劍葉龍血樹(shù)組織培養(yǎng)與快速繁殖的研究

楊春燕

（云南開(kāi)放大學(xué)云南國(guó)防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 云南昆明 650500）

劍葉龍血樹(shù)組織培養(yǎng)與快速繁殖的研究

楊春燕

（云南開(kāi)放大學(xué)云南國(guó)防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 云南昆明 650500）

用劍葉龍血樹(shù)的腋芽、頂芽或莖段作外植體，構(gòu)建了劍葉龍血樹(shù)組織培養(yǎng)再生體系。試驗(yàn)結(jié)果如下：劍葉龍血樹(shù)腋芽、頂芽或莖段誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)95%；選擇MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+30g/L的蔗糖+8g/L瓊脂培養(yǎng)基有利于芽的分化和增殖，在1/2MS+NAA 0.2mg/L+IBA0.4mg/L+活性炭的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根效果最好。

劍葉龍血樹(shù) 組織培養(yǎng) 快速繁殖

劍葉龍血樹(shù)（Dracaena cochinchinensis）是百合科龍血樹(shù)屬植物。莖粗大，分枝多，樹(shù)皮灰白色，光滑，葉聚生在莖、分枝或小枝頂端，花序軸密生乳突狀短柔毛，花絲扁平，莖部有紅棕色疣點(diǎn)；花柱細(xì)長(zhǎng)。龍血竭為劍葉龍血樹(shù)的樹(shù)脂類(lèi)藥材，是我國(guó)的傳統(tǒng)名貴中藥，內(nèi)服可以活血化瘀，止痛，主要用于治療冠心病、腦梗死等血栓性疾病；外用能止血，生肌斂瘡，主要用于各種皮膚或粘膜疾患。為了獲得更多的劍葉龍血樹(shù)的資源，我們采用組織培養(yǎng)的快速繁殖方法，可以很好的解決這個(gè)問(wèn)題，各種資料報(bào)道的組織培養(yǎng)方法［1.2.3］，多數(shù)以海南龍血樹(shù)為材料，我們研究的主要對(duì)象是劍葉龍血樹(shù)，看是否也有同樣的效果。

1 材料和方法

1.1 外植體來(lái)源：

實(shí)驗(yàn)材料劍葉龍血樹(shù)采自廣西憑祥，并在云南昆明移栽成活。在取龍血樹(shù)的外植體之前，先對(duì)龍血樹(shù)的整棵植株進(jìn)行消毒處理，方法是用1g/L的70%甲基托布津可濕性粉劑水溶液進(jìn)行噴灑，每隔3天噴一次，看到植株及盆土淋濕為止，連續(xù)噴灑3次。選取接種材料為優(yōu)良的腋芽或頂芽和莖段作為外植體。

1.2 外植體的消毒

外植體采集前控制水分、淋殺菌劑的預(yù)處理方法可降低材料的污染率，提高誘導(dǎo)的成功率。把取來(lái)的外植體在自來(lái)水上沖洗干凈后，在加有少量洗潔精的水中浸泡5min，自來(lái)水沖洗20min，再用75%的乙醇浸泡30s，隨后用無(wú)菌水沖洗3-4次，再放在飽和漂白粉水中消毒10min，無(wú)菌水沖洗4-5次；最后在0.1%升汞中消毒4min，用無(wú)菌水沖洗5次。在無(wú)菌條件下，借助手術(shù)刀，將消過(guò)毒的材料（用無(wú)菌濾紙吸干水分），切成0.5cm大小備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 MS培養(yǎng)基的配方與配制方法：

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大量元素：K N O3、N H4N O3、M g S O47 H2O、KH2PO4、CaCl22H2O，大量元素按照擴(kuò)大20倍來(lái)配制母液。微量元素：M n S O44 H20、Z n S O47 H2O、H3B O3、K I、N a2M o O42 H2O、CuSO45H2O、CoCl26H2O，微量元素母液擴(kuò)大100倍。鐵鹽：Na2-EDTA、FeSO47H2O；有機(jī)物質(zhì)：肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺素（VB1）、鹽酸吡哆醇（VB6），鐵鹽和有機(jī)物質(zhì)也是按照擴(kuò)大100倍來(lái)配制母液。

1.3.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配制：

6-BA（母液）：濃度為1mg/mL（溶于少量1mol/L鹽酸后以蒸餾水定容）；NAA（母液）：濃度為1mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸餾水定容）。

1.3.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制：

分別取擴(kuò)大20倍的大量元素母液50ml，擴(kuò)大100倍的微量元素10ml，鐵鹽母液10ml，有機(jī)物質(zhì)母液10ml，6-BA母液3ml，NAA母液0.5ml，蔗糖20g，瓊脂8g，把馬鈴薯削皮切成小塊放在鍋里煮爛后，連同汁一起和上述物質(zhì)全部混合配制成1000ml的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，煮沸后分裝滅菌。無(wú)菌檢測(cè)后，把外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.4 芽體的增殖培養(yǎng)基以及壯芽培養(yǎng)基的篩選

以從誘導(dǎo)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出來(lái)的芽作近一步增殖繼代培養(yǎng)篩選試驗(yàn)的材料，選用基本培養(yǎng)基MS，分別加上濃度為0，0.5，1.0，1.5，2. 0，2.5mg/L的細(xì)胞分裂素6-BA和濃度為0.2mg/L 的NAA，蔗糖30g/L，共6種處理；放在（25士2）℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天光照10h，光照強(qiáng)度為1500-2500lx。培養(yǎng)28天后觀察試驗(yàn)結(jié)果，查看分化出芽的總數(shù)、生長(zhǎng)反應(yīng)情況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析討論

2.1 初代培養(yǎng)

把消過(guò)毒后的材料接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，外植體培養(yǎng)15天后，外植體邊緣開(kāi)始萌動(dòng)出現(xiàn)愈傷組織，長(zhǎng)勢(shì)快；初代培養(yǎng)30天后愈傷組織為顆粒狀，繼續(xù)培養(yǎng)，顆粒狀的組織最終形成叢生的小芽。將叢生的小芽和嫩綠色的愈傷組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的配方為：MS十6-BA 3.0 mg /L + NAA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基。

2.2 增值、繼代培養(yǎng)基篩選結(jié)果

經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論，培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA對(duì)芽的增殖影響很大，同時(shí)還影響芽的分化、增殖、伸長(zhǎng)和生長(zhǎng)。隨著濃度升高增殖倍數(shù)也在增加，芽的長(zhǎng)度則表現(xiàn)為隨濃度升高而降低。當(dāng)6-BA增加的濃度達(dá)到一定值，如達(dá)到2.5mg/L時(shí)，芽的生長(zhǎng)開(kāi)始表現(xiàn)不正常，部分出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。從表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們可以看到，在接種芽數(shù)一定的情況下，隨著6-BA濃度的增加，增殖芽樹(shù)在不斷的增加，增殖的倍數(shù)也在增加，但是平均的芽長(zhǎng)在逐漸的減少。最后，從總體的情況看，我們選擇2號(hào)培養(yǎng)基做為繼代培養(yǎng)基效果最好，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)出來(lái)的苗芽伸長(zhǎng)快，并且有一定的增值倍數(shù)。5號(hào)培養(yǎng)基為增殖培養(yǎng)基，因?yàn)樵谠撆囵B(yǎng)基中培養(yǎng)出來(lái)的苗芽生長(zhǎng)情況和增值倍數(shù)高。

2.3 根誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選結(jié)果

以1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別加入NAA0.5 mg/L、IBA 0-1.0 mg/L的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，將增殖獲得的叢生芽剪切成約2cm的莖段，接種于6種不同生根培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基各接種20瓶，每瓶接種10株。接種約4周開(kāi)始生根，30天后統(tǒng)計(jì)芽苗出根情況。以上培養(yǎng)基都添加蔗糖30.0 g/L，瓊脂0.8% ，活性炭0.1%， pH 5.5。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論，僅添加NAA的培養(yǎng)基上，根較細(xì)，出根早，植株生長(zhǎng)較弱，在一定濃度NAA條件下，隨著IBA濃度的不斷升高從0.2 mg/L到0.6 mg/L，根變粗壯、根量變多，且植株生長(zhǎng)健壯；隨著IBA濃度的進(jìn)一步提高到1.0 mg/L，根的生長(zhǎng)被抑制，根數(shù)降低，植株生長(zhǎng)也一般。因此，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，劍葉龍血樹(shù)的最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+ IBA 0.4 mg/L +NAA 0.5 mg/ L生根率達(dá)100.0%。

3 結(jié)論

通過(guò)用劍葉龍血樹(shù)的頂芽或腋芽、莖段作外植體，建立了劍葉龍血樹(shù)的組織培養(yǎng)和再生體系。結(jié)果表明：劍葉龍血樹(shù)腋芽、頂芽或莖段誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0. 5mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)95%。選擇MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/ L+3 0 g/L的蔗糖+8 g/L瓊脂培養(yǎng)基有利于壯芽；選擇M S+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+30g/L的蔗糖+8g/L瓊脂培養(yǎng)基有利于芽增殖繼代；培養(yǎng)45d左右，每個(gè)外植體分化形成的再生小植株數(shù)達(dá)8～20個(gè)；在1/2MS+ IBA0.4mg/L + NAA0.2mg/L +活性炭0.1%的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根效果最好。

［1］靳靜晨，卜媚，羅雪楓，陳雄進(jìn)，譚家壯.A tissue culture technique for rapid propagation of Dracaenacambodiana Pierre ex Gagnep.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010.41（8）：755-757.

［2］何旭君，劉善輝，馮遠(yuǎn)來(lái) 林曉萍，張華通.海南龍血樹(shù)組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究.廣東林業(yè)科技，2006，22（1）：22-25

［3］吳繁花 朱文麗 莫饒 符常明.海南龍血樹(shù)的組織培養(yǎng).植物生理學(xué)通訊，2005，41（2）：186-187.

Q945

A

1674-2060（2016）02-0030-02

楊春燕（1969- ），女，副教授，云南開(kāi)放大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院生物技術(shù)及應(yīng)用專(zhuān)業(yè)，主要從事生物技術(shù)及組織培養(yǎng)方面的研究工作。