■白曉凱　李艷嬌　金英?！垺∶簟￡愂谩鴤鞲?/p>

（1.延邊大學，吉林延邊133000；2.琿春市龍裕農(nóng)業(yè)發(fā)展集團有限公司，吉林琿春133300）

?

酵母菌發(fā)酵有機米糠富鍺的條件優(yōu)化

■白曉凱1李艷嬌1金英海1張敏1陳石婷2國傳福2

（1.延邊大學，吉林延邊133000；2.琿春市龍裕農(nóng)業(yè)發(fā)展集團有限公司，吉林琿春133300）

摘要：試驗以有機米糠為發(fā)酵底物，研究酵母菌對鍺的生物富集作用，通過對富鍺酵母生物量以及鍺含量的測定，對此發(fā)酵試驗的條件進行優(yōu)化。試驗結(jié)果顯示：令初始pH值自然，米糠添加量32 g/250 ml、裝液量80 ml/250 ml、接種量10%、時間60 h、溫度30℃、GeO2添加量為100 mg/l時，優(yōu)化培養(yǎng)條件所得的富鍺酵母菌發(fā)酵的有機米糠的有機鍺生產(chǎn)水平為11.83 mg/kg。

關(guān)鍵詞：有機米糠；發(fā)酵；酵母菌；有機鍺

1968年，日本科學家淺井彥一等成功地人工合成了有機鍺化合物——羧乙基鍺倍半氧化物,即Ge-132。在隨后的深入研究中發(fā)現(xiàn)，Ge-132具有廣譜藥理活性及抗腫瘤作用，這一發(fā)現(xiàn)，為醫(yī)學界尋找有效而低毒的抗癌藥物開辟了又一重要的新領(lǐng)域[1]。

鍺的存在形式有兩種，即無機鍺和有機鍺。無機鍺對人體和動物均有很大的毒性，禁止作為添加劑大量使用。而鍺的許多生理活性作用都是以有機鍺的形式發(fā)揮作用的。獲取有機鍺的重要途徑之一就是利用微生物轉(zhuǎn)化作用,而酵母菌對鍺的生物富集有著很大的優(yōu)勢[2-4]。德國科學家Kehlbeck等發(fā)現(xiàn)，持續(xù)服用含鍺酵母對動物的健康有很大益處[5]。米糠是一種優(yōu)質(zhì)的能量飼料[6]，本研究以有機米糠作為富鍺酵母菌發(fā)酵底物，充分利用其兼具營養(yǎng)價值高、綠色、安全、價廉等優(yōu)點，在增加其飼喂適口性的同時，更為動物提供了優(yōu)質(zhì)的菌體蛋白、綠色安全的有機鍺，大大提高了其飼喂價值，在養(yǎng)殖業(yè)和人用醫(yī)藥保健領(lǐng)域具有很廣闊的應用前景。

1　材料與方法

1.1酵母菌菌株

選用對金屬具有較高耐受性且發(fā)酵后動物喜食的啤酒酵母。

1.2培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。

種子合成培養(yǎng)基:酵母膏3 g、蛋白胨0.5 g、葡萄糖40 g、糊精2.75 g、甘油2.35 g、NH4Cl 2.37 g、(NH4)2SO40.5 g、K2HPO41.92 g、MgSO4·7H2O 0.44 g、蒸餾水1 L，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：有機米糠，營養(yǎng)液（葡萄糖20 g、馬鈴薯粉20 g、蒸餾水1 000 ml），pH值自然。

1.3培養(yǎng)條件優(yōu)化篩選

從斜面取一環(huán)酵母菌體接種于裝有10 ml種子合成培養(yǎng)基的試管中，30℃、靜置培養(yǎng)12 h，再按2%接種量接種試管種子，于裝有50 ml種子合成培養(yǎng)基并加有透氣棉塞的250 ml錐形瓶中擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入GeO2（純度為99.999%）作為鍺源，接種擴大培養(yǎng)后的酵母菌，考察米糠添加量、裝液量、接種量、時間、溫度、GeO2添加量6個培養(yǎng)條件對有機鍺生產(chǎn)水平的影響。

1.4有機鍺生產(chǎn)水平的測定

發(fā)酵完成后，將錐形瓶中的發(fā)酵物用去離子水洗滌并過濾，重復2～3次，取洗滌液進行離心，離心條件為25℃、4 500 r/min、20 min。離心后棄上清液，105℃干燥所得的沉淀物即為酵母菌體干粉。

酵母菌體中的鍺大部分以有機鍺的形式存在，但也有少量的無機鍺。本試驗采用靜置浸出離心分離法測定富鍺酵母中有機鍺的含量[5]。取0.2～ 0.3 g酵母菌體干粉，用9 ml蒸餾水將其溶解，靜置10 h,然后以3 500 r/min、20 min，反復離心3次，將上清液與下層沉淀分離，上清液中的鍺即為無機鍺，下層沉淀中的鍺為有機鍺。將沉淀于65℃的干燥箱中干燥。

取0.100 g酵母菌體干粉加入3 ml濃硫酸，小火進行樣品碳化，此時酵母干粉中的有機鍺轉(zhuǎn)化為成Ge(SO4)2。碳化完全后加入20 ml H2O2，小火微沸將溶液煮至近透明,此時溶液中的Ge(SO4)2轉(zhuǎn)化為GeO2,加入7 ml NaOH溶液（1 mol/l），小火微沸5 min左右,充分溶解溶液中的GeO2。再用稀HCl（1 mol/l）將溶液調(diào)至pH值為6左右,此時溶液為微黃色透明液體。將溶液定容50 ml，采用苯芴酮光度法對上清液及沉淀分別進行測定，即可得到有機鍺和無機鍺含量[7]。

有機鍺生產(chǎn)水平（mg/l）=富鍺酵母有機鍺含量（mg/g）×發(fā)酵米糠酵母菌生物量（g/l）。

2　結(jié)果與討論

2.1米糠添加量對富鍺酵母生物量的影響（見圖1）

米糠添加量的篩選分為6個組，每組3個平行處理，6個組的米糠添加量分別為24、28、32、36、40 g以及44 g 6個梯度。此篩選的其他試驗條件為：裝液量70 ml、接種量4%、時間48 h、溫度28℃。

由圖1可知，米糠添加量為24～32 g時，酵母菌生物量隨米糠添加量的增加而增大，當米糠添加量為32 g時，酵母菌生物量達到最大0.58 g/100 ml；米糠添加量為32～44 g時，酵母菌生物量反而隨米糠添加量的增大而降低。通過對各組發(fā)酵過程中狀態(tài)改變的觀察分析可得，米糠添加量為24～32 g時，由于發(fā)酵物含水量過多，米糠量較少，造成發(fā)酵物因供氧及營養(yǎng)成分不足，使得酵母菌無法充分地進行有氧呼吸，無氧呼吸的產(chǎn)物又進一步抑制了發(fā)酵物的發(fā)酵，最終導致生物量較少；米糠添加量在32 g以上時，由于發(fā)酵物含水量不足，米糠量過多，造成發(fā)酵物結(jié)塊，使得酵母菌無法充分與氧氣接觸，最終導致生物量較少。因此確定米糠添加量為32 g/250 ml。

2.2裝液量對富鍺酵母生物量的影響（見圖2）

裝液量的篩選分為6個組，每組3個平行處理，6個組的營養(yǎng)液添加量分別為60、70、75、80、85 ml以及90 ml 6個梯度。此篩選的其他試驗條件為：米糠添加量32 g、接種量4%、時間48 h、溫度28℃。

由圖2可知，營養(yǎng)液添加量即裝液量為60～80 ml時，酵母菌生物量隨裝液量的增加而增大，并于80 ml時達到最大值0.611 g/100 ml；隨著裝液量的繼續(xù)增加，酵母菌生物量開始出現(xiàn)下降趨勢。通過對各組發(fā)酵過程中狀態(tài)改變的觀察分析可得，裝液量在80 ml以下時，由于含水量不足使得發(fā)酵物結(jié)塊，進而導致酵母菌供養(yǎng)不足，加之營養(yǎng)成分的不足，兩方面原因?qū)е陆湍妇L受到抑制；當裝液量大于80 ml時，由于含水量過高，使得發(fā)酵物無法充分膨脹，從而使得酵母菌無氧呼吸比例過高，無氧呼吸代謝物又進一步抑制了酵母菌的生長繁殖，最終導致生物量下降[8-9]。因此，確定最適裝液量為80 ml/250 ml。

2.3接種量對富鍺酵母生物量的影響(見圖3)

圖3　接種量對富鍺酵母生物量的影響

接種量的篩選分為6個組，每組3個平行處理，6個組的接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%以及14% 6個梯度。此篩選的其他試驗條件為：米糠添加量32 g、裝液量80 ml、時間48 h、溫度28℃。

由圖3可知，接種量小于10%時，酵母菌的生物量隨發(fā)酵時接種量的增加而增大，并于接種量為10%時達到最大值0.798 5 g/100 ml；但隨著接種量的繼續(xù)增加，酵母菌生物量不再增大，甚至出現(xiàn)了下降趨勢。這可能是由于過量的酵母菌提前消耗完培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，從而提早進入了死亡期所致。因此確定最適接種量為10%。

2.4培養(yǎng)時間對富鍺酵母生物量的影響(見圖4)

圖4　培養(yǎng)時間對富鍺酵母生物量的影響

培養(yǎng)時間的篩選分為6個組，每組3個平行處理，6個組的培養(yǎng)時間分別為24、36、48、60、72 h以及84 h 6個梯度。此篩選的其他試驗條件為：米糠添加量32 g、裝液量80 ml、接種量10%、溫度28℃。

由圖4可知，在培養(yǎng)時間為24～60 h的范圍內(nèi)時，酵母菌的生物量隨著培養(yǎng)時間的延長而增大，且在培養(yǎng)60 h時達到最大值0.989 g/100 ml；隨著培養(yǎng)時間繼續(xù)延長，酵母菌的生物量出現(xiàn)下降趨勢。這與酵母菌生長對數(shù)曲線有著直接關(guān)系[10]。因此，確定最適培養(yǎng)時間為60 h。

2.5培養(yǎng)溫度對富鍺酵母生物量的影響(見圖5)

圖5　培養(yǎng)溫度對富鍺酵母生物量的影響

培養(yǎng)溫度的篩選分為6個組，每組3個平行處理，6個組的培養(yǎng)溫度分別為28、29、30、31、32℃以及33℃6個梯度。此篩選的其他試驗條件為：米糠添加量32 g、裝液量80 ml、接種量10%、時間60 h。

由圖5可知，培養(yǎng)溫度在28～30℃時，酵母菌生物量隨培養(yǎng)溫度的上升而增大，且于30℃時達到最大值1.318 g/100 ml；但隨著溫度的繼續(xù)上升，酵母菌生物量開始出現(xiàn)下降趨勢。酵母菌在有氧環(huán)境中是以出芽方式進行增殖的，但是酵母菌只能夠在一定溫度下存活，且在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度越高，酵母菌生長繁殖得越快，衰亡的速度也隨溫度的升高而加快，在40℃時酵母菌會停止出芽[11]。從本試驗得到的數(shù)據(jù)來看，可以確定在試驗設定的環(huán)境中，最適的發(fā)酵溫度為30℃。

2.6GeO2添加量對富鍺酵母生物量及有機鍺生產(chǎn)水平的影響(見圖6)

GeO2添加量的篩選分為6個組，每組3個平行處理，6個組的GeO2添加量分別為60、80、100、120、140 mg/l以及160 mg/l 6個梯度。此篩選的其他試驗條件為：米糠添加量32 g、裝液量80 ml、接種量10%、時間60 h、溫度30℃。

由圖6可知，隨著GeO2添加量的增加，酵母菌的生物量呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于高濃度的GeO2抑制了酵母菌正常的生長代謝，導致其生物量減少。但在GeO2添加量為60～100 mg/l范圍內(nèi)，有機鍺生產(chǎn)水平呈現(xiàn)上升趨勢，并于GeO2添加量為100 mg/l時達到最大值11.83 mg/l；隨著GeO2添加量的繼續(xù)增加，有機鍺生產(chǎn)水平開始呈現(xiàn)下降趨勢。因此，GeO2最適添加量為100 mg/l。

圖6　GeO2添加量對富鍺酵母生物量及有機鍺生產(chǎn)水平的影響

2.7發(fā)酵米糠營養(yǎng)成分分析（見表1）

表1　普通有機米糠與酵母菌發(fā)酵有機米糠營養(yǎng)成分分析(%)

由表1可知，經(jīng)酵母菌發(fā)酵后的有機米糠的粗蛋白所占比例顯著增加（P<0.05）；鈣所占比例也有所增加，但差異不顯著；其他營養(yǎng)成分所占比例都有不同程度的降低。有機米糠經(jīng)酵母菌發(fā)酵后，發(fā)酵米糠中含有豐富的酵母菌體蛋白，使得其粗蛋白含量增加。

3　結(jié)論

本研究通過一系列的條件篩選試驗，將最優(yōu)條件進行組合，獲得了在發(fā)酵起始pH值自然時富鍺酵母菌發(fā)酵有機米糠的優(yōu)化條件：有機米糠添加量32 g/250 ml、裝液量80 ml/250 ml、接種量10%、時間60 h、溫度30℃、GeO2添加量為100 mg/l。優(yōu)化培養(yǎng)條件所得的富鍺酵母菌發(fā)酵的有機米糠的有機鍺生產(chǎn)水平為11.83 mg/kg。

參考文獻

[1]陳紅專,孫琛.有機鍺藥理作用的研究[J].中國藥理學通報,1990 (6):341-343.

[2]白明章,耿立峰,孫麗娟.具有生物活性的有機鍺化合物及其合成方法[J].化學通報,1987(11):23-28.

[3]魏秀生.酵母對鍺的生物富集作用[J].食品科學,1992(5):49-54.

[4]唐博恒,莫卓壽,黃詩旦,等.高鍺酵母的研究[J].解放軍預防醫(yī)學雜志,1994(3):179-183.

[5] Kehlbeck，Heinrich. Here mit einern Gehalt eines Metalls and Verfahren ZU deren Herstellung.Gev Offen DE. 334521[A]. 1985-06-27.

[6] Donald E P. Rice: not just for throwing[J]. Food Tech., 2001,55(2): 53-58.

[7]金嬋,郝素娥,孫麗欣,等.高鉻酵母的制備及其有機鉻含量的研究[J].營養(yǎng)學報,2002(3):282-285.

[8]洪長根.探究酵母菌細胞呼吸方式的三個實驗設計方案[J].生物學教學,2009(7):37-39.

[9]楊涌.酵母菌細胞質(zhì)基質(zhì)有氧時能將葡萄糖分解產(chǎn)生酒精和二氧化碳[J].生物學教學,2015（1）:67-68.

[10]王秋菊,許麗,崔一喆,等.酵母菌生長曲線的測定及不同生長時間麥芽汁糖度的變化[J].獸藥與飼料添加劑,2006（1）:8-9.

[11]陳維.探究溫度對酵母菌種群數(shù)量的影響[J].生物學通報,2008 (12):46-48.

（編輯：劉占，laramie_liu@139.com）

《飼料工業(yè)》（英文版）征稿啟事

2008年《飼料工業(yè)》推出英文版，作為行業(yè)第一本英文版雜志，自出版以來極大地滿足了行業(yè)企業(yè)走向國際化的需求，讓外國的讀者更多地了解中國的一些行業(yè)資訊、發(fā)展動態(tài)、政策法規(guī)對行業(yè)發(fā)展的影響，為企業(yè)搭建與國際間交流的平臺，推動中國乃至全球飼料行業(yè)的發(fā)展。

為此，《飼料工業(yè)》向業(yè)內(nèi)征集優(yōu)秀的英文稿件，內(nèi)容涉及人物專訪、名企展示、行業(yè)年度報告、工廠管理、企業(yè)介紹、產(chǎn)品質(zhì)量展示、學術(shù)專欄、政策分析以及企業(yè)國際合作等欄目，同時設置版塊部分，介紹國內(nèi)外的行業(yè)信息、資訊和新產(chǎn)品的展示。通過英文媒體平臺把國內(nèi)最全面的技術(shù)信息和研究成果展示給讀者，使中國的飼料工業(yè)逐步走向世界，加強國內(nèi)外飼料行業(yè)、企業(yè)間的交流與合作，真誠希望您踴躍投稿，積極參與。讓《飼料工業(yè)》（英文版）與您一同成長。

網(wǎng)上投稿：www.feedindustry.com.cn

信箱：eslgy@126.com

聯(lián)系電話：024-8639192513700047990

Optimization of germanium accumulation conditions by yeast to ferment the organic rice bran

Bai Xiaokai, Li Yanjiao, Jin Yinghai, Zhang Min, Chen Shiting, Guo Chuanfu

Abstract：The experiment took the organic rice bran as the fermentation substrate to study the biologi?cal accumulation function of the yeast to germanium. The biomass and germanium-enriched yeast were measured for optimizing the experiment conditions. The result showed: under the optimized condi?tions that the initial pH value was unchanged, the filling volume of organic rice bran was 32 g/250 ml, the filling volume of liquid medium was 80 ml/250 ml, the inoculum was 10%(v/v), the cultural time was 60 h, the cultural temperature was 30℃, GeO2concentration was 100 mg/l, the organic germani?um production-level of the organic rice bran fermented by yeast was 11.83 mg/kg.

Key words：organic rice bran；fermentation；yeast；organic germanium

收稿日期：2015-10-26

通訊作者：張敏，教授，碩士生導師。

作者簡介：白曉凱，碩士，研究方向為生物飼料添加劑的開發(fā)與應用。

中圖分類號：S816.6

文獻標識碼：A

文章編號：1001-991X（2016）02-0047-04

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.02.010