羊乳制品中牛乳源成分的鑒別檢測(cè)技術(shù)

宋蓓，宋桂雪，宋薇

(譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司，北京 100080)

羊乳制品中牛乳源成分的鑒別檢測(cè)技術(shù)

宋蓓，宋桂雪*，宋薇

(譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司，北京 100080)

羊乳含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)，與其他乳相比營(yíng)養(yǎng)組成最接近母乳。羊乳中的脂肪球小，乳糖含量低，并含有豐富的腺苷三磷酸促進(jìn)乳糖的分解，更適于具有乳糖不耐受癥的亞洲成年人和嬰幼兒飲用。國(guó)內(nèi)外對(duì)羊乳及羊乳粉的需求不斷增長(zhǎng)。然而由于羊乳產(chǎn)量過(guò)低，價(jià)格高，不法商家在羊乳及羊乳制品中容易摻入一些價(jià)格低廉、方便易得的牛乳及牛乳源成分不時(shí)有報(bào)道。為了保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益和健康，規(guī)范市場(chǎng)，避免進(jìn)出口貿(mào)易損失，鑒定純正的羊乳及制品，檢測(cè)其中的摻假牛乳源成分十分迫切。從免疫學(xué)法、色譜法、電泳法、基因檢測(cè)法等方面綜述了目前羊乳及羊乳制品中牛乳源成分鑒別和檢測(cè)技術(shù)。

羊乳;牛乳;乳制品;摻假;檢測(cè)方法

全球?qū)ρ蛉榧把蛉橹破返南M(fèi)量不斷增加，但羊乳產(chǎn)量低，產(chǎn)量隨季節(jié)性波動(dòng)大，其價(jià)格也高，一般是牛乳的兩倍以上。受高額利潤(rùn)的驅(qū)使，違背商業(yè)道德在羊乳中摻入價(jià)格相對(duì)低廉的牛乳來(lái)降低成本，已經(jīng)成了某些廠家的潛規(guī)則。而在歐盟，許多乳液及乳制品注冊(cè)了原產(chǎn)地保護(hù)或者地理標(biāo)志保護(hù)來(lái)保護(hù)其乳產(chǎn)品，尤其是一些由專有地綿羊乳或山羊乳制作的奶酪［11-13］。因此，如何從源頭上杜絕羊乳的摻假現(xiàn)象，以及尋求鑒別羊乳中摻有牛乳的方法，已成為當(dāng)前乳品工業(yè)迫切要解決的問(wèn)題。

目前，不同種類的乳及乳制品的鑒定及檢測(cè)技術(shù)主要有免疫學(xué)法、色譜法、電泳法以及基因檢測(cè)法等。本文從以下幾個(gè)方面闡述了羊乳中牛乳源成分的鑒定和檢測(cè)方法，并簡(jiǎn)要比較了方法之間的優(yōu)缺點(diǎn)。

表1 綿羊、山羊乳和牛乳主要組分的含量Tab．1Main components of goat，ewe and cow milks

表2 羊乳與牛乳的物理特性Tab．2Physical properties of goat and cow milks

1 免疫學(xué)法

近十年來(lái)，隨著特異性抗體制備技術(shù)的成熟，免疫學(xué)法技術(shù)已成為了靈敏、快速和可信度高的檢測(cè)技術(shù)，可用來(lái)檢測(cè)和鑒定不同種類的乳及乳制品［14-15］。免疫分析是使用特定單抗和多功能抗體與乳清蛋白、酪蛋白及酪蛋白肽段發(fā)生特異性反應(yīng)，達(dá)到檢測(cè)目的，其靈敏度可小于0．5%。因酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)成本低，靈敏度高、易于使用，可自動(dòng)化分析實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，在食品分析中應(yīng)用最為廣泛。

ELISA法可以用來(lái)鑒別摻有乳源成分的羊乳以及羊乳制品，例如分析摻有牛乳的綿羊和山羊乳奶酪(摻有0．1%～1%牛乳)，或者摻有山羊乳的綿羊乳奶酪［16］。Beer等［17］和Richter等［18］，利用牛乳中β-乳球蛋白和γ-酪蛋白與羊乳中含量的差異，檢測(cè)出山羊和綿羊奶酪中添加有0．1%的牛乳。López-Calleja等［11］和Hurly等［15］選擇兔抗牛免疫球蛋白G(IgG)為單克隆抗體建立間接ELISA法檢測(cè)山羊、綿羊和水牛乳中未經(jīng)允許添加的低含量牛乳，檢測(cè)限可達(dá)到0．1%。薛海燕等［19］也利用間接ELISA方法，以β-酪蛋白作為基礎(chǔ)，檢測(cè)出羊乳中摻入牛乳，得到相似的結(jié)果，檢出限為4%。

ELISA法適用于鮮乳、巴氏乳及冷凍乳，因?yàn)榕c酪蛋白和其他乳清蛋白相比，IgG不易發(fā)生水解。由于IgG的變性不適用于超高溫瞬時(shí)滅菌(ultra high-temperature sterilized，UHT)的乳和脫脂乳粉，所以，選擇受熱相對(duì)穩(wěn)定的牛乳酪蛋白為抗原制備抗體，可以檢測(cè)UHT后的乳及乳制品中牛乳源成分的存在［15］。ELISA法只適用于單一特定的抗體，而且必須保證所用材料質(zhì)量［17-18，20］;如果食品中含有的配料復(fù)雜，以及其在加工過(guò)程中經(jīng)過(guò)了熱處理，則ELISA法的檢測(cè)效果差［21］。

德國(guó)拜發(fā)R-Biopharm公司利用ELISA法，推出羊乳摻假檢測(cè)的試劑盒，針對(duì)不同摻混的樣品，檢出限分別為0．1%牛乳、0．5%的牛酪蛋白和1%山羊乳，需要注意的是有的試劑盒是針對(duì)未經(jīng)過(guò)高溫加熱處理的原乳。同時(shí)推出利用膠體金的原理，在5 min內(nèi)快速定性檢測(cè)羊乳的快速檢測(cè)試紙條［22］。

2 色譜法

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)主要是利用不同種類乳液中乳清蛋白的保留時(shí)間不同，來(lái)定性不同種類的乳和檢測(cè)其含量。HPLC可以將乳清蛋白中的β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B分離，根據(jù)峰面積定量，可檢出至少10%的牛乳摻入［23］。同樣也可以以酪蛋白為標(biāo)記成分，HPLC法分離牛乳、綿羊乳和山羊乳中的酪蛋白，洗脫后的αs1-酪蛋白和para-κ-酪蛋白用離子交換的方式分離，根據(jù)不同種類的乳或乳制品中αs1-酪蛋白和para-κ-酪蛋白峰面積的差異，可以鑒別乳液種類［16］。反相高效液相色譜法可用于常規(guī)羊乳及羊乳制品中牛乳的檢測(cè)。但由于一些樣品的成分復(fù)雜，目前無(wú)法檢測(cè)出山羊、綿羊和牛三種混合乳中以及山羊和綿羊兩種混合乳中的山羊乳的含量［20］。

2.2.1 家庭和社會(huì)的支持 在使用青霉素治療過(guò)程中常出現(xiàn)吉海反應(yīng)、頭痛等，立即給予心理疏導(dǎo)，鼓勵(lì)家屬陪伴其左右，與其聊天，給予吸氧、多喝水、按摩輸液側(cè)肢體或頭部等，分散患者注意力，癥狀嚴(yán)重者給予藥物治療。

2.2 離子交換色譜法

離子交換色譜法(ion exchange chromatography，IEC)是以離子交換為基礎(chǔ)結(jié)合液相色譜來(lái)快速分析不同種類乳品中的蛋白，適合在實(shí)驗(yàn)室使用。陰離子快速蛋白質(zhì)液相色譜法(anion-exchange fast protein liquid chromatography，anion-exchange FPLC)可以分離出β-酪蛋白、κ-酪蛋白和αs-酪蛋白三種酪蛋白;陽(yáng)離子交換層析法(cation-exchange chromatography)可以鑒定出β-酪蛋白、κ-酪蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白四種酪蛋白。離子交換后的酪蛋白可以與免疫學(xué)法ELISA相結(jié)合，對(duì)乳及乳制品進(jìn)行鑒定，可以最低檢測(cè)到含1%的山羊乳的綿羊乳或綿羊奶酪，并且山羊乳中的αs2-酪蛋白含有最高的免疫活性分?jǐn)?shù)，可能是由于山羊酪蛋白的碎片與數(shù)量最多的抗原表位結(jié)合［24］。

2.3 氣相色譜法

氣相色譜法(gas chromatography，GC)是利用二乙二醇琥珀酸酯作為柱子填料分析甲酯化的山羊乳酥油［25］。羊乳制品中短鏈脂肪酸和中鏈脂肪酸含量較高，但長(zhǎng)鏈脂肪酸含量較低。羊乳制品中C6∶0，C8∶0，C10∶0和C12∶0短中鏈脂肪酸含量均高于牛乳和水牛乳制品，是其他兩種乳制品的2～4倍［25-26］，其中C8∶0直鏈脂肪酸含量的差別最為顯著。長(zhǎng)鏈脂肪酸中，羊乳制品中C16∶0和C18∶0以及不飽和脂肪酸C18∶1和C18∶3含量明顯低于牛乳和水牛乳制品［25］。以此為基礎(chǔ)，可以檢測(cè)羊乳產(chǎn)品中摻入的牛乳。也可以利用十二烷酸∶癸酸(C12∶C10)的比值來(lái)鑒別羊乳以及羊乳制品中其他乳液的摻偽，例如，在牛乳乳酪中C12∶C10的比值為1．16±0．05，山羊乳和山羊乳酪C12∶C10的比值為0．46±0．02，綿羊奶酪中C12∶C10的比值為0．58± 0．05。此方法可以用來(lái)鑒別山羊和綿羊乳及奶酪中牛乳及奶酪的摻入，但鑒別其中其他乳或乳制品的摻入則比較困難［27］。

3 電泳法

3.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳法

聚丙烯酰胺凝膠電泳法(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)通常用來(lái)分析乳制品中的蛋白質(zhì)，它是通過(guò)蛋白帶電荷數(shù)和分子量大小不同導(dǎo)致的遷移速率不同來(lái)分離各種蛋白。PAGE法主要是根據(jù)牛乳中的αs1-酪蛋白為標(biāo)記成分，對(duì)乳制品進(jìn)行鑒定檢測(cè)。其結(jié)果顯示，羊乳中添加牛乳含量越高，αs1-酪蛋白的電泳遷移率越大;但是牛乳和羊乳中β-酪蛋白有相似的電泳遷移率［28］。另外，還可以根據(jù)牛乳酸乳中的para-κ-酪蛋白為標(biāo)記成分，對(duì)羊乳酸乳進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)出摻有1%的牛乳［2］。尿素變性PAGE法(urea-PAGE)的原理同PAGE法，區(qū)別是用電泳技術(shù)分析帶有尿素的聚丙烯酰胺凝膠，該方法可以鑒定牛乳在綿羊乳及奶酪和山羊乳及奶酪中的摻入［29］。例如，牛乳中的αs1-酪蛋白在尿素堿性凝膠媒介中的電泳遷移率比羊乳中移動(dòng)最快的酪蛋白還要高［2，28］。Velsoso等［30］采用尿素變性PAGE法分析出，在奶酪成熟過(guò)程中，綿羊乳中的α-酪蛋白會(huì)被快速水解，并出現(xiàn)較快的電泳遷移率;但是，在牛乳奶酪30天的成熟期間，一直含有酪蛋白。所以，在這30天的成熟期期間，可以利用這個(gè)方法鑒別出10%和20%的牛乳摻入綿羊奶酪中［30］。但是，如果牛乳蛋白質(zhì)被水解或者在已經(jīng)成熟的奶酪中，該方法則無(wú)法鑒定出摻入的牛乳或牛源成分［29］。與HPLC法相比，尿素變性PAGE法靈敏度更高，也可以更早期的檢測(cè)出蛋白質(zhì)水解［30］。

3.2 等電點(diǎn)聚焦法

等電點(diǎn)聚焦法(isoelectric focusing，IEF)是歐盟推薦鑒別和檢測(cè)非牛乳乳制品中含有牛乳的方法［31］。該方法主要用血纖維蛋白溶酶對(duì)乳液及乳制品中的β-酪蛋白水解，對(duì)其水解產(chǎn)物γ2-酪蛋白和γ3-酪蛋白標(biāo)記，并檢測(cè)這兩種酪蛋白的等電點(diǎn)值，不同種類的乳源成分其等電點(diǎn)值不同［31］。例如，牛乳中γ2-酪蛋白和γ3-酪蛋白的等電點(diǎn)分別為7．0和6．5;綿羊和山羊乳中γ2-酪蛋白和γ3-酪蛋白的等電點(diǎn)分別為7．2和6．7［32］。IEF法對(duì)山羊乳和乳制品中摻牛乳的檢出均有很高的靈敏度，牛乳的檢出限可達(dá)到0．5%［33］。但該方法不適用于摻有濃縮的牛乳清蛋白的羊乳。

3.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，CE)是經(jīng)普通電泳改造的無(wú)需載體的電泳法，并且已經(jīng)成功應(yīng)用于乳清蛋白的分析［30］。CE法對(duì)乳中酪蛋白和乳清蛋白均有很高的分辨率，且能準(zhǔn)確定量，快速、簡(jiǎn)單、實(shí)用，已成為乳制品研究中強(qiáng)有力的技術(shù)［20］。De Jong等［34］通過(guò)CE法已可以檢出乳液中摻入的大于1%的牛乳。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(capillary zone electrophoresis，CZE)也用于檢測(cè)摻有8%牛乳的山羊和綿羊的混合乳液中［35］。通過(guò)CZE法分析山羊奶酪中的乳清蛋白時(shí)，可檢測(cè)到其他乳液含2%的牛乳和羊乳奶酪含4%的牛乳［20］。

乳清蛋白也可作為標(biāo)記組分用于摻假檢測(cè)，其中最佳的標(biāo)記組分是山羊乳中的α-乳白蛋白和牛乳中的β-乳球蛋白。該方法對(duì)鮮乳和奶酪中牛乳的最低檢出限分別可達(dá)到2%和4%［20］。

4 基因檢測(cè)法

基因技術(shù)也運(yùn)用在檢測(cè)有機(jī)種類的不同，方法快速、可靠、靈敏度高。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)是一種利用乳中蛋白質(zhì)原有機(jī)體的特殊特異性遺傳物質(zhì)為標(biāo)記，通過(guò)PCR增光檢測(cè)特殊特異性DNA片段來(lái)檢測(cè)外源蛋白，可快速檢測(cè)綿羊和山羊乳中摻加的牛乳源成分。例如，利用擴(kuò)增牛乳中特有的12S rRNA基因上的線粒DNA(mtDNA)，并且在瓊脂糖凝膠上清晰地呈現(xiàn)出聚合酶鏈反應(yīng)物質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果顯示從牛乳中萃取的DNA成功的采用12SM-FW/12SBT-RV引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，并且也得到了期望中的聚合酶鏈反應(yīng)碎片，但在山羊和綿羊乳萃取液中未出現(xiàn)擴(kuò)增物質(zhì)。同時(shí)PCR也可以和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶免疫測(cè)定結(jié)合使用檢測(cè)，最低檢出0．05%的牛乳［26，36］;在羊乳及乳制品中可檢測(cè)出最低摻有10%的水牛乳［8］。也可以檢測(cè)其他種類的DNA，被選中的有效引物可對(duì)作為鑒定牛乳的特定目標(biāo)DNA排序［21］。雙重PCR檢測(cè)可以更準(zhǔn)確的檢測(cè)山羊乳中牛乳的摻入，該法是利用兩對(duì)可以識(shí)別mtDNA環(huán)片段引物，一對(duì)可特異性識(shí)別牛mtDNA片段，另一對(duì)可識(shí)別山羊和牛的mtDNA片段防止假陰性發(fā)生，可檢出不到1%的牛乳源成分［37］。以DNA為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法靈敏性很高，但局限性在于難以準(zhǔn)確定量。主要原因是DNA來(lái)自體細(xì)胞中，而體細(xì)胞的計(jì)數(shù)會(huì)受許多不可控制的因素影響，如，牛是否是處于哺乳期或乳牛是否患有乳腺炎等。

5 結(jié)語(yǔ)

本文所描述的方法均為特異性檢測(cè)方法，可以利用不同種類的乳及乳制品中蛋白質(zhì)具有的千差萬(wàn)別的物理化學(xué)性質(zhì)、檢測(cè)特異性的脂肪酸或不同的脂肪酸比率，來(lái)分離、區(qū)別和鑒定牛及牛源成分摻入羊乳及乳制品中。特異性檢測(cè)方法精確性高，可以定性、定量檢測(cè)，但一次檢測(cè)只能針對(duì)一種乳源蛋白的摻入。乳的酒精實(shí)驗(yàn)依據(jù)乳的物化性質(zhì)和酪蛋白性質(zhì)間接檢測(cè)酸度，如酸度過(guò)高，有沉淀顆粒出現(xiàn)為陽(yáng)性乳。在牛乳中混合68%～70%的酒精可出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，與羊乳混合的酒精含量則較低(58%～60%);但酒精濃度對(duì)羊乳的陽(yáng)性反應(yīng)不穩(wěn)定［38］?，F(xiàn)有鑒定和檢測(cè)羊乳及其乳制品中的牛乳源成分方法多且比較復(fù)雜，建立一種準(zhǔn)確、可靠的鑒定和檢測(cè)方法，對(duì)規(guī)范羊乳乳品工業(yè)，保護(hù)我國(guó)乳品行業(yè)的健康發(fā)展具有十分重要的意義。將來(lái)還應(yīng)考慮開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)快速、無(wú)損、成本低的檢測(cè)方法。

致謝:感謝岳明星博士和技術(shù)部李玉王、趙永彪在本文寫作過(guò)程中的重要貢獻(xiàn)。

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Identification and Detection Techniques of Cow Milk Derived Components in Goat Milk and Its Products

SONG Bei，SONG Guixue*，SONG Wei
(PONY Testing International Group Co Ltd，Beijing 100080，China)

Goat milk and its products contain abundant protein，fat and minerals，their nutritional components of goat milk are considered as the most similar to human milk compared to others．Due to containing smaller fat globules，low lactose and rich adenosine triphosphate(ATP)which facilitates lactose to decompose，goat milk is beneficial for Asian adults，infant and children with lactose intolerance．Consumption of goat milk and its products in home and abroad markets increased significantly，however，because of low production and high prices，some goat milk and its products have been readily adulterated with relatively cheaper cow milk or cow milk derived products．In order to protect consumer interests or health，to regulate the market and to avoid trading losses，it is urgent to identify authentic milk products and determine the amount of adulterated components．This paper summarized recent progresses on identification and detection methods，such as immunological，electrophoretic and chromatographic techniques，of cow milk derived components in goat milk and its products．

goat milk;cow milk;milk product;adulteration;detection method

李寧)

TS252．7

A

10．3969/j．issn．2095-6002．2016．06． 012

2095-6002(2016)06-0069- 06

2015-11- 10

宋蓓，女，助理工程師，碩士，主要從事食品檢測(cè)新方法方面的研究;

*宋桂雪，男，高級(jí)工程師，博士，主要從事食品安全和環(huán)境安全檢測(cè)方法方面的研究。

。

宋蓓，宋桂雪，宋薇．羊乳制品中牛乳源成分的鑒別檢測(cè)技術(shù)［J］．食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2016，34(6):69-74．

SONG Bei，SONG Guixue，SONG Wei．Identification and detection techniques of cow milk derived components in goat milk and its products［J］．Journal of Food Science and Technology，2016，34(6):69-74．