李貴正++劉紀(jì)臣+++李新柱++武磊

摘要：以淡紫擬青霉為例，介紹了1種簡易的單孢子分離及霉菌生長形態(tài)觀察方法。單孢子分離時(shí)，通過whatman濾紙過濾獲得孢子懸液，使用玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管點(diǎn)樣于凹玻片凹槽中央，普通光學(xué)顯微鏡下觀察獲得單孢子；生長形態(tài)觀察時(shí)，凹槽中分離的單孢子覆蓋融化的固體培養(yǎng)基，經(jīng)濕室培養(yǎng)后，單菌落用棉蘭染色后觀察，加蓋蓋玻片可用油鏡觀察。該方法能快速、準(zhǔn)確分離到單孢子，并很容易觀察不同生長期霉菌、放線菌的自然生長狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：單孢子分離；霉菌形態(tài)；觀察

中圖分類號(hào)： S432.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0390-02

收稿日期：2015-03-11

基金項(xiàng)目：山東省工業(yè)提質(zhì)增效升級(jí)專項(xiàng)基金[編號(hào)：魯財(cái)企指（2014）61號(hào)]。

作者簡介：李貴正（1976—），男，山東臨沂人，碩士，工程師，主要從事微生物發(fā)酵研究。Tel：（0539）7198660；E-mail：liguizheng@kingenta.com。真菌、放線菌的純培養(yǎng)經(jīng)常需要獲得單孢子，單孢子分離也是植物病理研究中的一項(xiàng)基本技術(shù)。單孢子分離的方法很多，目前常用方法有瓊脂平板稀釋純化法、微量注射器分離法[1]、單孢直接挑取分離法[2]、連續(xù)變倍體視顯微鏡分離法[3]、實(shí)體解剖鏡單孢分離法[4]、孢子震落水洋菜平板法[5]等，但這些方法操作繁瑣，且需要一些不常見的精密儀器，如微量注射器、實(shí)體解剖鏡、連續(xù)變倍體視顯微鏡等，制約了上述方法在普通實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。沈萍等的簡易單孢子分離法，須要點(diǎn)樣于培養(yǎng)皿內(nèi)壁方格內(nèi)，然后將皿蓋小心、快速翻轉(zhuǎn)，然后放于低倍鏡下觀察[6]，此方法工作量較大，且觀察不方便。傳統(tǒng)的霉菌、放線菌形態(tài)觀察方法有直接制片觀察法、載玻片培養(yǎng)觀察法、插片法、玻璃紙觀察法、瓊脂槽培養(yǎng)法、儀器設(shè)備自動(dòng)制片法等，這些方法只能觀察到真菌、放線菌某階段的形態(tài)特征，不能觀察菌絲體的自然生長狀態(tài)，且以上方法在獲得菌絲顯微特征的同時(shí)，均不能獲得菌落層次上的形態(tài)特征[7]。本研究提出了1種簡易的單孢子分離及霉菌生長形態(tài)觀察方法，該方法操作簡便易行，能很容易觀察到菌落不同層次上的形態(tài)特征，且能隨意觀察不同生長期霉菌、放線菌的自然生長狀態(tài)，以期為實(shí)驗(yàn)室單孢子分離和霉菌生長形態(tài)觀察提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2培養(yǎng)基馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（原配方以無菌水進(jìn)行 3 ∶1稀釋，以調(diào)整其硬度和降低營養(yǎng)物濃度）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，補(bǔ)足蒸餾水至1 L。

1.1.3主要試劑和儀器“U”形玻璃棒，whatman 濾紙（孔徑10 μm，英國），凹玻片，蓋玻片，玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管（長度100 mm；內(nèi)徑0.3 mm，華西醫(yī)科大學(xué)），玻璃涂布器，直徑9 cm 漏斗，乳酸石碳酸棉蘭染色液，漩渦振蕩器，擦鏡紙（濕熱滅菌后烘干備用），20% 滅菌甘油，0.05% Tween-80 無菌水，Nikon- ECLIPSE -50i 光學(xué)拍照顯微鏡（日本）。

1.2方法

1.2.1單孢子分離方法準(zhǔn)備工作：用75%乙醇溶液擦拭漩渦振蕩器、光學(xué)顯微鏡等，超凈工作臺(tái)內(nèi)紫外殺菌30 min。擬青霉培養(yǎng)7 d，加5 mL無菌水于培養(yǎng)皿中，用涂布器刮下平板表面菌落。用孔徑10 μm的 whatman 濾紙過濾 2 次得孢子懸液。加入95 mL 0.05% Tween-80無菌水和 20個(gè)直徑5 mm的玻璃珠，放在漩渦振蕩器充分振蕩10 min[8]。孢子溶液用0.05% Tween-80無菌水梯度稀釋至濃度約為10萬～30萬個(gè)/mL（血細(xì)胞計(jì)數(shù)板每大格約1 個(gè)孢子）。將毛細(xì)管放于三角瓶中，待液面升至毛細(xì)管3/4時(shí)，拿出輕輕點(diǎn)樣于凹玻片的凹槽中央，然后加蓋蓋玻片。用低倍鏡觀察，只保留單孢子液滴的凹玻片，其余的用擦鏡紙擦去后重新點(diǎn)樣。

1.2.2單菌落獲取和生長形態(tài)觀察方法準(zhǔn)備濕室：培養(yǎng)皿內(nèi)鋪1張圓形濾紙，然后放置 “U”形玻璃棒，棒上面放置1塊凹玻片（凹面向上），蓋上皿蓋，外用紙包扎，121 ℃濕熱滅菌30 min，然后置于100 ℃烘箱中烘干。冷卻后每皿加入 5～7 mL 20%的滅菌甘油保濕。融化培養(yǎng)基：將試管中稀釋好的PDA固體培養(yǎng)基加熱融化后放于55 ℃水浴鍋中保溫、待用。覆蓋培養(yǎng)基：吸取100 μL 55 ℃的培養(yǎng)基，迅速滴入已分離到單孢子的凹槽中，快速轉(zhuǎn)動(dòng)使其平整。培養(yǎng)：28 ℃恒溫培養(yǎng)。觀察：既定時(shí)間拿出，乳酸石碳酸棉蘭染色液染色，光學(xué)顯微鏡下拍照觀察，必要時(shí)可加蓋玻片后用油鏡觀察。

2結(jié)果與分析

單孢子分離結(jié)果見圖1。

單菌落獲取結(jié)果見圖2。

每隔一定時(shí)間從培養(yǎng)箱中拿出凹玻片，放于顯微鏡下拍照。圖3：萌發(fā)的分生孢子；圖4：分生孢子長出菌絲體；圖5：形成密集的菌絲體；圖6：菌落中心開始產(chǎn)生分生孢子；圖7：

菌落邊緣還未產(chǎn)生分生孢子；圖8：菌落邊緣產(chǎn)生大量分生孢子。

3結(jié)論和討論

單純自然形態(tài)觀察時(shí)，可省去單孢子分離的步驟，毛細(xì)管點(diǎn)樣后直接覆蓋培養(yǎng)基即可；此法對(duì)產(chǎn)生孢子的放線菌同樣適用；如孢子直徑較小，應(yīng)使用40倍的物鏡觀察分離；梯度稀釋后，顯微鏡下如有多個(gè)孢子，可用滅菌的針或牙簽挑去多余孢子；若沒有whatman濾紙，可用4層擦鏡紙?zhí)娲?/p>

本方法的創(chuàng)新之處：僅用凹玻片和常規(guī)的光學(xué)顯微鏡就能很容易分離到單孢子；不須要制備專門的毛細(xì)滴管，使用市售的玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管即可；加蓋蓋玻片可有效防止液滴干燥，使操作時(shí)間延長到3 min以上；通過孔徑10 μm的whatman濾紙過濾，可得純凈的孢子懸液，幾乎無菌絲體殘留；凹玻片的凹槽加入適量培養(yǎng)基不會(huì)外漏，且加入的培養(yǎng)基較薄，便于觀察；用20%甘油保濕，效果明顯優(yōu)于水瓊脂；能隨時(shí)觀察真菌、放線菌的自然生長狀態(tài)。

該單孢子分離方法不需要特殊分離儀器，一般實(shí)驗(yàn)室均能采用，很易觀察到不同生長期霉菌、放線菌不同層次上的自然生長狀態(tài)，可在實(shí)驗(yàn)室中推廣使用。

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