楊育紅，田衛(wèi)花,2△，張邦能，周思彤，邢福軍,2，馬文媛，楊邵華

(1.甘肅省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅蘭州730050；2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅蘭州 730050)

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·論著·

3種抗雙鏈DNA抗體檢測方法比較及其聯(lián)合檢測對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷價值研究*

楊育紅1，田衛(wèi)花1,2△，張邦能1，周思彤1，邢福軍1,2，馬文媛1，楊邵華1

(1.甘肅省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅蘭州730050；2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅蘭州 730050)

摘要:目的分析間接免疫熒光法(IIF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫印跡法(IBT)檢測抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體的差異，以及聯(lián)合檢測在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)診斷中的應(yīng)用價值。方法選取2012年1月至2015年3月確診的SLE患者50例，以及同期其他自身免疫病(AID)患者100例和體檢健康者100例。分別采用3種方法檢測其血清抗dsDNA抗體，比較3種方法的靈敏度與特異度，并分析3種方法聯(lián)合檢測的靈敏度與特異度。結(jié)果IIF法特異度(99.5%)最高，ELISA法靈敏度(74.0%)最高。IIF與ELISA法、IIF與IBT法、ELISA與IBT法檢測SLE患者抗dsDNA抗體的檢出率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為11.435、13.994、4.539，P<0.05)；且一致性檢驗(yàn)的Kappa值(κ)分別為0.411、0.522、0.278。3種方法串聯(lián)檢測特異度提高到99.5%，并聯(lián)檢測的靈敏度提高到82.0%。結(jié)論3種檢測抗dsDNA抗體的方法中，IIF特異度最高，ELISA靈敏度最高，聯(lián)合檢測可提高檢測靈敏度與特異度。

關(guān)鍵詞:系統(tǒng)性紅斑狼瘡；抗雙鏈DNA抗體；間接免疫熒光法；酶聯(lián)免疫吸附法；免疫印跡法

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種多因素引起的，累及多器官、多系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病，好發(fā)于年輕女性，臨床表現(xiàn)多樣，體內(nèi)出現(xiàn)多種自身抗體為其重要特征[1-2]。有研究報道，患者體內(nèi)存在針對各種核酸、核蛋白和組蛋白的抗核抗體及其他自身抗體，因而實(shí)驗(yàn)室診斷SLE主要檢測抗核抗體(ANA)、抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體、抗Smith抗體、抗核糖體P蛋白、抗核小體抗體和抗組蛋白抗體等[3-4]。由于抗dsDNA抗體對SLE的特異度較高，因此被用于SLE的臨床診斷[5]。目前臨床實(shí)驗(yàn)室檢測抗dsDNA抗體的方法主要有間接免疫熒光法(IIF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫印跡法(IBT)和放射免疫法(Farr)等，其靈敏度和特異度各有區(qū)別。由于Farr會造成環(huán)境污染，且對人體危害較大，故已逐漸被其他方法取代。因此，本文主要比較前3種方法的檢測效果并分析其聯(lián)合檢測的意義。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料SLE組：2012年1月至2015年3月甘肅省中醫(yī)院風(fēng)濕骨病科和腎病科住院SLE患者50例，男1例，女49例；年齡15～50歲；均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(ACR)2009年修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。其他自身免疫病(AID)組：同期該院住院及門診的其他AID患者100例，男20例，女80例；年齡20～70歲；其中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者69例，原發(fā)性干燥綜合征(pSS)15例，系統(tǒng)性硬化癥3例，強(qiáng)直性脊柱炎13例，診斷均符合相應(yīng)的國際診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照組：同期在該院做健康體檢的健康者100例，排除感染、急慢性腎炎、急慢性腎盂腎炎和各種AID患者。

1.2儀器與試劑抗dsDNA抗體IIF、ELISA和IBT試劑盒均為德國歐蒙公司產(chǎn)品，均提供質(zhì)控血清。MK2洗板機(jī)(芬蘭雷勃公司)，RT-6100 酶標(biāo)分析儀(美國雷杜公司)，TS-8轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司)，BX43熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集抽取所有受試者清晨空腹靜脈血3～5 mL，離心后血清標(biāo)本儲存于-70 ℃冰箱。

1.3.2綠蠅短膜蟲(CL)IIF法檢測抗dsDNA抗體按試劑盒操作說明將血清用磷酸鹽緩沖液(PBS)-吐溫(Tween)進(jìn)行1∶10稀釋，按照操作說明加入加樣板上，并設(shè)陰、陽對照，加蓋基質(zhì)片。試驗(yàn)完成后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察CL動基體有無特異性熒光染色，滴度大于或等于1∶10判為陽性。

1.3.3ELISA法檢測抗dsDNA抗體按試劑盒操作說明將患者血清進(jìn)行1∶201稀釋，并按照操作說明依次加入3個水平的標(biāo)準(zhǔn)血清、陰性及陽性對照、稀釋后的患者血清，反應(yīng)完成后濃度大于或等于100 IU/mL判為陽性。

1.3.4IBT法檢測抗dsDNA抗體按試劑盒操作說明進(jìn)行試驗(yàn)，反應(yīng)膜在特定位置出現(xiàn)肉眼可見的與質(zhì)控條帶色澤相同的顯示帶，判斷為陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，不同方法間陽性檢出率比較采用配對四格表資料的χ2檢驗(yàn)；計算Kappa值(κ)做一致性分析，κ≤0.40表明一致性較差，0.40<κ≤0.60表明中度一致，0.60<κ≤0.80表明有較高的一致性，κ>0.80表明有極好的一致性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1IIF法檢測抗dsDNA抗體陰、陽性當(dāng)被檢測血清中存在抗dsDNA抗體，在熒光顯微鏡下可觀察到CL的動基體呈現(xiàn)特異性熒光染色；陰性時CL的動基體無特異性熒光染色，但蟲體輪廓隱約可見。見圖1～3(見《國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.23種方法檢測抗dsDNA抗體用IIF、ELISA及IBT法對250份標(biāo)本進(jìn)行檢測，ELISA法的陽性檢出率最高(74%)，IIF法的陽性檢出率最低(48%)。3種檢測方法檢測各組的抗dsDNA抗體陽性率，見表1。以SLE組患者例數(shù)為基數(shù)，對3種方法的靈敏度進(jìn)行評價，以其他AID組和對照組例數(shù)之和作為基數(shù)計算各種方法檢測的特異度，見表2。

2.33種方法檢測SLE患者抗dsDNA抗體的相關(guān)性與一致性比較IIF法與ELISA法陽性檢出率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.435，P<0.05)，兩種方法中度一致(κ=0.411)； IIF法與IBT法陽性檢出率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.994，P<0.05)，兩種方法中度一致(κ=0.522)；ELISA法與IBT法陽性檢出率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.539，P<0.05)，兩種方法一致性較差(κ=0.278)。見表3～5。

2.43種方法聯(lián)合檢測抗dsDNA抗體的效能3種方法串聯(lián)檢測抗dsDNA抗體的特異度提高到99.5%，但靈敏度下降為38.0%；而3種方法并聯(lián)檢測的靈敏度提高到82.0%，特異度下降為86.0%。3種方法聯(lián)合檢測抗dsDNA抗體結(jié)果，見表6。

3討論

1957年Ceppelini等[6]報道SLE患者血清中存在DNA反應(yīng)的成分。目前抗dsDNA抗體是公認(rèn)的SLE高度特異性抗體，特異度可達(dá)95%～100%，被列為SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，與疾病活動性關(guān)系密切，其抗體效價隨疾病的活動而上升，緩解而下降，可用于監(jiān)測SLE的病情變化、判斷疾病活動期及觀察藥物治療效果等[7]。

目前，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于檢測抗dsDNA抗體的方法多樣，主要包括IIF、ELISA、IBT和Farr法，且各有利弊。其中Farr法出現(xiàn)最早，具有只結(jié)合高親和力抗體的獨(dú)特優(yōu)勢，其特異性好，曾被列為檢測抗dsDNA抗體的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，該方法具有放射性、檢測周期長，易受到血清中高親和力免疫球蛋白M(IgM)的干擾且不能自動化，現(xiàn)在已經(jīng)很少采用[8-10]。本研究選擇了IIF、ELISA和IBT法對250份血清標(biāo)本進(jìn)行了抗dsDNA抗體檢測，并對其檢測效能進(jìn)行了分析。其中，IIF法特異度(99.5%)最高，靈敏度(48.0%)最低；ELISA法靈敏度高，可達(dá)74.0%；IBT法的特異度和靈敏度均不高。

同時，筆者對IIF與ELISA法、IIF與IBT法、ELISA與IBT法檢測SLE患者抗dsDNA抗體的檢出率進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為11.435、13.994、4.539，P<0.05)。對3種方法進(jìn)行一致性分析，結(jié)果顯示IIF與ELISA法、IIF法與IBT法呈現(xiàn)中度一致，而ELISA與IBT法一致性較差。這可能與抗dsDNA抗體存在高親和力和低親和力兩種特異性抗體有關(guān)。低親和力抗dsDNA抗體除存在于SLE患者體內(nèi)外，也存在于其他AID患者體內(nèi)，對SLE的診斷價值低；而高親和力抗dsDNA抗體對SLE有較好的特異性。各種檢測方法對上述兩種抗dsDNA抗體的檢測適應(yīng)性不同。ELISA法適宜檢測低親和力抗dsDNA抗體，IIF法適宜檢測高親和力抗dsDNA抗體[11-12]。本研究還顯示，3種方法串聯(lián)檢測抗dsDNA抗體的特異度提高，但靈敏度下降；而3種方法并聯(lián)檢測的靈敏度提高，特異度下降。

綜上所述，3種方法單獨(dú)檢測抗dsDNA抗體均存在不足之處，且3種方法的相關(guān)性與一致性不是很理想，而3種方法聯(lián)合檢測對SLE診斷具有重要的臨床意義，可以提高檢測特異度與靈敏度，從而很大程度上避免誤診與漏診的發(fā)生。

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Study on comparation of three methods for anti-double-stranded DNA antibody and diagnostic value of joint detection in systemic lupus erythematosus*

YangYuhong1，TianWeihua1,2△，ZhangBangneng1，ZhouSitong1，

XingFujun1,2，MaWenyuan1，YangShaohua1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,GansuProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Lanzhou,Gansu730050,China;2.TraditionalChineseMedicineInstituteofGansuProvince,Lanzhou,Gansu730050,China)

Abstract:ObjectiveTo analyse the differences of indirect immuno-fluorescence(IIF),enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) and immunoblotting technique(IBT) for the determination of anti-dsDNA antibody,and evaluate the value of joint detection of the three methods for diagnosing systemic lupus erythematosus(SLE).MethodsFrom January 2012 to March 2015,50 cases of patients with SLE,100 cases of patients with other autoimmune disease(AID)and 100 healthy individuals were selected.Serum levels of anti-dsDNA antibody were detected by using IIF,ELISA and IBT respectively.Then,compared the sensitivity and specificity of the three methods,and analysed the sensitivity and specificity of joint detection.ResultsThe IIF method had the highest specificity(99.5%),while ELISA had the highest sensitivity(74.0%).There were statistically significant differences in the positive detection rates of serum anti-dsDNA antibody in patients with SLE between IIF and ELISA,IIF and IRT,ELISA and IBT(χ2values were 11.435,13.994 and 4.539;P<0.05),and the Kappa values were 0.411,0.522 and 0.278 respectively.The specificity of three methods joint in series was increased to 99.5%,and the sensitivity of parallel combined detection of the three methods was increased to 82.0%.ConclusionAmong the three methods for detecting anti-dsDNA antibody,ELISA has the highest sensitivity,and IIF has the highest specificity.Moreover,joint detection could increase the sensitivity and specificity．

Key words:systemic lupus erythematosus；anti-double-stranded DNA antibody；indirect immuno-fluorescence；enzyme-linked immunosorbent assay；immunoblotting technique

基金項(xiàng)目：甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計劃管理項(xiàng)目(GWGL2013-1)。

作者簡介：楊育紅，女，主管檢驗(yàn)師，主要從事免疫學(xué)檢驗(yàn)的研究。 △通訊作者，E-mail：tianwh05@163.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.005

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0588-03

(收稿日期：2015-11-26)