蔡曉菲　焦桂萍

【摘要】 目的 觀察大鼠肺缺血再灌注（LIRI）損傷后腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血小板活化因子（PAF）含量及相關(guān)酶學(xué)變化， 探討前列腺素E1預(yù)處理對(duì)大鼠肺LIRI的保護(hù)作用。方法 建立原位阻斷肺門(mén)的大鼠肺缺血再灌注模型， 將54只雄性清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（SO組）、LIRI組（IR組）和前列腺素E1組（PGE1組）， 每組18只。每組均分別在缺血45 min， 再灌注1、2 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠， 比較三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織病理學(xué)改變及肺組織干/濕重（D/W）比值， TNF-α、PAF水平， 丙二醛（MDA）濃度及超氧化物歧化酶（SOD）活性表達(dá)水平。結(jié)果 PGE1組肺組織D/W比值， TNF-α、PAF、MDA濃度及SOD活性水平均較IR組顯著改善， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 前列腺素E1預(yù)處理可以減輕LIRI肺損傷， 其可能機(jī)制是通過(guò)減輕LIRI后的炎癥反應(yīng)而起到肺組織保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 前列腺素E1；缺血再灌注；肺；腫瘤壞死因子-α；血小板活化因子

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.07.214

前列腺素E1長(zhǎng)期作為一種血管擴(kuò)張劑及抑制血小板聚集劑用于急性肺損傷的臨床治療。國(guó)外有文獻(xiàn)表明PGE1對(duì)LIRI后的炎性介質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用， 可阻斷LIRI現(xiàn)象的發(fā)生。然而目前國(guó)內(nèi)關(guān)于PGE1對(duì)LIRI影響的臨床研究甚少， 且作為炎性介質(zhì)PAF對(duì)于LIRI的影響更是少有報(bào)道。本研究通過(guò)建立大鼠肺LIRI損傷模型， 觀察PGE1對(duì)肺內(nèi)炎性介質(zhì)TNF-α、PAF及相關(guān)酶學(xué)表達(dá)的影響， 探討其對(duì)LIRI的保護(hù)作用機(jī)制， 為其臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取健康成年雄性清潔級(jí)SD大鼠54只， 重量280～350 g， 由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組（SO組）、LIRI組（IR組）、前列腺素E1組（PGE1組）， 每組18只。每組隨機(jī)再分缺血45 min， LIRI后1、2 h 三個(gè)亞組， 每個(gè)亞組6只。

1. 2 動(dòng)物模型制備 IR組：取大鼠稱(chēng)重， 予3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉， 麻醉滿意后氣管切開(kāi)插管接DH-140B型動(dòng)物人工呼吸機(jī)（f=70次/分、I∶E=1.25∶1、V=10～15 ml/kg）， 大鼠右側(cè)臥位， 經(jīng)左前側(cè)第5肋間進(jìn)入胸腔， 解剖左側(cè)肺門(mén)。肝素50 U用生理鹽水稀釋至500 μl經(jīng)陰莖背靜脈注射， 5 min后于肺充盈狀態(tài)下用無(wú)創(chuàng)微血管夾依次夾閉左肺動(dòng)脈、支氣管與肺靜脈， 45 min后放開(kāi)血管夾恢復(fù)灌注和通氣， 造成LIRI模型。再灌注期間腹腔注射生理鹽水0.5 ml/h， 各組均分別于缺血45 min和再灌注1、2 h后經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死大鼠。SO組：完成除夾閉肺門(mén)的其他一切手術(shù)操作， 余同IR組。PGE1組：缺血前5 min陰莖背靜脈注射PGE1（北京泰德制藥有限公司）（10 μg/kg溶于0.5 ml生理鹽水）， 余同IR組。

1. 3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1. 3. 1 肺組織切片病理學(xué)觀察 取部分左肺上葉組織10%中性甲醛固定， 常規(guī)脫水、包埋、切片、脫蠟、HE染色， 光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1. 3. 2 肺組織干/濕重比測(cè)定 取部分左肺下葉組織， 濾紙吸干表面液體， 稱(chēng)其濕重。然后置入恒溫干燥箱（80℃）， 烘烤48 h后取出稱(chēng)其干重， 計(jì)算D/W。

1. 3. 3 肺組織TNF-α、PAF含量測(cè)定 采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定10%肺組織勻漿TNF-α、PAF含量， 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1. 3. 4 肺組織SOD、MDA水平測(cè)定 取10%肺組織勻漿測(cè)定SOD、MDA水平， 操作步驟按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析， 組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 肺組織病理切片結(jié)果 SO組：肺泡結(jié)構(gòu)完整， 毛細(xì)血管內(nèi)無(wú)充血， 肺泡腔內(nèi)無(wú)或少許白細(xì)胞、紅細(xì)胞滲出。IR組：部分肺泡萎陷不張， 毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張、充血， 肺泡腔及肺間質(zhì)可見(jiàn)大量白細(xì)胞、紅細(xì)胞滲出， 水腫液明顯滲出。PGE1組：肺泡結(jié)構(gòu)尚可， 毛細(xì)血管輕度充血， 各時(shí)間點(diǎn)肺間隔及肺泡腔出血、滲出較IR組明顯減輕。

2. 2 肺組織D/W比值比較 缺血45 min三組大鼠肺組織D/W比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；IR組及PGE1組隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)D/W比值逐漸下降， 與SO組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；PGE1組再灌注各時(shí)間點(diǎn)肺組織D/W比值下降無(wú)IR組顯著， 再灌注2 h兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2. 3 肺組織TNF-α、PAF含量比較 SO組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α、PAF含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；IR組及PGE1組兩指標(biāo)再灌注各時(shí)間點(diǎn)與SO組比較比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；PGE1組兩指標(biāo)隨時(shí)間延長(zhǎng)亦有升高， 但低于IR組， 兩組TNF-α（再灌注2 h）、PAF（再灌注1、2 h）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2. 4 肺組織MDA濃度和SOD活性水平比較 PGE1及IR組再灌注各時(shí)間點(diǎn)肺組織MDA、SOD均較SO組有改善， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）；且 PGE1組兩指標(biāo)改善情況與IR組比較， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）。見(jiàn)表3。

3 討論

LIRI是由多種炎性介質(zhì)和效應(yīng)細(xì)胞共同參與的一種呈級(jí)聯(lián)放大的瀑布樣炎癥損傷， 檢測(cè)炎性指標(biāo)PAF、TNF-α的變化可以很好的表示LIRI后肺組織因炎癥所致的損害程度[1]。PAF是具有廣泛生物活性的脂類(lèi)炎性介質(zhì)， 是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血小板聚集誘導(dǎo)劑， 亦是內(nèi)源性炎癥過(guò)程啟動(dòng)與放大的重要調(diào)節(jié)遞質(zhì)， 其通過(guò)與相應(yīng)受體結(jié)合而參與LIRI的發(fā)生發(fā)展。TNF-α是LIRI過(guò)程中最早釋放的細(xì)胞因子， 對(duì)其他細(xì)胞因子起誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用， 通過(guò)多種途徑引起肺損傷。TNF-α拮抗劑可有效中和TNF-α并阻斷其生物學(xué)活性， 抑制炎性細(xì)胞因子釋放從而起到減輕LIRI的作用。由上可知， TNF-α、PAF是LIRI過(guò)程中具有關(guān)鍵作用的炎性因子， 抑制其生成有助于缺血肺功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中作者采用大鼠肺缺血再灌注模型， 發(fā)現(xiàn)IR組TNF-α、PAF含量在再灌注各時(shí)間點(diǎn)均較SO組明顯升高（P<0.05）， PGE1組各時(shí)間點(diǎn)兩者含量均低于IR組而顯著高于SO組（P<0.05）， 說(shuō)明PGE1能減少肺組織TNF-α、PAF含量達(dá)到肺組織的保護(hù)作用。

正常情況下， 肺內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)， 而機(jī)體缺血缺氧后可釋放大量炎性細(xì)胞因子及氧自由基， 肺組織中MDA含量和SOD活性可判定LIRI后肺的氧化和抗氧化能力及氧自由基對(duì)肺組織攻擊的嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)中觀察到：IR組大鼠肺組織MDA含量顯著升高， SOD活性下降；而PGE1組MDA含量低于IR組， SOD活性高于IR組（P<0.05）。表明PGE1缺血前干預(yù)LIRI能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)氧自由基的清除， 具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)， 從而減輕LIRI造成的肺組織損傷。肺水腫是LIRI的一個(gè)重要的病理改變， 而D/W比值可反應(yīng)肺組織充血水腫的程度， 間接評(píng)價(jià)LIRI后肺損傷情況。本實(shí)驗(yàn)中觀察到IR組在再灌注各時(shí)間點(diǎn)D/W比值隨時(shí)間逐漸減低， 而PGE1組D/W比值亦下降， 但下降沒(méi)有IR組顯著。同時(shí)， 光鏡下亦觀察到PGE1組肺泡腔及間質(zhì)白細(xì)胞、紅細(xì)胞浸潤(rùn)、滲出較IR組減輕。

脂質(zhì)體前列腺素E1（Lipo-PGE1）以脂質(zhì)體微球作為藥物載體， 減少了藥物毒副作用并增強(qiáng)臨床療效。Lipo-PGE1能選擇性地活化中性粒細(xì)胞（PMN）， 從而增強(qiáng)PGE1對(duì)PMN的靶向抗炎作用， 抑制肺內(nèi)PMN聚集活化， 減輕大鼠急性肺損傷。文獻(xiàn)表明Lipo-PGE1屬于抗炎因子， 通過(guò)抑制TNF-α、PAF等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生及釋放從而發(fā)揮肺組織保護(hù)作用[2]。

綜上所述， Lipo-PGE1預(yù)處理可以減輕缺血再灌注肺損傷， 其保護(hù)作用機(jī)制可能與下調(diào)TNF-α、PAF的表達(dá)以及抑制PMN浸潤(rùn)和激活有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1] 倪程耀， 陳新， 吳勝軍.免疫因素在大鼠肺缺血再灌注損傷中的作用.中國(guó)老年學(xué)雜志， 2014， 34（18）：5192-5193.

[2] 陳立新， 劉德昭.前列地爾對(duì)圍術(shù)期機(jī)械通氣肺損傷的肺保護(hù)作用.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志， 2011， 27（3）：2432-2434.

[收稿日期：2015-11-11]