曹頂臣，佟廣香，呂偉華，孫志鵬，匡友誼，鄭先虎，孫效文

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚ifi30基因

曹頂臣，佟廣香，呂偉華，孫志鵬，匡友誼，鄭先虎，孫效文

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在斑馬魚Danio rerio干擾素γ誘導(dǎo)蛋白30（ifi30）基因的第一個(gè)外顯子處選取靶位點(diǎn)，用PCR法構(gòu)建gRNA，并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA和Cas9mRNA顯微注射到斑馬魚1細(xì)胞期的受精卵中，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因ifi30的沉默。注射后24h檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基因突變率在79%～95%之間，平均突變率為87.2%。為了獲得穩(wěn)定遺傳的基因突變純合系，將F0代與野生型斑馬魚進(jìn)行配組，獲得了3種突變類型的F1代，其突變率為30%。三種突變類型中突變1和突變2為移碼突變，突變3刪除了6個(gè)堿基，并未造成移碼。突變1和突變2的F1代雜合個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育未見異常。將雜合F1代自交，理論上將獲得突變純合個(gè)體，但僅在受精2h以內(nèi)的胚胎中檢測(cè)到了突變純合個(gè)體，受精24h后的胚胎中，只有野生型和雜合型，未見突變純合個(gè)體。推測(cè)ifi30基因的移碼突變?cè)斐闪烁蓴_素γ誘導(dǎo)蛋白的缺失，導(dǎo)致胚胎死亡。

斑馬魚；ifi30；CRISPR/Cas9技術(shù)；敲除

斑馬魚Danio rerio個(gè)體小、發(fā)育快、易于飼養(yǎng)、性成熟周期短、繁殖力強(qiáng)、體外受精、胚胎在母體外發(fā)育，且受精卵透明、易于操作，已成為常用的動(dòng)物模型[1]，越來(lái)越多地被用于免疫相關(guān)研究中。干擾素γ誘導(dǎo)蛋白30（ifi30）作為一種可溶性的蛋白質(zhì)，能夠在催化二硫鍵的還原，參與抗原呈遞和加工以及對(duì)機(jī)體病毒免疫、腫瘤免疫、寄生蟲抗原免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響，ifi30的缺失可能會(huì)對(duì)機(jī)體病毒免疫[2,3]、腫瘤免疫[4,5]、寄生蟲的抗原免疫應(yīng)答造成影響，還可能引起自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展[6]。因此，研究ifi30基因突變對(duì)斑馬魚的影響，具有重要的意義。

CRISPR/Cas9技術(shù)[7-9]簡(jiǎn)單、易行，作為一種備受矚目的基因組定向編輯技術(shù)，在人類細(xì)胞、小鼠和斑馬魚等物種中成功實(shí)現(xiàn)了基因組的定點(diǎn)修飾，并且具有較高的突變率[10-13]。本研究利用CRISPR/ Cas9技術(shù)編輯斑馬魚ifi30基因，定點(diǎn)敲除特定位點(diǎn)的序列，以獲得穩(wěn)定遺傳的ifi30基因缺失的純合個(gè)體，為研究該基因在免疫中的功能提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用AB品系斑馬魚，來(lái)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所自動(dòng)循環(huán)水系統(tǒng)中。光暗周期比率為14h∶10h（14 Light∶10 Dark）。按雌雄3∶2的比例將性成熟、健康的斑馬魚放入產(chǎn)卵盒內(nèi)，用擋板將雌雄魚分開。次日注射前將擋板取出，使其完成產(chǎn)卵與受精。

1.2 基因靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用特定的限制性內(nèi)切酶檢測(cè)突變，利用ChopChop設(shè)計(jì)ifi30的靶位點(diǎn)、PCR檢測(cè)引物和內(nèi)切酶。ifi30基因具有7個(gè)外顯子，在第一個(gè)外顯子上選擇GGACATAGCAGCTGAATGT為靶位點(diǎn)。采用PCR擴(kuò)增質(zhì)粒的方法獲得gRNA序列，在靶位點(diǎn)前增加上T7啟動(dòng)子序列，后增加上gRNA序列，獲得的gRNA引物和檢測(cè)PCR引物見表1。Chop-Chop設(shè)計(jì)的ifi30檢測(cè)內(nèi)切酶為Pvu II（NEB公司），該酶在相應(yīng)PCR擴(kuò)增片段中有一個(gè)酶切位點(diǎn)。酶切后，ifi30野生型（+/+）有2條帶，分別為294bp和147bp；純合突變型（-/-）僅1條帶，為441bp；雜合型（+/+）有3條帶，包括了野生型條帶和突變型條帶，分別是294bp、47bp和441bp。

1.3 PCR擴(kuò)增獲得gRNA

用引物ifi30和PT7reverse組合擴(kuò)增，加入2ng的pT7-gRNA質(zhì)粒（Addgeng網(wǎng)站購(gòu)買）為模板。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；35個(gè)循環(huán)，72℃，5min。用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物約120bp。檢測(cè)后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Axygen）純化回收PCR產(chǎn)物，測(cè)定濃度，作為gRNA待用。

1.4 gRNA和Cas9體外轉(zhuǎn)錄

gRNA用MEGAshortscriptTMT7 High Yield Transcription Kit體外轉(zhuǎn)錄；Cas9表達(dá)質(zhì)粒pCS2-nCas9n（Addgeng網(wǎng)站購(gòu)買）用內(nèi)切酶Not I（NEB公司）線性化，回收后用mMESSAGE mMACHINE SP6體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，用DNase去除DNA殘留，試劑盒回收RNA，檢測(cè)RNA的濃度和純度，-80℃冰箱保存待用。

1.5 顯微注射及檢測(cè)

體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA和Cas9 mRNA混合后加入25%的酚紅后，顯微注射到單細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中。sgRNA和 Cas9 mRNA的注射量分別為200pg/μL和300pg/μL，對(duì)照組為等量的25%的酚紅。注射后24～48h之間檢測(cè)突變率。在發(fā)育良好的胚胎中加入40mL裂解液[10mMTris（1mol/L）、pH8.0，50mM KCl（3mol/L）、0.3%的 Tween20和 NP40、0.5mg/mL的蛋白酶K]，55℃裂解2h，98℃10min。取出后震蕩混勻，離心，取上清液為模板。用PCR檢測(cè)引物擴(kuò)增，20μL PCR擴(kuò)增體系，程序同gRNA的PCR擴(kuò)增。酶切鑒定PCR產(chǎn)物。將獲得的突變進(jìn)行TA克隆，檢測(cè)變異克隆，測(cè)序，獲得突變序列。

1.6 變異檢測(cè)

注射的斑馬魚與野生型斑馬魚交配獲得F1代，篩選出F1突變個(gè)體，突變個(gè)體自交獲得F2。F2代中理論上包含純合突變個(gè)體、雜合個(gè)體和野生型。F2代突變純合個(gè)體群交，獲得穩(wěn)定遺傳的突變系（圖1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 gRNA靶位點(diǎn)的選擇及載體的構(gòu)建

表1 引物序列Tab.1 The sequences of primer used in the experiment

圖1 交配策略Fig.1 Mateing tactics in various types of zebrafish

通過(guò)ChopChop系統(tǒng)搜索和確定gRNA的靶位點(diǎn)。輸入ifi30基因外顯子序列獲得一系列關(guān)于sgRNA識(shí)別靶位點(diǎn)，選擇ifi30基因第一個(gè)外顯子上的GGACATAGCAGCTGAATGT為靶位點(diǎn)。合成ifi30和PT7 reverse引物（引物序列見表1），以pT7-gRNA質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得l 120bp左右的產(chǎn)物片段（圖2）。

圖2 gRNA的電泳圖譜（M：DL2000）Fig.2 Electrophoresis patterns of gRNA（Marker：DL2000）

2.2 突變效率計(jì)算

顯微注射24h后，選擇發(fā)育良好的胚胎進(jìn)行裂解提取DNA，每組檢測(cè)50枚胚胎，共計(jì)5組，分別用引物ifi30F和ifi30R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，酶切檢測(cè)突變率。結(jié)果表明：1～5組的突變效率分別為89%、83%、95%、90%和79%，平均突變率為87.2%。

2.3 F1代突變個(gè)體獲得

將注射的斑馬魚F0代飼養(yǎng)至性成熟，與野生型（AB系）斑馬魚進(jìn)行1∶1配組，產(chǎn)生F1子代，共配10組。受精24h后，提取受精卵DNA進(jìn)行PCR后酶切，檢測(cè)突變情況。10組F1代斑馬魚中，有3組檢測(cè)到突變，突變率為30%。圖3為其中一組突變檢測(cè)結(jié)果，圖中1號(hào)和3號(hào)樣本為三條帶，屬于雜合型突變，說(shuō)明DNA序列發(fā)生了變異，改變了酶的識(shí)別位點(diǎn)。將突變個(gè)體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆測(cè)序。圖4為突變個(gè)體1的測(cè)序結(jié)果，與參照序列對(duì)比，在箭頭位置缺失了5個(gè)堿基CTGAA。圖5顯示了3個(gè)突變體的突變位點(diǎn)缺失情況。由圖5可知，F(xiàn)1代ifi30基因序列產(chǎn)生了不同程度的缺失。突變個(gè)體1刪除了5個(gè)堿基CTGAA，突變個(gè)體2刪除了4個(gè)堿基TGAA，突變個(gè)體3刪除了6個(gè)堿基TGAATG。

圖3 F1代突變電泳圖Fig.3 Electrophoresis patterns of F1mutations

圖4 突變1的測(cè)序圖（箭頭代表缺失位點(diǎn)的位置）Fig.4 The sequence diagram of mutation 1（the arrow showing the missing position）

圖5 F1代ifi30基因位點(diǎn)的突變Fig.5 Mutations of F1at ifi30 gene target sites

突變1和突變2變異的堿基數(shù)不是3的整倍數(shù)，理論上能夠在蛋白翻譯過(guò)程中造成移碼，生成新的蛋白。將突變1和突變2飼養(yǎng)至性成熟，分別自交，獲得2組自交F2代個(gè)體，F(xiàn)2代個(gè)體中理論上包含純合突變個(gè)體（-/-），雜合個(gè)體（+/-）和野生型（+/+）。取受精后2h和24h的成活卵檢測(cè)2組F2代受精卵的突變，每次每組檢測(cè)50個(gè)樣本。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，受精2h的樣本包含10個(gè)純合突變個(gè)體（-/-）、28個(gè)雜合突變個(gè)體（+/-）和12個(gè)野生型個(gè)體（+/+），基本符合孟德爾遺傳定律；受精24h的樣本包括0個(gè)純合突變個(gè)體（-/-）、33個(gè)雜合突變個(gè)體（+/-）和17個(gè)野生型個(gè)體（+/+）（圖6和圖7）。受精2h檢測(cè)，樣本4、7、8和12僅含1條帶，與對(duì)照帶基本一致，為純合突變個(gè)體（-/-），而在受精24h沒有純合突變個(gè)體（-/-），說(shuō)明實(shí)驗(yàn)成功地沉默了ifi30基因；ifi30是胚胎發(fā)育中的一個(gè)關(guān)鍵基因，ifi30基因突變，使胚胎死亡。

圖6 受精2h樣本突變的檢測(cè)結(jié)果Fig.6 The mutations in 2 h post-fertilization

圖7 受精24h樣本突變的檢測(cè)結(jié)果Fig.7 The mutations in 24 h post-fertilization

3 討論

基因組靶向編輯技術(shù)能使生物基因組DNA中的特定位點(diǎn)發(fā)生改變[13-15]，是研究基因功能的重要工具，用人工核酸酶可以提高基因編輯效率。目前常見的基因敲除系統(tǒng)有3種：ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9。ZFNs和TALENs對(duì)每個(gè)新的DNA靶點(diǎn)必須要經(jīng)過(guò)一個(gè)再加工過(guò)程，費(fèi)時(shí)費(fèi)力[16,17]。與ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9更易于操作，效率更高，更容易得到純合子突變體，可以在不同位點(diǎn)同時(shí)引入多個(gè)突變，僅需對(duì)gRNA進(jìn)行編輯，是目前應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)，已成功應(yīng)用于微生物、動(dòng)植物等諸多物種的基因組改造[8,9]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因突變具有較高的突變率，本試驗(yàn)檢測(cè)了5組注射后的樣本，最高突變率的為95%，最低為79%，平均為87.2%，表現(xiàn)出較高的突變效率。性成熟F0代與野生型AB配組的突變率為30%。注射后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)0代樣本突變率高于F0與野生型配組產(chǎn)生的F1代的突變率，這是由于注射后，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用下，基因組發(fā)生了編輯。注射一般在1細(xì)胞期，但已經(jīng)有部分細(xì)胞已經(jīng)發(fā)育，每個(gè)胚胎的注入位置也不同，在細(xì)胞內(nèi)能發(fā)生基因編輯的位置也不確定，因此只能得到F0代嵌合體。注射24h采用的是整個(gè)胚胎，包含了所有組織的變異，具有較高的突變率。而為了獲得純合系，要選擇生殖細(xì)胞發(fā)生突變，且能夠穩(wěn)定遺傳的突變體。本研究發(fā)現(xiàn)，突變個(gè)體也是僅有部分卵細(xì)胞發(fā)生突變，因此F0代與野生型AB配對(duì)的突變率要遠(yuǎn)低于注射后檢測(cè)的突變率。

本研究用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯ifi30基因。ifi30基因編碼干擾素γ誘導(dǎo)蛋白30，位于斑馬魚2號(hào)染色體上，具有7個(gè)外顯子，全長(zhǎng)1 057bp。靶位點(diǎn)起始于mRNA的第211個(gè)堿基，位于第一外顯子區(qū)域。突變1刪除的5bp，序列在222～226bp，突變2刪除的4bp，序列是223～226bp，均不是3的整數(shù)倍。移碼突變的結(jié)果將引起該段肽鏈的改變，而肽鏈的改變將引起蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變，最終引起性狀的變異，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致個(gè)體的死亡。突變1和突變2均能夠引起移碼突變，且位于第一外顯子能更大程度地影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，達(dá)到沉默基因的效果。對(duì)ifi30基因突變的雜合子觀察未發(fā)現(xiàn)明顯的異常，但ifi30基因突變的純合子在胚胎發(fā)育過(guò)程中死亡。這是由于雜合子還存在完整的ifi30基因，能夠正常翻譯具有功能的干擾素γ誘導(dǎo)蛋白30，因此未見異常。在突變純合子中，ifi30基因不能被翻譯成具有功能的干擾素γ誘導(dǎo)蛋白30，因此胚胎死亡，可見ifi30蛋白是胚胎發(fā)育過(guò)程中必不可少的一種蛋白，能夠參與抗原呈遞和加工，影響對(duì)機(jī)體病毒免疫、腫瘤免疫、寄生蟲的抗原免疫應(yīng)答[4-6]。推測(cè)ifi30基因突變的純合體，造成免疫缺陷，因而在胚胎期發(fā)生死亡。為了進(jìn)一步了解ifi30基因在免疫過(guò)程中發(fā)揮的作用，今后應(yīng)通過(guò)條件性敲除，研究不同發(fā)育階段和不同組織中ifi30基因的功能。

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Knock Out of Interferon-gamma-inducible Gene 30 in Zebrafish by CRISPR/Cas9

CAO Ding-chen,TONG Guang-xiang，LV Wei-hua,SUN Zhi-peng,KUANG You-yi，ZHENG Xian-hu，SUN Xiao-wen
（Heilongjiang Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

The interferon-gamma-inducible protein 30（ifi30）gene,as central regulators of immunity in vertebrates,was knocked out in zebrafish using CRISPR/Cas9 to investigate regulation of the immunity by interferons.The small guide RNAs were designed using CHOPCHOP software to target the first exon of ifi30 gene,and synthesized with PCR.After transcribed in vitro,the mixed mRNAs of guide RNAs and Cas9 were micro-injected into fertilized eggs.The restricted enzyme Pvu II was used for screening genetic mutation in 24hpf embryos,and the mutation rate was found to be ranged from 79%to 95%,with mean value of 87.2%.In order to obtain stable genetic homozygous mutant lines,the F0individuals were crossed with wild type zebrafish,and 3 mutant alleles were identified in F1,in which two alleles（named Mut1 and Mut2）caused frameshifts in ifi30 gene,while the other allele did not cause the stop-gained mutant with 6 bp deletion.The heterozygous individuals with Mut1 and Mut2 alleles were normal in growth and development,while the homozygous embryos with Mut1 and Mut2 allele in F2generation did not develop into larva,the homozygous mutant genotypes only found in survival embryos after 24hpf.The findings suggested that the functional deficiency of ifi30 may result from frame-shift caused death of the embryos during development.

zebrafish;ifi30;CRISPR/Cas9;knock-out

S917

A

1005-3832（2016）06-0026-05

2016-10-11

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2016HY-ZD0301）；農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目（2016-X15）.

曹頂臣（1973-），男，副研究員，從事魚類分子育種研究.E-mail:caodingchen@hrfri.ac.cn

孫效文，研究員.E-mail:sunxw2002@163.com