形態(tài)，而分布在海拔高于3000 m的菌落卻出現(xiàn)相同的菌落形態(tài)特征(表1和圖1)。這表明，披堿草屬植物內(nèi)生真菌的菌落特征與海拔具有特異性，而與宿主植物的種類無(wú)特異性。Karimi等[31]通過(guò)使用AFLP(amplified fragment length poly-morphisms)分子標(biāo)記研究伊朗3種宿主植物(Festucaarundinacea,Festucapratensis和Loliumperenne)與無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌與宿主植物的地理分布具有特異性而與物種之間沒(méi)有直接的特異性。另外，這一結(jié)論與Card等[32]使用SSR(simple sequence repeat)分子標(biāo)記技術(shù)研究小麥族(Triticeae)植物，特別是大麥屬和披堿草屬植物的結(jié)果是一致的。但是，Simpson等[33]在新西蘭發(fā)現(xiàn)了一株帶有無(wú)性世代Neotyphodiumlolii內(nèi)生真菌的矮化的黑麥草(Loliumperenne)，他們?cè)诜蛛x這株矮化黑麥草的內(nèi)生真菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，該內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)與其他黑麥草N.lolii內(nèi)生真菌的形態(tài)不一致。隨后，他們將該形態(tài)不同的內(nèi)生真菌接種到用殺菌劑處理后的黑麥草植物中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原本正常生長(zhǎng)的黑麥草竟然出現(xiàn)了矮化現(xiàn)象。這表明不同基因型的內(nèi)生真菌可能會(huì)影響宿主植物的表型。

圖1　中國(guó)西北地區(qū)披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落形態(tài)特征Fig.1　Colonial morphotype of asexual Neotyphodium endophytes from northwest Chinese Elymus species　　　A：海拔低于3000 m菌落形態(tài)特征；B：海拔高于3000 m菌落形態(tài)特征。A: Colonial morphotype regions below 3000 m; B: Colonial morphotype regions above 3000 m.

雖然本研究尚不能很好地解釋披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌菌落形態(tài)不同的原因，但是本研究根據(jù)目前的結(jié)果并參考Sipmpon的研究結(jié)果大膽提出以下2個(gè)問(wèn)題：1) 披堿草屬植物內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)由于海拔差異而出現(xiàn)了不同，是不是內(nèi)生真菌與不同地理區(qū)域披堿草屬植物具有特異性？2) 是不是這兩種不同菌落形態(tài)的內(nèi)生真菌對(duì)宿主植物的影響不同？例如：哪種菌落形態(tài)下，宿主植物對(duì)生物或非生物的抗性更強(qiáng)？

表1　中國(guó)西北地區(qū)披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌生長(zhǎng)速度

2.2　系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

與菌落培養(yǎng)特征相似，ML系統(tǒng)進(jìn)化樹同樣反映出無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌的聚類與海拔的相關(guān)性。由于NI_201207未克隆到tubB序列、NI_201209未克隆到tefA序列。因此在系統(tǒng)進(jìn)化分析中缺少NI_201207和NI_201209。系統(tǒng)進(jìn)化樹中有一個(gè)主要分支(圖2)，該分支包含所有海拔高于3000 m的披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌(自展率: 85)。相反，海拔低于3000 m的披堿草屬植物內(nèi)生真菌并不聚集在一起，而呈星狀分布。雖然有研究表明，同一物種不成聚類分布的現(xiàn)象可能是由于基因重復(fù)(gene duplication)造成的[16,29-34]，但是披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌tubB、tefA和actB序列均未發(fā)現(xiàn)基因重復(fù)事件(未發(fā)表)。這可能是由于海拔低于3000 m的披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌與其宿主植物長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果。

圖2　中國(guó)西北地區(qū)披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.2　Phylogenetic relationships of asexual Neotyphodium endophytes from northwest Chinese Elymus species

另外，環(huán)境因素也可能發(fā)揮著重要的作用。Iannone等[35]研究阿根廷Poabonariensis宿主植物的內(nèi)生真菌發(fā)現(xiàn)，分布在干旱地區(qū)的P.bonariensis宿主植物帶有內(nèi)生真菌，而分布在潮濕草原中的P.bonariensis宿主植物則不帶有內(nèi)生真菌。本研究的披堿草屬植物分布在中國(guó)西北較為干旱的地區(qū)。海拔高于3000 m的地方，晝夜溫差更大并且紫外線更為強(qiáng)烈?；蛟S晝夜溫差和紫外線的強(qiáng)度是造成海拔高于3000 m的披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌聚集在一起的原因。相反，海拔低于3000 m的地方環(huán)境因素更為多變，如降雨量的不同，陰面和陽(yáng)面的區(qū)別等。這些外界因素可能是使海拔低于3000 m披堿草屬植物無(wú)性世代Neotyphodium內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)特征和在系統(tǒng)進(jìn)化樹上不成聚類的原因。不過(guò)，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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通訊作者*Corresponding author. E-mail：zhibiao@lzu.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：宋輝(1985-)，男，山東魚臺(tái)人，在讀博士。E-mail：songh12@lzu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家“973”項(xiàng)目(2014CB138702)和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(lzujbky-2014-76, lzujbky-2014-81)資助。

收稿日期：2014-10-09；改回日期：2014-11-17

DOI：10.11686/cyxb2014411http://cyxb.lzu.edu.cn