趙景壯，徐黎明，劉淼，曹永生，劉紅柏，尹家勝，盧彤巖

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫苗工程菌發(fā)酵工藝研究

趙景壯，徐黎明，劉淼，曹永生，劉紅柏，尹家勝，盧彤巖

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

急性傳染性造血器官壞死?。╥nfectious hematopoietic necrosis，IHN）嚴(yán)重威脅虹鱒Oncorhynchus mykiss養(yǎng)殖業(yè)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，核酸疫苗已成為虹鱒IHN疾病預(yù)防的研究熱點。本研究首先檢測虹鱒IHN核酸疫苗工程菌的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果顯示工程菌在連續(xù)培養(yǎng)30代后，仍能保持穩(wěn)定的質(zhì)?？截悢?shù)。質(zhì)粒酶切結(jié)果表明：連續(xù)培養(yǎng)30代后的質(zhì)粒依然保持良好的完整性。在篩選高拷貝工程菌的基礎(chǔ)上，又研究核酸疫苗的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基、補料及發(fā)酵時間。結(jié)果表明：最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：1.2%胰蛋白胨（Tryptone）、2.4%酵母提取物（Yeast Extract）、0.5%甘油、0.017 mol·L-1KH2PO4、0.072 mol·L-1K2HPO4；補料配方為：3%胰蛋白胨、1.5%酵母提取物、50%甘油，最佳發(fā)酵時間為16h。本研究可為虹鱒IHN核酸疫苗的規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

虹鱒；傳染性造血器官壞死病；核酸疫苗；發(fā)酵

傳染性造血器官壞死病（infectious hematopoietic necrosis，IHN）是一種嚴(yán)重威脅鮭鱒的急性傳染病[1-3]。它主要感染魚類的脾臟和腎臟等造血組織，引起組織壞死[4]，根據(jù)魚種、魚齡、病毒菌株及飼養(yǎng)環(huán)境的不同，死亡率在80%～100%[5,6]。近年來IHN在我國頻繁暴發(fā)，使我國的鮭養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失嚴(yán)重[7-10]。IHN的病原為傳染性造血器官壞死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV），其表面糖蛋白（glycoprotein，G）是病毒表面的主要抗原，與病毒的毒力強弱直接相關(guān)，目前多將其基因作為疫苗研制的主要基因[11-13]。

核酸疫苗又稱基因疫苗，是近年來新興的研究領(lǐng)域，主要分為DNA疫苗和RNA疫苗。它主要是將編碼抗原蛋白的基因克隆到真核表達載體上，然后通過注射將重組質(zhì)粒帶入動物細胞，利用宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成外源抗原蛋白，激活機體免疫反應(yīng)[14]。目前在預(yù)防虹鱒IHN疾病的研究中，已廣泛應(yīng)用DNA核酸疫苗[5,15,16]。

為了能夠獲得高產(chǎn)量的虹鱒傳染性造血器官壞死病DNA核酸疫苗，本研究在篩選高拷貝工程菌的基礎(chǔ)上，通過研究DNA疫苗的高密度發(fā)酵條件，以期為虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.2 高拷貝工程菌株的篩選

將本實驗室保存的DH5α/pcDNA3.1-G工程菌在含有100μg·mL-1氨芐青霉素（Amp+）的LB固體培養(yǎng)基上劃線，37℃倒置培養(yǎng)12h后，挑取單菌落于含有100μg·mL-1Amp+的液體培養(yǎng)基中，置于搖床中37℃180r·min-1振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌體的OD600達到0.4～0.6時，12 000r·min-1離心收集菌體，抽提工程菌株細胞內(nèi)的質(zhì)粒，并選擇質(zhì)粒提取含量最高的菌株作為發(fā)酵用種子，進行工程菌的甘油保種并保存于-80℃。

1.3 工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測

將本研究中篩選所得的高拷貝工程菌株按1%比例接種于含有100μg·mL-1Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃180r·min-1振蕩培養(yǎng)12h后再次按1%比例接種到含有同濃度Amp+的LB液體培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，重復(fù)上述傳代操作30次。每次傳代前留取樣品，檢測質(zhì)粒穩(wěn)定性。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

本研究設(shè)計4種發(fā)酵用培養(yǎng)基，培養(yǎng)基A：1% Tryptone、0.5%Yeast Extract、1%NaCl；培養(yǎng)基 B：1.6%Tryptone、1%Yeast Extract、0.5%NaCl；培養(yǎng)基C：1.2%Tryptone、2.4%Yeast Extract、0.5%甘油（glycerol）、0.017mol·L-1KH2PO4、0.072 mol·L-1K2HPO4；培養(yǎng)基D：0.5%Tryptone、1.5%Yeast Extract、1%葡萄糖（glucose）、0.009mol·L-1KH2PO4、0.25mol·L-1K2HPO4。以上4種培養(yǎng)基滅菌后均加入微量元素貯存液，終濃度為 1mL·L-1。微量元素貯存液配方如下：0.01mol·L-1FeSO4·7H2O、0.01mol·L-1MnCl2·4H2O、0.01mol·L-1CoSO4·7H2O、0.01mol·L-1CaCl2、0.006mol· L-1CuCl2·2H2O、0.004mol·L-1ZnSO4·7H2O。發(fā)酵結(jié)束后分別檢測菌體OD600、菌體濕重、質(zhì)粒含量，篩選出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.5 發(fā)酵補料的篩選

本實驗通過單因素實驗、Plackett-Burman實驗、最陡爬坡實驗和響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵法確定了百香果酸奶最佳發(fā)酵工藝。結(jié)果表明：以果汁添加量、白砂糖添加量和發(fā)酵溫度為自變量，響應(yīng)面法優(yōu)化得出百香果酸奶的最佳發(fā)酵工藝為白糖添加量7.4%，接種量0.1%，百香果果汁添加量5.5%，發(fā)酵溫度42.7℃，發(fā)酵時間5 h。在此條件下，酸奶感官評分約達到94.33分，與預(yù)測值（93.9705分）基本相符，此結(jié)果可充分驗證該試驗?zāi)Ｐ偷目煽啃?。實驗檢測出百香果酸奶的酸度為73°T，乳酸菌檢測數(shù)為5.8×108 mL-1，大腸桿菌沒有檢測出。本實驗研制的百香果酸奶的品質(zhì)完全符合國家發(fā)酵乳的標(biāo)準(zhǔn)[15]。

本研究共設(shè)計3種補料，補料Ⅰ：3%Tryptone、1.5%Yeast Extract、50%glycerol；補料Ⅱ：3%Tryptone、1.5%Yeast Extract、50%glucose；補料Ⅲ：5% Tryptone、3%Yeast Extract。發(fā)酵結(jié)束后分別檢測菌體OD600、菌體濕重、質(zhì)粒含量，篩選出最佳補料配方。

1.6 發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)

取-80℃凍存的菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃180r·min-1振蕩培養(yǎng)10h后，按1%的比例轉(zhuǎn)接到新的LB液體培養(yǎng)基中。待振蕩培養(yǎng)10h后，按1%的比例接種于10L發(fā)酵罐內(nèi)（培養(yǎng)基體積為7L）進行發(fā)酵培養(yǎng)。溫度設(shè)定為37℃，轉(zhuǎn)速250r·min-1，罐壓控制在0.01 Mpa左右，pH用氨水和磷酸自動調(diào)至（7.0±0.1）。發(fā)酵過程中，溶氧控制在30%以上，前期溶氧低于30%時采用提高攪拌轉(zhuǎn)速增加溶氧，每次轉(zhuǎn)速提高50r·min-1；當(dāng)攪拌槳轉(zhuǎn)速達到最大值時（700r·min-1），采用補料添加速率控制溶氧，當(dāng)罐體內(nèi)溶氧高于或低于30%時，分別加快或減慢補料添加速度，發(fā)酵時間為18h。發(fā)酵過程中每1h取少量發(fā)酵液檢測菌體OD600、菌體濕重、質(zhì)粒含量，確定最佳發(fā)酵時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 高拷貝工程菌的遺傳穩(wěn)定性

工程菌經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)后，質(zhì)粒DNApcDNA3. 1-G在大腸桿菌DH5α中能夠保持穩(wěn)定的質(zhì)?？截悢?shù)（圖1）；經(jīng)過30代的傳代培養(yǎng)后對質(zhì)粒進行酶切。結(jié)果顯示：在1 725bp處出現(xiàn)特異性條帶，表明質(zhì)粒依然保持了完整性（圖2），即DH5α/pcDNA3. 1-G可以作為發(fā)酵所用的工程菌。

圖1 連續(xù)傳代30次質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測Fig.1 Plasmid stability in 30 consecutive batches

圖2 傳代30次后質(zhì)粒酶切檢測Fig.2 Identification of plasmid in 30 consecutive batches by dual-digestion

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

將遺傳穩(wěn)定的高拷貝工程菌DH5α/pcDNA3. 1-G菌株分別接種到4種體積均為500mL的發(fā)酵篩選培養(yǎng)基中，37℃180r·min-1振蕩培養(yǎng)12h后分別收集發(fā)酵菌體，抽提質(zhì)粒。發(fā)酵結(jié)果表明，經(jīng)過12h的搖瓶發(fā)酵后，培養(yǎng)基C的配方更加適合工程菌株的高密度生長及高產(chǎn)量質(zhì)粒的復(fù)制。

2.3 補料的成分

3種補料配方的發(fā)酵結(jié)果表明，添加了3種補料后工程菌的菌體量明顯提高，其中添加補料Ⅰ后菌體量及單位工程菌的質(zhì)粒含量都明顯優(yōu)于其他2種補料。

表1 不同培養(yǎng)基對菌體密度和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響Tab.1 Effect of different media on the cell density of and plasmid DNA yield in the bacterial strain

表2 不同補料組成對菌體密度和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響Tab.2 Effect of ingredients of feed medium on the cell densityandplasmidDNAyieldinthebacterialstrain

2.4 發(fā)酵時間的影響

發(fā)酵過程中每1h取少量發(fā)酵液檢測菌體OD600及質(zhì)粒含量,結(jié)果表明：隨著工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)，質(zhì)粒的含量也逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵16h時單位工程菌的質(zhì)粒含量達到最高值，此后，雖然工程菌的OD600和質(zhì)粒含量都仍有增加，但是單位工程菌的質(zhì)粒含量卻下降，因此16h為最佳的發(fā)酵培養(yǎng)時間。

圖3 不同培養(yǎng)時間對質(zhì)粒發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.3 Influence of culture period on fermentation product

3 討論

核酸疫苗具有構(gòu)建簡單、免疫效果好、保護期長、生產(chǎn)成本低、使用安全等優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用于魚類疾病的免疫預(yù)防中[14]。生產(chǎn)核酸疫苗的成本是限制其應(yīng)用的主要瓶頸之一，能否用低成本獲得高產(chǎn)量的核酸疫苗也是疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)[17]。

傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝?yán)眉毦呙芏劝l(fā)酵獲得重組蛋白，而目前的核酸疫苗發(fā)酵工藝普遍采用補料-分批發(fā)酵的方式進行。當(dāng)發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不足時，采用流加補料的方式提高菌體生長密度以及核酸的表達量[18-20]。核酸的發(fā)酵生產(chǎn)不同于常規(guī)的高密度培養(yǎng)，獲得高密度的生物產(chǎn)量不一定能夠獲得高的質(zhì)粒產(chǎn)量。在核酸的發(fā)酵過程中要考慮到核酸的容積比（mg/L），只有獲得了相對較高的核酸容積比才能夠降低發(fā)酵核酸疫苗的成本。因此摸索、優(yōu)化核酸發(fā)酵條件是核酸疫苗生產(chǎn)中不可忽略的重要因素。

菌體核酸的穩(wěn)定性直接影響到最終核酸疫苗的表達量，在高密度發(fā)酵擴增菌體時核酸容易丟失[21]。本研究在優(yōu)化DH5α/pcDNA3.1-G的發(fā)酵工藝前，建立了穩(wěn)定的發(fā)酵工程菌株，并檢測了其遺傳的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：連續(xù)傳代30次后，工程菌仍然有穩(wěn)定的遺傳性，能夠用于建立大規(guī)模發(fā)酵過程中的種子庫。本研究選擇了4種大腸桿菌常用的培養(yǎng)基，并對其改良后進行了發(fā)酵篩選。結(jié)果表明，培養(yǎng)基C的配方更適合DH5α/pcDNA3.1-G菌株的高密度發(fā)酵。培養(yǎng)基C和D含有的碳及氮源量高于培養(yǎng)基A、B，其中的磷酸鹽緩沖性對穩(wěn)定發(fā)酵過程中的pH起到了一定的緩沖作用。培養(yǎng)基C比D更加適用于核酸疫苗的發(fā)酵，可能是其利用甘油替代葡萄糖的緣故。在發(fā)酵的過程中，當(dāng)菌體的比生長速率超過了一定值后會產(chǎn)生大量的乙酸，而大腸桿菌能夠直接利用葡萄糖而產(chǎn)生大量的乙酸，抑制細菌的生長和質(zhì)粒的復(fù)制，并且菌體比生長速率太快不利于質(zhì)粒的大量復(fù)制[22-24]。利用甘油代替葡萄糖，不但能夠降低發(fā)酵過程中乙酸的產(chǎn)量，還能降低大腸桿菌的比生長速率，獲得較高的菌體生物量及質(zhì)粒產(chǎn)量[22]。

本研究對發(fā)酵中補料的篩選結(jié)果表明，添加補料Ⅰ后，菌體量及單位工程菌的核酸含量都明顯優(yōu)于其他2種補料。Danquah等[25]的研究也表明，采用甘油為碳源進行的補料培養(yǎng)中，核酸的產(chǎn)量明顯提高。這可能是由于本研究采用甘油為補料中主要碳源，并以恒速流加的補料方式更加符合菌株及目的產(chǎn)物的生產(chǎn)特性。本研究中對發(fā)酵時間的摸索表明，發(fā)酵2～4h后質(zhì)粒復(fù)制速率升高，16h時單位菌體的質(zhì)粒含量達到峰值；隨后，雖然菌體的OD600有緩慢的升高，但是單位菌體的質(zhì)粒含量反而下降，說明在菌體的生長進入對數(shù)生長后期時，質(zhì)粒出現(xiàn)了部分丟失，這可能是由于培養(yǎng)基的養(yǎng)分消耗殆盡，影響了菌體的遺傳穩(wěn)定性。因此發(fā)酵16h后結(jié)束發(fā)酵，不但可以獲得高產(chǎn)量的質(zhì)粒，還能減低發(fā)酵的生產(chǎn)成本。

本研究對虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫苗的發(fā)酵工藝進行了初步研究。結(jié)果表明：培養(yǎng)基C：1.2%Tryptone、2.4%Yeast Extract、0.5%glycerol、0.017mol·L-1KH2PO4、0.072mol·L-1K2HPO4；補料Ⅰ：3%Tryptone、1.5%Yeast Extract、50%glycerol更加適合虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫苗的發(fā)酵；發(fā)酵16h能夠獲得高產(chǎn)量的核酸疫苗。

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Engineering Bacterial Fermentation of DNA Vaccine Against Rainbow Trout Infectious Hematopoietic Necrosis

ZHAO Jing-zhuang,XU Li-ming,LIU Miao,CAO Yong-sheng,LIU Hong-bai,YIN Jia-sheng,LU Tong-yan
（Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

Infectious hematopoietic necrosis（IHN）,as one of the most serious disease causing acute,systemic and virulent disease in rainbow trout Oncorhynchus mykiss,often results in serious economic losses in rainbow trout industry.The DNA vaccine against IHN has been widely studied to make the efficient protection.The genetic stability of engineering bacteria was first studied and the engineering bacterium with high copy was screened in order to obtain high yield of IHN DNA vaccine.The results showed that the engineering bacteria maintained stable plasmid copy number in thirty-generation succession culture,and the plasmid remained good integrity according to enzyme digestion.The optimal medium for fermentation was screened in the medium of 2%Tryptone,2.4%Yeast Extract,0.5%glycerol,0.017 mol·L-1KH2PO4and 0.072 mol·L-1K2HPO4.It was found that the optimal feeding was comprised of 3% Tryptone,1.5%Yeast Extract,50%glycerol during the culture time of 16 h.The optimal condition for IHN DNA vaccine fermentation provides a reference for the large-scale production of rainbow trout IHN DNA vaccine.

rainbow trout;infectious hematopoietic necrosis virus;DNA vaccine;fermentation

Q785；S917

A

1005-3832（2016）06-0014-05

2016-09-20

國家科技支撐計劃（2012BAD25B02）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（HSY201410）；黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點開放實驗室(201104).

趙景壯（1987-），男，助理研究員.E-mail:zhaojingzhuang1987@163.com

盧彤巖（1967-），女，研究員.E-mail:lutongyan@hrfri.ac.cn