種肖宇

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·綜述與講座·

中性粒細(xì)胞與炎性反應(yīng)

種肖宇

中性粒細(xì)胞(PMN)是機(jī)體非特異性防御反應(yīng)的重要執(zhí)行者，在炎性反應(yīng)中扮演著重要角色。正常情況下，PMN 適時適度發(fā)生凋亡，并以凋亡的方式被機(jī)體及時清除，一方面可以阻止毒性細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，另一方面又可減輕其壞死后釋放的多種酶和毒性物質(zhì)造成的組織損傷， 有利于炎癥的轉(zhuǎn)歸。PMN凋亡延遲，致使大量蛋白酶和氧自由基釋放，是造成對組織損害的主要原因。因此研究PMN凋亡與清除機(jī)制及與PMN相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有助于提高我們對PMN功能的認(rèn)識。

中性粒細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；基因調(diào)控

中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils,PMN)是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，也是最先募集到炎癥區(qū)域發(fā)揮免疫防御的效應(yīng)細(xì)胞之一[1]。PMN富含胞質(zhì)顆粒，這些胞質(zhì)顆粒內(nèi)含有大量的細(xì)胞毒性物質(zhì)，這些細(xì)胞毒性物質(zhì)在殺傷外來入侵的病原微生物的同時也會導(dǎo)致宿主細(xì)胞的炎癥損傷及炎癥相關(guān)性疾病。另一方面，PMN可以通過自發(fā)性凋亡的機(jī)制調(diào)控和減輕炎癥損傷。因此，炎癥部位PMN的水平、功能及其生命周期，影響著炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。明確PMN在炎性反應(yīng)中的作用，適度調(diào)控中性粒細(xì)胞凋亡，對于炎癥的控制與治療有十分重要的意義。本文對PMN在炎性反應(yīng)中的作用及意義做一綜述。

1 PMN的吞噬與殺菌功能

在正常情況下，PMN主要存在于外周血中，并保持靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)炎癥發(fā)生時，依附在血管壁的PMN被炎性因子激活，在趨化因子的作用下，通過內(nèi)皮細(xì)胞遷移到細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層，隨后通過細(xì)胞外基質(zhì)到達(dá)炎癥部位，通過吞噬或殺菌作用清除病原微生物、細(xì)胞碎片和外源性蛋白質(zhì)，并釋放出一些生物活性物質(zhì)(蛋白水解酶、花生四烯酸代謝產(chǎn)物、趨化因子、某些補(bǔ)體成分以及細(xì)胞因子等),吸引更多的炎性細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，增強(qiáng)炎性反應(yīng)以加強(qiáng)機(jī)體清除病原微生物的能力[2,3]。PMN可以通過特異性受體(Toll-樣受體和G-蛋白偶聯(lián)受體)檢測到細(xì)菌的組成成分如脂多糖(LPS)和fMLP，另外黏附分子和趨化因子也是調(diào)節(jié)PMN聚集的重要因子。這些因素使PMN迅速募集到炎癥部位發(fā)揮吞噬殺傷作用。

PMN的殺菌因素主要有氧化性和非氧化性兩類。PMN的非氧化性殺菌主要是通過脫顆粒(degranulation)釋放的殺菌因子(如吞噬素、防御素等)殺滅細(xì)菌，人類PMN的殺菌因子主要分布于嗜天青顆粒的膜上。氧化性殺菌是指有分子氧參與的殺菌過程，細(xì)胞所攝取的分子氧并不直接作用于微生物，起殺菌作用的是活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)。ROS是由多亞基酶復(fù)合物-NADPH氧化酶與分子氧反應(yīng)產(chǎn)生的超氧化物。在PMN發(fā)揮吞噬作用時，PMN的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)會部分內(nèi)陷，可以把細(xì)菌包裹到細(xì)胞中形成吞噬小體。在此過程中局部質(zhì)膜的改變激活了質(zhì)膜上無活性的NADPH氧化酶。NADPH氧化酶催化細(xì)胞攝取的分子氧，使O2進(jìn)行單電子還原，生成超氧陰離子自由基O2ˉ,并進(jìn)一步生成羥基自由基OHˉ、過氧化氫H2O2和單線態(tài)氧，這一過程被稱為呼吸爆炸(respiratory burst)[4]。同時在吞噬過程中，PMN釋放了大量的髓過氧化物酶(MPO)。H2O2在MPO的作用下和鹵化物(主要是氯離子)反應(yīng)，產(chǎn)生有效的抗菌物質(zhì)次氯酸，以上反應(yīng)所生成的ROS及次氯酸與細(xì)菌底物發(fā)生反應(yīng)并將細(xì)菌殺死。因此，吞噬作用與產(chǎn)生ROS和次氯酸是機(jī)體殺傷病原體的重要機(jī)制。

2 PMN的凋亡與清除

PMN向炎癥局灶的浸潤是機(jī)體防御反應(yīng)的重要組成部分。PMN的募集和遷移以及其釋放的細(xì)胞毒性物質(zhì)一方面有利于機(jī)體殺滅病原微生物，另一方面也可能加重炎性反應(yīng)和周圍組織損傷,甚至導(dǎo)致炎癥遷延和慢性化[5]。如果細(xì)胞凋亡或吞噬機(jī)制發(fā)生障礙,PMN在炎癥灶內(nèi)被延遲清除或繼發(fā)壞死，勢必會導(dǎo)致炎癥的持續(xù)和組織損傷增加，甚至?xí)痣y治性疾病。凋亡是炎癥部位細(xì)胞的非炎癥性死亡形式，全面了解PMN凋亡及清除對控制和治療炎癥相關(guān)疾病有至關(guān)重要的作用。

2.1 PMN自發(fā)性凋亡 細(xì)胞的凋亡，指為達(dá)到內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，細(xì)胞在基因的控制下有序的死亡。在發(fā)生機(jī)制上，PMN同其他的血細(xì)胞稍有不同，中性粒細(xì)胞在成熟后的24 h內(nèi)，就啟動它的自發(fā)性凋亡程序(spontaneous apoptosis program)，將在短時間內(nèi)死亡。存在于血液中的中性粒細(xì)胞的半衰期僅為6～8 h，肝臟和脾臟中的巨噬細(xì)胞可以識別并及時清除血液循環(huán)中已經(jīng)凋亡的PMN，附近組織中固有的吞噬細(xì)胞可以將游走于組織中的凋亡的PMN清除[6]，這一過程都不會引起炎性反應(yīng)。

2.2 凋亡PMN的清除 機(jī)體某一部位如果發(fā)生炎癥，存在于這一部位中的PMN將不會再回到血循環(huán)中，只能被清除。炎性反應(yīng)能否消退的必要條件之一就是炎癥部位PMN的快速清除。從機(jī)體內(nèi)清除PMN必須要有巨噬細(xì)胞的介導(dǎo)，已知一些巨噬細(xì)胞受體參與了這個過程。這些分子包括磷脂酰絲氨酸(PS)受體，補(bǔ)體受體，清道夫受體和凝集素，CD14和CD44。

3 PMN凋亡的影響因素

PMN的凋亡是在高度精密調(diào)節(jié)下有序的走向死亡過程，由內(nèi)在和外在機(jī)制共同介導(dǎo)，受自身多基因調(diào)控和眾多細(xì)胞因子及其他多種因素共同作用的一個復(fù)雜的過程。

3.1 PMN 凋亡的自身基因調(diào)控 Bcl-2基因家族被認(rèn)為是參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因。Bcl-2基因家族既有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因(Bax、Bak、Bad)，也有抑制細(xì)胞凋亡的基因(Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A-1 等)，這兩組作用相反的基因相互作用共同對細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)控。Mcl-1位于PMN的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，在衰老凋亡的PMN中，Mcl-1表達(dá)水平迅速下降，同時伴有Mcl-1 mRNA的減少，這表明PMN的凋亡與Mcl-1表達(dá)有關(guān)。從末梢血分離中性粒細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)實驗可以檢測到Bcl-XL 和Mcl-1 基因從高表達(dá)到表達(dá)逐漸低下直至消失,這表明Bcl-XL 和Mcl-1 基因與PMN自發(fā)性凋亡的進(jìn)程有直接關(guān)聯(lián)。A-1 基因穩(wěn)定的表達(dá)于人類的中性粒細(xì)胞。早幼粒細(xì)胞HL-60經(jīng)過全反式維甲酸誘導(dǎo)分化成中性粒細(xì)胞后，A-1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，提示A-1對于PMN凋亡的調(diào)控具有重要作用。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，Bax通過與線粒體的相互作用影響PMN的凋亡[7]。抑制Bax的體內(nèi)裂解會導(dǎo)致炎性反應(yīng)加重，表明Bax是緩解急性炎癥重要物質(zhì)[8]。由上所述，PMN的自發(fā)性凋亡同Bcl- 2 基因家族有極大的關(guān)系。

3.2 PMN 凋亡的分子基礎(chǔ)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

3.2.1 PMN凋亡的caspase 級聯(lián)反應(yīng):Caspase家族是細(xì)胞凋亡的重要參與者。Caspase即半胱天冬酶,是白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE) 家族的總稱。PMN可以表達(dá)多種caspase,包括caspase- 1、caspase- 3、caspase- 4、caspase-8和caspase- 9等。caspase-3的活化是中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡的重要環(huán)節(jié)。Caspase-3、caspase-8 和caspase-9觸發(fā)蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)，活化核酸內(nèi)切酶，使DNA片段化，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的凋亡[9]。Taneja等[10]最近一項研究發(fā)現(xiàn)敗血癥患者體內(nèi)caspase-3和caspase-9的活性顯著降低，從而延長了中性粒細(xì)胞的生命期限，說明了Caspase家族在炎性反應(yīng)中的重要作用。

3.2.2 PMN凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑:PMN凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要包括死亡受體途徑、p38MAPK通路等促進(jìn)PMN凋亡途徑和NF-κB 通路、PI3K- Akt通路、ERK通路等抑制PMN 凋亡途徑。

死亡受體是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族中的一員，包括Fas和TNFR等。死亡受體與死亡配體(FasL、TNFα)結(jié)合后形成死亡信號誘導(dǎo)復(fù)合物，活化caspase家族，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Fas/FasL通路是多種細(xì)胞凋亡的基本信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。人類PMN的表面既表達(dá)Fas(CD95)，也表達(dá)可溶性Fas配體(FasL，CD95L)。Fas介導(dǎo)的PMN的細(xì)胞凋亡可以被 GM-CSF、G-CSF、IFN-γ、TNF-α等抑制，從而顯示出PMN凋亡信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)的復(fù)雜性。PMN表達(dá)兩種TNFR，TNFR1(55-R，CD120a)和TNFR2(75-R，CD120b)，這兩種受體在PMN凋亡過程中的作用稍有不同。TNF-α介導(dǎo)的PMN的凋亡需要 TNFR1參與，TNFR2可以增強(qiáng)TNFR1促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力。用特異性抗體阻斷TNFR1但不阻斷TNFR2，可觀察到PMN凋亡受到了抑制。與Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不同的是TNFR介導(dǎo)細(xì)胞凋亡并不僅僅依靠對caspase的激活[11]。TNFR1 除了介導(dǎo)PMN 凋亡，還可以激活NF-κB，抑制凋亡的發(fā)生。這可以部分解釋TNF-α對PMN凋亡具有雙向調(diào)節(jié)的作用。另外，TNF-α誘導(dǎo)PMN凋亡的能力與ROS的產(chǎn)生有關(guān)，因為慢性肉芽腫(CGD)患者體內(nèi)的PMN在高濃度的TNF-α條件下也無法凋亡。患有TNFR相關(guān)周期性綜合征(TRAPS)的個體存在TNFR缺陷，因此患者體內(nèi)TNF-α介導(dǎo)的PMN會逐漸凋亡直至減少[12]。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)屬于細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶，MAPK的激活參與細(xì)胞凋亡的內(nèi)在過程。已知MAPK有三種，包括 p38MAPK和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)，以及活化蛋白激酶/氨基端激酶(SAPK/JNKc-Jun)。ERK 和p38MAPK 參與調(diào)控PMN凋亡，p38MAPK 的激活可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ERK的激活后則抑制細(xì)胞凋亡。ERK 和p38MAPK 這兩種調(diào)節(jié)途徑是相互促進(jìn)相互制約的關(guān)系。

NF-κB參與炎性介質(zhì)導(dǎo)致的PMN 凋亡延遲。LPS、TNF等多種因素能激活NF-κB 從而抑制PMN凋亡[13]。NF-κB活化后可促進(jìn)促炎因子(IL-6、IL-8)和趨化素(MIP-2)的表達(dá)，從而達(dá)到誘導(dǎo)PMN 趨化因子和黏附分子的分泌與釋放的目的，進(jìn)而可以抑制PMN的凋亡過程。NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞可以表達(dá)TNFR1結(jié)合因子及凋亡抑制蛋白，阻斷由死亡受體TNFRI及Fas 介導(dǎo)的凋亡信號的傳導(dǎo)，抑制細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。同時NF-κB 也可以直接阻斷Caspase-8，并且可以由此來抑制一系列Caspase 的活化，這也是其抗凋亡的重要機(jī)制[14,15]。A-1 基因上存在NF-κB結(jié)合序列，NF-κB活化可通過調(diào)控A-1基因的表達(dá)來抑制PMN 凋亡。由上可見， NF-κB是PMN 凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)信號通路是細(xì)胞內(nèi)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其作用機(jī)制是通過活化信號通路下游的多種效應(yīng)分子來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡。Akt是PI3K 信號通路中最主要的靶酶。激活A(yù)kt可以使Bad、caspase-9、caspase-3、糖原合酶激酶-3等下游底物達(dá)到磷酸化從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。PI3K-Akt能直接或間接影響轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB、p53 等)來調(diào)控細(xì)胞凋亡[16]。另外，PI3K-Akt途徑參與了GM-CSF依賴的PMN凋亡抑制。

3.3 PMN凋亡的其他影響因素 許多炎癥相關(guān)的因子可以影響中性粒細(xì)胞自發(fā)性的凋亡進(jìn)程。細(xì)胞因子如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF、G-CSF 等可抑制PMN的自發(fā)性凋亡，其中GM-CSF的抑制作用最強(qiáng)。GM-CSF和G-CSF可以使PMN保持其趨化和吞噬能力，表明抑制細(xì)胞凋亡與PMN功能的保護(hù)相關(guān)[17]。另一些因子如TNF-α和IL-10等可加速PMN凋亡。PMN吞噬細(xì)菌后產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和趨化因子參與炎性反應(yīng)，這些因子的產(chǎn)生與基因表達(dá)水平有關(guān)。

PMN 的凋亡與細(xì)胞保持氧化劑-抗氧化劑平衡能力相關(guān) ，ROS和氧化應(yīng)激可以通過破壞線粒體膜導(dǎo)致PMN的凋亡。如果細(xì)胞內(nèi)H2O2減少，則PMN的凋亡進(jìn)程將會受到明顯的抑制，氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的ROS可能是PMN 凋亡的重要原因。氧化劑能夠降低細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防衛(wèi)系統(tǒng)的功能，介導(dǎo)PMN凋亡的啟動過程。

4 PMN自發(fā)性凋亡的調(diào)控對于炎性反應(yīng)的意義

PMN對微生物最初的吞噬作用可以上調(diào)PMN編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄，在急性炎性反應(yīng)中起重要作用，是抵御微生物入侵的關(guān)鍵。然而，一旦PMN吞噬微生物后，開始逐漸喪失其生物學(xué)功能并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[18,19]。一般情況下，初級PMN的功能包括趨化、吞噬作用、生成超氧物質(zhì)和脫顆粒，這些功能隨著細(xì)胞凋亡而逐漸喪失[20]。

凋亡的PMN不僅會喪失其生物學(xué)功能，還更加容易被吞噬細(xì)胞識別并吞噬。同時吞噬細(xì)胞在吞噬大量凋亡PMN后，其自身的產(chǎn)生和釋放促炎介質(zhì)的功能將會受到抑制。所以，炎癥部位中的PMN凋亡和清除之間保持著動態(tài)平衡，這樣既減少了炎癥部位由于PMN的過度激活和聚集而加重炎性反應(yīng)，同時又可以避免凋亡的PMN發(fā)生繼發(fā)性壞死并釋放毒性內(nèi)容物引起的組織損傷。由此可知，PMN的自發(fā)性凋亡是介導(dǎo)炎性反應(yīng)終止的重要生物步驟，是炎癥無損傷收斂的重要機(jī)制之一[21]。

作為非炎性清除PMN的主要方式，凋亡啟動的時機(jī)和程度決定了炎性反應(yīng)的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。因此，人為地調(diào)控PMN 凋亡有利于監(jiān)測與調(diào)節(jié)機(jī)體的炎性反應(yīng)。隨著對PMN自發(fā)性凋亡研究的不斷深入，我們可以通過誘導(dǎo)機(jī)制來加速PMN的凋亡或通過給予特異性藥物來達(dá)到增強(qiáng)吞噬細(xì)胞清除凋亡PMN的能力，為炎癥的治療提供更為合理的方案。

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