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·綜述·

PCR技術(shù)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用及其研究進(jìn)展

趙海歌1，丑廣程2，陳占良2，王建國2，段琳2綜述，王淑仙2△審校

(1.河北大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院研究生院，河北保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，河北保定 071000)

關(guān)鍵詞:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；綜述

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的自身免疫性疾病，據(jù)不完全統(tǒng)計,我國有300萬人以上患有RA，其發(fā)病率為0.3%~0.6%。RA發(fā)病原因尚不清楚，現(xiàn)認(rèn)為其發(fā)病原因有感染因素、遺傳因素和免疫因素，以慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。RA診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、X射線檢查及類風(fēng)濕因子(RF)檢測。隨著免疫技術(shù)的不斷發(fā)展，許多自身抗體廣泛應(yīng)用于RA的診斷，主要應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗體(AKP)、抗環(huán)瓜氨酸抗體(抗CCP抗體)，以及其RF分型(IgG、IgM、IgA)。這些檢查可以提供早期診斷依據(jù)，提高患者疾病的治愈率。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可以直接從基因水平檢測疾病，提供更可靠的特異性的臨床診斷依據(jù)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是體外擴(kuò)增DNA的技術(shù)，它的研究已經(jīng)有很長的發(fā)展歷史，1985年美國科學(xué)家申請了有關(guān)PCR的第一個專利，在science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學(xué)術(shù)論文，從此PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同。但是最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，但是Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變形時會導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴(kuò)增反應(yīng)周期，這使操作程序更加復(fù)雜化。1988年初，有研究者改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，其擴(kuò)增的產(chǎn)物具有均一性，但是每循環(huán)一次也需要重新加入酶。1988年有研究者提取出了TaqDNA酶，此酶耐高溫在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加入新酶，從而極大地提高了PCR擴(kuò)增效率。在此之后，PCR方法不斷被改進(jìn)，很多新技術(shù)不斷發(fā)展，比如具有3′→5′修復(fù)活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶代替之前不具有3′→5′修復(fù)活性的DNA聚合酶。此外，在基礎(chǔ)原理上發(fā)展了新的技術(shù)，比如后來的反轉(zhuǎn)錄PCR、定量PCR及芯片PCR等新技術(shù)。本文就PCR技術(shù)在RA中的應(yīng)用與發(fā)展做一簡單綜述。

1PCR-SSO反向雜交法和PCR-SSP法在RA中的應(yīng)用

PCR-SSO即PCR序列特異性寡核苷酸擴(kuò)增分析，其基本檢測原理是順序特異性寡核苷酸作為探針，用同位素或者是非放射性核素標(biāo)記，然后與PCR擴(kuò)增的目標(biāo)產(chǎn)物片段雜交，根據(jù)陽性斑點判斷基因型。此種方法如果在基因型較多時需要數(shù)量較多的探針對每個DNA進(jìn)行多次雜交，操作繁瑣，所以后來在此基礎(chǔ)上形成了PCR-SSO反向雜交技術(shù)，即將各種不同的探針固定于同一張陌上，再將PCR產(chǎn)物標(biāo)記，以PCR產(chǎn)物(待測基因DNA)反過來與探針雜交。這樣一次即可完成多個等位基因分析，此種方法靈敏度高、特異度強(qiáng)、需要樣本量少。

PCR-SSP即PCR序列特異性引物，其基本檢測原理是設(shè)計出特異性引物，借助PCR獲得的特異性產(chǎn)物，可通過電泳分析帶型決定基因的型別，這極大地簡化了實驗操作步驟，簡單易行。PCR-SSO和PCR-SSP主要用于基因分型的研究，下面介紹這兩種方法在RA患者中的應(yīng)用。

人類白細(xì)胞分化抗原(HLA)-DR4為RA的易感因素[1],HLA-DR4攜帶者在一些細(xì)小病毒等病原體感染時，可在短期內(nèi)發(fā)展成RA，這較HLA-DR陰性者時間短，朱乃碩等[2]用PCR-SSO法研究發(fā)現(xiàn)RA患者HLA-DR4表達(dá)率要高于健康對照組。后來研究發(fā)現(xiàn)CD25和CD28等共刺激分子也可能與RA的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[3-4]。顧國浩等[5]用PCR-SSP研究發(fā)現(xiàn)HLA-DR4陽性的活動性RA患者的活動度明顯高于HLA-DR4陰性者,表現(xiàn)為C反應(yīng)蛋白(CRP)顯著增高者高達(dá)78.6%,另外HLA-DR4陽性RA患者以IgG、IgA增高為主,而HLA-DR4陰性者則以IgM增高為主，提示HLA-DR4基因與RA發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，這與朱乃碩等[2]的研究結(jié)果相似。活性T細(xì)胞,尤其是細(xì)胞毒性T細(xì)胞在RA的病理損傷中起重要作用,而共刺激分子CD28在T細(xì)胞特異性激活中是不可缺少的[6-7]，CD25是白細(xì)胞介素2受體α(IL-2Rα)分子,主要分布于活化T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上,白細(xì)胞介素-2(IL-2)與之結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)活性。顧國浩等[5]研究發(fā)現(xiàn)活動性RA患者CD28+細(xì)胞百分比明顯低于健康對照組，提示CD28分子在RA的免疫失調(diào)和關(guān)節(jié)炎癥中起重要作用，活動性RA患者CD25+淋巴細(xì)胞明顯增高,表明患者淋巴細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)[3],活動性RA患者CD25表達(dá)上升而CD28表達(dá)下降[4]。

通過以上幾種指標(biāo)可以看出用這兩種方法可以從基因水平檢測與RA相關(guān)的因素但是這兩種方法各有優(yōu)缺點。PCR-SSP和PCR-SSO在操作時標(biāo)本需要量不多，但是需要大量的試劑，PCR-SSO在分析時檢測成本高，PCR-SSP在檢測時不易自動化，重復(fù)實驗需要重提DNA且必須使用紫外凝膠成像儀保留原始資料極大地增加了實驗成本。并且兩者在HLA基因分型時不能識別非經(jīng)典的HLA,所以這些基因是否與RA有關(guān)需要進(jìn)一步研究。

2差異顯示PCR在RA患者中的應(yīng)用

高等動物在生命活動過程中，由于基因的選擇性表達(dá)、各種物理化學(xué)因素導(dǎo)致的突變及生理因素等會導(dǎo)致基因表達(dá)圖譜的差異。分析比較不同條件下基因表達(dá)差異能夠幫助了解組織分化發(fā)育及疾病的發(fā)生機(jī)制。

差異顯示PCR技術(shù)是將隨機(jī)引物和錨定cDNA的引物結(jié)合使用，利用一系列的oligo(dT)引物，逆轉(zhuǎn)錄真核生物細(xì)胞中全部表達(dá)的mRNA，通過PCR擴(kuò)增的方法，轉(zhuǎn)換成cDNA雙鏈，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將有差異的片段分開，篩選出目的基因.

基因在不同組織細(xì)胞中的表達(dá)有差異，在細(xì)胞的不同階段和狀態(tài)中的表達(dá)也有差異，研究基因表達(dá)譜的變化有助于理解細(xì)胞分化、增生、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)和細(xì)胞衰老凋亡的過程。差異顯示PCR(DD-PCR)是一種以反轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達(dá)差異的技術(shù)，可用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳學(xué)研究，是篩選差異表達(dá)基因的有效方法。DD-PCR基本原理是取兩種從不同組織或細(xì)胞中分離出來的細(xì)胞質(zhì)RNA或mRNA做為模板，利用可能的12種不同序列的寡核苷酸作為引物oligo(dT)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄合成的12種互補(bǔ)DNA(cDNA)幾乎代表真核生物某一特定細(xì)胞中所有mRNA，通過PCR擴(kuò)增的方法，轉(zhuǎn)換成cDNA雙鏈，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將有差異的片段分開，篩選出目的基因。DD-PCR是篩選差異表達(dá)基因比較有效的方法之一。有研究者設(shè)計的第三代DD-PCR引物中,5′端引物為8種,3′引物仍為3種,它們的組合(共24組)將覆蓋所有的mRNA序列[8-9],利用DD-PCR對RA患者滑膜細(xì)胞基因進(jìn)行分析。

王吉村等[10]用差示PCR技術(shù)檢測RA患者滑膜細(xì)胞中高表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜細(xì)胞高表達(dá)HSP70，并且這與Schett等[11]用免疫組化研究的結(jié)果一致,他們認(rèn)為,這是由于在炎性因子或切力作用下,滑膜細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白因子-1的轉(zhuǎn)錄活性增高所致。王夏[12]用實時熒光定量PCR在研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基因表達(dá)時發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白(UPR) 通路基因 ATF6，IRE1 表達(dá)水平與病程呈正相關(guān)。之前也有研究表明蛋白熱休克蛋白(HSPs)和 ER 伴侶分子如免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP)被證明能激發(fā) B 和T 細(xì)胞免疫活性。在RA患者，滑膜組織內(nèi)過度表達(dá)的 BIP 對滑膜 T 細(xì)胞有高度的選擇性[13-14]。同時研究者還用差示PCR技術(shù)檢測了RA患者體內(nèi)的蛋白酶B基因，發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜細(xì)胞高表達(dá)組織蛋白酶B的基因[10]。 這些研究結(jié)果都表明DD-PCR是篩選差異表達(dá)基因比較有效的方法之一。

3反轉(zhuǎn)錄PCR在RA患者中的應(yīng)用

反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)是一種以細(xì)胞內(nèi)總RNA或者mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。由于PCR中的耐熱的DNA酶(Taq酶)不能以RNA或mRNA為模板，所以首先要對RNA或mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成與之互補(bǔ)的cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。RNA、DNA印跡雜交技術(shù)、原位雜交組化的進(jìn)行,提取RNA需標(biāo)本劑量大、細(xì)胞數(shù)多,一般外周血需50 mL分離淋巴細(xì)胞方可提取RNA,進(jìn)行RNA電泳后轉(zhuǎn)膜雜交。有研究者應(yīng)用經(jīng)典的RNA印跡雜交和RT-PCR兩種技術(shù)進(jìn)行實驗,表明RT-PCR與RNA印跡方法完全具有可比性、相似性,認(rèn)為RT-PCR是研究基因表達(dá)高效、敏感的方法,且所需RNA量極少。

林琳[15]用RT-PCR檢測RA患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)mRNA的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)在RA患者PBMC中IL-17AmRNA 的表達(dá)水平明顯增高并與疾病活動程度呈正相關(guān)。有研究者在實驗中發(fā)現(xiàn)RA患者關(guān)節(jié)滑液中白細(xì)胞介素-17(IL-17)水平明顯高于骨性關(guān)節(jié)炎患者滑液中水平[16]。通過一系列細(xì)胞因子的作用,IL-17上調(diào)了Cyr61表達(dá)，參與慢性炎性反應(yīng)[17-18],增強(qiáng)了RA關(guān)節(jié)的膠原破壞和重新合成、骨質(zhì)的破壞及關(guān)節(jié)軟骨的破壞[19]。孟明等[20]研究表明RA患者外周血中iNKT細(xì)胞頻率與干擾素-γ(IFN-γ)/白細(xì)胞介素-4(IL-4)比值呈負(fù)相關(guān)。裴明等[21]用RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)RA患者的滑膜中高度表達(dá)白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(IL-1Ra)。這表明細(xì)胞因子在RA患者發(fā)病中起著重要作用，可以用RT-PCR準(zhǔn)確高效地檢測出過度表達(dá)的異常相關(guān)基因，可分析mRNA是否異常及是否由其導(dǎo)致基因表達(dá)異常，可直接從基因水平顯示與RA的相關(guān)因素。

基于RT-PCR技術(shù)的原理，Yamamoto等[22]建立了一種分析T細(xì)胞克隆型的方法,即RT-PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)。SSCP可以檢測DNA序列之間的不同，進(jìn)行DNA序列差異分析，在非變性條件下，單鏈DNA可自身折疊呈現(xiàn)一種由內(nèi)部分子相互作用形成的三維構(gòu)象，這種構(gòu)象由單鏈DNA分子內(nèi)的堿基順序決定，它影響了DNA在非變性凝膠中的遷移率。相同長度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝膠中的不同遷移率而被分離。遷移率不同的條帶可被銀染或者熒光標(biāo)記引物檢測，然后用DNA自動測序進(jìn)行分析。RT-PCR/SSCP法是根據(jù)不同T細(xì)胞受體(TCR)β鏈V區(qū)中CDR3堿基序列的不同,來分析T細(xì)胞克隆型。其不同于常用的在體外建立抗原特異性T細(xì)胞克隆后,再分析T細(xì)胞克隆型方法的優(yōu)點是,即使在特異性抗原不明的情況下,也能直接分析體內(nèi)聚集的T細(xì)胞克隆型。趙文明等[23]采用RT-PCR/SSCP法,比較分析一種自發(fā)性RA小鼠模型-SKG小鼠(發(fā)病初期與后期關(guān)節(jié)內(nèi)聚集的T細(xì)胞克隆型的變化,結(jié)果顯示SKG小鼠自發(fā)性關(guān)節(jié)炎動物模型與TCR Vβ2和Vβ8.2的T細(xì)胞克隆型關(guān)系密切。此前有研究報道人的RA與TCR Vβ3、Vβ4、Vβ17,Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠RA模型與TCR Vβ8.2、Vβ4、Vβ17,Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的小鼠RA模型與TCRVβ2、Vβ5、Vβ8 T細(xì)胞克隆型關(guān)系密切[24-25]。這些研究結(jié)果均顯示某些TCR Vβ型的T細(xì)胞與RA的發(fā)展密切相關(guān)。RA的自身抗原不明確，而RT-PCR/SSCP的主要優(yōu)點就是在特異性抗原不明的情況下,也能直接分析體內(nèi)聚集的T細(xì)胞克隆型，所以RT-PCR/SSCP很適合用于對RA患者的T細(xì)胞克隆分型分析。

4定量PCR在RA中的檢測應(yīng)用

近年來定量PCR廣泛用于檢測RA患者中基因水平的異常。定量PCR有熒光定量PCR(FQ-PCR)又稱為實時PCR,還包括水解探針(TaqMan probe)技術(shù)、雜交探針技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)。

FQ-PCR的基本原理是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法,在PCR反應(yīng)體系中加入SYBR GreenⅠ染料，該染料能選擇性地?fù)饺胫彪p連DNA分子中，并且產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，熒光信號的檢測在每一個循環(huán)的延伸期完成后進(jìn)行，其結(jié)合的熒光信號與DNA水平成正比。

焦志軍等[26]用定量PCR檢測RA患者外周血中單個核細(xì)胞Notch基因表達(dá),結(jié)果顯示RA患者外周血中存在一群高表達(dá)Notch3的活化T細(xì)胞。之后焦志軍等[27]用流式細(xì)胞術(shù)和定量PCR技術(shù)，分別在蛋白質(zhì)水平和mRNA表達(dá)水平檢測FoxP3表達(dá)，其研究結(jié)果顯示RA活動期時CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞明顯減少,這群調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能參與了RA病理進(jìn)程。曹新國等[28]用套式實時定量PCR技術(shù)檢測外周血單核細(xì)胞中FOXP3+mRNA基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量與FOXP3+mRNA基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。與此類似,Zappia等[29]在研究幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)時也發(fā)現(xiàn),患者外周血中CD4+CD25+數(shù)量少于健康人,而病情較輕或有自限傾向的患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)相對較高且表達(dá)較多的FoxP3基因，這些結(jié)果表明T細(xì)胞在RA發(fā)病過程中具有重要病理作用，研究其具體作用機(jī)制對RA的病因研究和治療具有重要作用。荀春華等[30]用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測miRNA-146a在RA患者外周血單個核細(xì)胞表達(dá)水平，并且同時用免疫法檢測血清CRP、RF、IL-17、 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，分析RA患者外周血單個核細(xì)胞miRNA-146a表達(dá)水平與血清CRP、RF、IL-17、TNF- α水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示RA患者外周血單個核細(xì)胞的miRNA-146a高表達(dá)，且與血清CRP、IL-17、TNF- α水平呈明顯正相關(guān)。Kong等[31]的研究發(fā)現(xiàn)Sirt1 可以抑制核因子 κB(NF-κB)的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如TNF-α，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等，丁永利等[32]用FQ- PCR檢測Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠去乙?；?(Sirt1)、MMP-13、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP-1)mRNA的表達(dá)，同時用ELISA 檢測小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-17、IL-4和白細(xì)胞介素-10(IL-10)的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CIA小鼠中Sirt1過表達(dá)，并且過表達(dá)Sirt1的小鼠中血清細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-17水平比對照組明顯降低，而IL-4水平升高,這與之前的研究相似,因此Sirt1可作為新的治療點，不過這有待于更多的研究。Lin等[33]也用FQ-PCR檢測RA患者外周血中單個核細(xì)胞誘騙受體 3(DcR3)mRNA的水平發(fā)現(xiàn)RA患者中DcR3mRNA的表達(dá)明顯高于健康者，DcR3 是一種可溶性腫瘤壞死因子受體超家族成員,可與腫瘤壞死因子配體 LIGHT、FasL 和 TLIA 競爭結(jié)合其相應(yīng)的受體如 HVEM、Fas 和DcR3。不過由于DcR3 缺乏胞內(nèi)區(qū)，不會傳導(dǎo)凋亡信號[34]。DcR3主要表現(xiàn)為抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化及免疫等作用，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[35],結(jié)合研究結(jié)果表明DcR3在RA發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，可能通過抑制凋亡途徑進(jìn)行，這有待于進(jìn)一步研究。

FQ-PCR技術(shù)是近年來新發(fā)明的定量PCR技術(shù)，定量更準(zhǔn)確并且具有更高的靈敏度和特異性，除此之外還有其他的優(yōu)點：(1)通過顯示系統(tǒng)實時監(jiān)測PCR的擴(kuò)增過程；(2)反應(yīng)完成后可直接得到實驗結(jié)果，無需打開反應(yīng)管對產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，從而避免了開蓋檢測環(huán)節(jié)形成的氣溶膠對實驗室造成的污染。

5錯配PCR技術(shù)在RA患者中的應(yīng)用

許多的研究表明IL-17A在RA的發(fā)病中具有重要作用，IL-17上調(diào)了Cyr61的表達(dá)，參與慢性炎性反應(yīng)[15-18]。田輝等[36]通過錯配 PCR 技術(shù)提高人源化抗hIL17A 單鏈抗體(scFv)的親和力，為進(jìn)一步開發(fā)治療RA的人源化抗體藥物奠定基礎(chǔ)。錯配PCR 技術(shù)是抗體體外親和力提高的一種可行性方法，在保證與抗原結(jié)合能力的基礎(chǔ)上提高了其親和力和中和活性。

細(xì)菌感染引起RA的原因一直備受關(guān)注，近年來檢測RA患者體內(nèi)細(xì)菌內(nèi)毒素的研究也越來越多，有研究發(fā)現(xiàn)RA患者體內(nèi)存在葡萄球菌腸毒素e的基因，檢出率為13.25%[37]。

上述是PCR技術(shù)在RA中的應(yīng)用，隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，精密度、特異度、靈敏度不斷提高，尤其是近年來廣泛應(yīng)用的實時熒光定量PCR技術(shù)，可對異常表達(dá)基因?qū)崟r定量檢測。通過PCR對RA患者基因表達(dá)的分析可以為RA的診斷和治療提供更可靠的依據(jù)，減輕RA患者的痛苦，達(dá)到早期診斷早期治療的目的。但是，上述研究只是針對RA患者基因方面的檢測，至于其具體臨床應(yīng)用及其針對異常基因的藥物的研制還應(yīng)繼續(xù)研究，并且其療效的好壞需要更多的臨床試驗證明。PCR技術(shù)不斷發(fā)展，每種技術(shù)具有各自的優(yōu)缺點，在具體應(yīng)用時應(yīng)結(jié)合實際應(yīng)用條件和目的選擇合適的方法。通過更多的研究進(jìn)一步探討RA的發(fā)病機(jī)制和早期診斷方法，為RA的診斷、治療、預(yù)后提供更多、更可靠的依據(jù)。

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(收稿日期：2015-10-18)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.027

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0643-04

作者簡介：趙海歌，女，在讀研究生，主要從事免疫學(xué)與分子生物學(xué)研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:15930229171@163.com。