染料木黃酮通過(guò)抑制VEGF表達(dá)抑制人口腔癌TCA8113細(xì)胞增殖*

戴紅良，　葛樹(shù)卿，　楚明會(huì)，　梁春光，　王　玥，　賈桂枝

(遼寧醫(yī)學(xué)院 1護(hù)理學(xué)院， 2附屬第一醫(yī)院口腔科， 3生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

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染料木黃酮通過(guò)抑制VEGF表達(dá)抑制人口腔癌TCA8113細(xì)胞增殖*

戴紅良1△，葛樹(shù)卿2，楚明會(huì)1，梁春光1，王玥1，賈桂枝3

(遼寧醫(yī)學(xué)院1護(hù)理學(xué)院，2附屬第一醫(yī)院口腔科，3生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

[摘要]目的： 觀察染料木黃酮對(duì)人口腔癌TCA8113細(xì)胞增殖的影響，并探討其作用機(jī)制。方法: MTT法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法及集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖；蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)及p-ERK的蛋白水平。結(jié)果: 染料木黃酮能顯著抑制TCA8113細(xì)胞的增殖，其抗增殖活性具有濃度依賴性；染料木黃酮還可劑量依賴性地降低VEGF、ERK及p-ERK的蛋白水平；VEGF的表達(dá)可被ERK特異性抑制劑U0126所抑制；VEGF受體拮抗劑阿西替尼及U0126均顯著抑制TCA8113細(xì)胞的增殖。結(jié)論: 染料木黃酮可抑制人口腔癌TCA8113細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與其抑制ERK表達(dá)及活化，進(jìn)而抑制VEGF的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]染料木黃酮； TCA8113細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子； 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶

口腔鱗狀細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的口腔惡性腫瘤，占頭頸部腫瘤的80%以上[1]。在過(guò)去的十年間，口腔癌的發(fā)生率增加了50%。盡管治療手段不斷改善，患者的5年生存率也只有約50%[2]。而且即使通過(guò)手術(shù)切除，口腔癌仍存在著較高的局部復(fù)發(fā)率[3]，患者預(yù)后較差。因此，發(fā)掘新的治療口腔癌的藥物和方式具有重要的臨床價(jià)值和意義。

目前，天然藥物因其低毒高效的特點(diǎn)引起了科研人員的關(guān)注[4-5]。染料木黃酮(4’,5,7-三羥基異黃酮)是大豆及其制品中一種含量豐富的植物雌激素。除了其弱雌激素活性外，染料木黃酮還是一種強(qiáng)效的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)抑制劑, 能夠通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子的調(diào)節(jié)影響結(jié)腸直腸癌[6]、肝癌[7]、肺癌[8]及乳腺癌[9]等各種腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。除此之外，最近的研究還顯示染料木黃酮對(duì)體外培養(yǎng)的人口腔癌TCA8113細(xì)胞亦具有顯著的抗增殖活性[10]，但對(duì)于其抗口腔癌機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。本研究擬從血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)調(diào)控角度，探討染料木黃酮對(duì)口腔癌的增殖作用及其作用機(jī)理。

材料和方法

1材料

人口腔癌TCA8113細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自HyClone；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Coring；染料木黃酮(genistein)、胰蛋白酶、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]和阿西替尼(axitinib)購(gòu)于Sigma；RIPA裂解液購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)的 I 抗及辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的 II 抗購(gòu)自Santa Cruz；VEGF的I 抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人口腔癌TCA8113細(xì)胞株以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。用含0.25%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰酶消化細(xì)胞，每3 d傳代 1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TCA8113細(xì)胞以每孔1×105的密度接種于6孔板中。待細(xì)胞貼壁后，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中以不同處理因素在作用TCA8113細(xì)胞48 h，0.25% EDTA胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.3集落形成實(shí)驗(yàn)TCA8113細(xì)胞以每孔1 000 個(gè)的密度接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，以0.1% DMSO(對(duì)照組)及不同濃度的染料木黃酮作用TCA8113細(xì)胞10 d。PBS清洗后，以4%多聚甲醛于室溫固定20 min，再用PBS洗3遍，以結(jié)晶紫染色，按下式計(jì)算：集落形成率(colony-forming efficiency, CFE)=(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

2.4細(xì)胞活力檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁并實(shí)施各種處理后，加入MTT(終濃度為5 g/L)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去MTT, 加入150 μL DMSO在37 ℃ 作用10 min并充分振搖直到結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀(Bio-Rad)在波長(zhǎng)490 nm時(shí)檢測(cè)吸光度值。

2.5Western blotting實(shí)驗(yàn)細(xì)胞以預(yù)冷PBS洗3遍，加入RIPA細(xì)胞裂解液 [臨用前加入0.1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)] 提取細(xì)胞總蛋白， BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg總蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。待電泳完成后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜。用1%BSA封閉1 h，接著加待檢測(cè)蛋白的I抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST充分洗膜后，以HRP標(biāo)記的II抗室溫孵育2 h。TBST洗膜后，化學(xué)發(fā)光法顯色。采用Quantity One軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析及兩兩比較的SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1染料木黃酮對(duì)TCA8113細(xì)胞活力及計(jì)數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度染料木黃酮處理TCA8113細(xì)胞48 h后，隨著染料木黃酮濃度的增加，TCA8113細(xì)胞活力逐漸降低，細(xì)胞數(shù)逐漸減少，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Proliferation inhibitory effect of different concentrations (0～20 mg/L) of genistein on TCA8113 cells detected by MTT assay (A) and cell counting (B).Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖1不同濃度染料木黃酮對(duì)TCA8113細(xì)胞增殖的抑制作用

2染料木黃酮對(duì)TCA8113細(xì)胞集落形成的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度染料木黃酮處理TCA8113細(xì)胞10 d后，隨著染料木黃酮濃度的增加，TCA8113細(xì)胞集落形成率逐漸降低，當(dāng)藥物濃度達(dá)到20 mg/L時(shí)，幾乎沒(méi)有集落形成。而且，集落的面積也隨著藥物濃度的增加而減少,見(jiàn)圖2。

Figure 2.The colony-forming efficiency (CFE) of TCA8113 cells after treatment with genistein at different concentrations (0～20 mg/L) for 10 d. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2不同濃度染料木黃酮處理TCA8113細(xì)胞10 d后的細(xì)胞集落形成率

3染料木黃酮對(duì)TCA8113細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度染料木黃酮處理TCA8113細(xì)胞24 h后，TCA8113細(xì)胞VEGF的表達(dá)水平均隨著藥物濃度的增加而逐漸減弱，表明染料木黃酮具有抑制口腔癌細(xì)胞VEGF表達(dá)的生物活性，見(jiàn)圖3。

4染料木黃酮對(duì)TCA8113細(xì)胞ERK表達(dá)及活化的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度染料木黃酮處理TCA8113細(xì)胞24 h后，TCA8113細(xì)胞總ERK及磷酸化ERK(ERK的活化形式)的水平均隨著藥物濃度的增加而逐漸減弱，表明染料木黃酮可顯著抑制TCA8113細(xì)胞ERK的表達(dá)及活化，見(jiàn)圖4。

5U0126對(duì)TCA8113細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響

如圖5所示，ERK特異性阻斷劑U0126可顯著抑制VEGF的表達(dá)，表明基礎(chǔ)狀態(tài)下，口腔癌VEGF的表達(dá)受到ERK的調(diào)控，而染料木黃酮對(duì)VEGF表達(dá)的抑制作用可能與該物質(zhì)對(duì)ERK的活化抑制有關(guān)。

6U0126及阿西替尼對(duì)TCA8113細(xì)胞增殖的影響

ERK特異性阻斷劑U0126及VEGF受體(VEGFR)拮抗劑阿西替尼均可顯著抑制TCA8113細(xì)胞的增殖，表明ERK及VEGF的確參與了TCA8113細(xì)胞的增殖，而且VEGF的促增殖活性至少部分是由其受體(VEGFR)介導(dǎo)的。而上述染料木黃酮抗TCA8113細(xì)胞增殖的活性很有可能與其對(duì)ERK/VEGF信號(hào)級(jí)聯(lián)的抑制有關(guān)，見(jiàn)圖6。

討論

口腔癌是世界上第六種最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[11]。據(jù)估計(jì)，口腔癌的年發(fā)病率約為27.5萬(wàn)[12]。而且，近年來(lái)其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，并具有年輕化發(fā)展的趨勢(shì)[13-14]。盡管目前口腔癌的診療手段不斷進(jìn)步，但目前對(duì)于其治療仍極為困難，患者預(yù)后較差[11]。近些年，人們?cè)谝允中g(shù)和放療的基礎(chǔ)上，逐步引入化學(xué)治療，取得了不錯(cuò)的效果。但與此同時(shí)，化療藥物嚴(yán)重的毒副作用又大大限制了臨床上對(duì)口腔癌的治療[3]。因此，極有必要開(kāi)發(fā)毒副作用小、療效高的抗口腔癌藥物。

Figure 3.The effect of genistein at different concentrations (0～20 mg/L) on the expression of VEGF in the TCA8113 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3不同濃度染料木黃酮對(duì)TCA8113細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響

Figure 4.The effect of genistein at different concentrations (0～20 mg/L) on the expression and activation of ERK in TCA8113 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4不同濃度染料木黃酮對(duì)TCA8113細(xì)胞ERK的表達(dá)及活化的影響

Figure 5.The effect of U0126 on the expression of VEGF in the TCA8113 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5U0126對(duì)TCA8113細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響

Figure 6.Proliferation inhibitory effect of U0126 (10 μmol/L) and axitinib (5 μmol/L) on TCA8113 cells detected by MTT assay (A) and cell counting (B).Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖6U0126及阿西替尼對(duì)TCA8113細(xì)胞增殖的抑制作用

近年來(lái)天然物質(zhì)因其高效低毒的特性受到了越來(lái)越多的關(guān)注[5,15]。染料木黃酮化學(xué)名為4’,5,7-三羥基異黃酮，是在大豆等植物中形成的天然異黃酮類(lèi)物質(zhì)，廣泛存在于人們的日常飲食之中[16]。研究證實(shí)染料木黃酮具有抑制平滑肌源性泡沫細(xì)胞的形成[17]、緩解糖尿病心肌病心肌炎癥和氧化應(yīng)激[18]及抗腫瘤[7]等多種生物活性。尤其是其抗腫瘤活性更是得到了普遍認(rèn)同。許多研究證實(shí)染料木黃酮對(duì)乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤均顯示出強(qiáng)大的抗癌活性[19]。本研究發(fā)現(xiàn)染料木黃酮能夠劑量依賴性地抑制口腔癌細(xì)胞的活力、細(xì)胞計(jì)數(shù)、集落形成率及其集落形成的面積，顯示出染料木黃酮強(qiáng)大的口腔癌增殖抑制活性，這與張群[10]之前的研究報(bào)道一致。

血管生成是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的重要機(jī)制。目前已發(fā)現(xiàn)多種參與血管生成的基因，其中VEGF作為強(qiáng)大的血管生成因子，廣泛地表達(dá)于包括口腔癌細(xì)胞在內(nèi)的各種癌癥細(xì)胞上[20-21]。研究顯示VEGF能促進(jìn)舌癌中血管的生成，促進(jìn)舌癌的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移；VEGF靶向干擾則可明顯抑制口腔癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[20]。本研究則進(jìn)一步證實(shí)VEGF的促口腔癌增殖活性可能是由其受體介導(dǎo)的。之前研究報(bào)道顯示染料木黃酮可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)抑制各種腫瘤的增殖生長(zhǎng)[22]，但尚不清楚該天然物質(zhì)對(duì)口腔癌細(xì)胞的抑制作用是否與其對(duì)VEGF表達(dá)的抑制有關(guān)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的染料木黃酮可劑量依賴性地抑制人口腔癌TCA8113細(xì)胞VEGF的表達(dá)，從而提示染料木黃酮對(duì)VEGF的表達(dá)的抑制作用可能是其抗口腔癌進(jìn)展的重要機(jī)理。

ERK是絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)家族的關(guān)鍵分子。ERK在許多惡性腫瘤中被異常激活，從而參與細(xì)胞的癌變、惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等[23]。最近研究發(fā)現(xiàn)ERK的激活與口腔癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)[24-25]。而且，MEK的特異性抑制劑PD184352可劑量依賴性地抑制TCA8113細(xì)胞的增殖[26]。上述研究均提示ERK可能是口腔癌化學(xué)治療的重要靶點(diǎn)。研究顯示染料木黃酮可通過(guò)抑制ERK的活化抑制宮頸癌及肝癌的增殖[7,27]，而對(duì)于口腔癌SCC15細(xì)胞，染料木黃酮不僅可抑制ERK活化(磷酸化)，還可抑制總ERK的表達(dá)[28]。在本實(shí)驗(yàn)中我們利用Western blot發(fā)現(xiàn)，與SCC15細(xì)胞類(lèi)似，染料木黃酮對(duì)TCA8113細(xì)胞ERK的表達(dá)及活化均呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制作用。ERK促進(jìn)癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制之一即是促進(jìn)VEGF的表達(dá)及腫瘤血管化[20]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，ERK特異性阻斷劑U0126亦可顯著抑制TCA8113細(xì)胞VEGF的表達(dá)。表明口腔癌VEGF的表達(dá)及其血管化也是ERK依賴性的。綜上所述，我們推測(cè)染料木黃酮可能通過(guò)抑制ERK的表達(dá)及活化，進(jìn)而抑制VEGF的表達(dá)，從而抑制口腔癌TCA8113細(xì)胞的增殖。

口腔癌是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，患者一般預(yù)后較差。而化學(xué)合成藥物因其嚴(yán)重的毒副作用限制了其療效的發(fā)揮。而本研究證實(shí)價(jià)格低廉、毒副作用小的天然物質(zhì)染料木黃酮具有顯著的抗口腔癌增殖活性，其抗癌機(jī)理可能與其抑制ERK/VEGF信號(hào)通路的活化有關(guān)。該研究為臨床上嘗試使用該物質(zhì)進(jìn)行口腔癌治療提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Genistein inhibits proliferation of human oral cancer TCA8113 cells through suppression of VEGF expression

DAI Hong-liang1, GE Shu-qing2, CHU Ming-hui1, LIANG Chun-guang1, WANG Yue1, JIA Gui-zhi3

(1SchoolofNursing，2DepartmentofStomatology,TheFirstAffiliatedHospital,3DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China.E-mail:jy2006hldai@sohu.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of genistein on the proliferation of human oral cancer TCA8113 cells and to explore the underlying mechanisms.METHODS: The cell proliferation was examined by MTT assay, cell counting and colony formation assay. Western blotting was employed to examine the protein levels of vascular endothelial growth factor (VEGF), extracellular signal-regulated kinase (ERK) and p-ERK. RESULTS: Genistein significantly inhibited the proliferation of TCA8113 cells in a concentration-dependent fashion. Moreover, genistein dose-dependently decreased the protein levels of VEGF, ERK and p-ERK. The expression of VEGF was also blunted by U0126, a specific inhibitor of ERK. U0126 and axitinib, a VEGF receptor antagonist, both significantly inhibited the proliferation of TCA8113 cells. CONCLUSION: Genistein inhibits the proliferation of TCA8113 cells, which may be related to its inhibitory effect on ERK expression and activation, thus subsequently decreasing the expression of VEGF.

[KEY WORDS]Genistein; TCA8113 cell; Cell proliferation; Vascular endothelial growth factor; Extracellular signal-regulated kinase

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.013

[中圖分類(lèi)號(hào)]R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 0416-4673688； E-mail: jy2006hldai@sohu.com

*[基金項(xiàng)目]遼寧省自然科學(xué)基金(聯(lián)合基金)資助項(xiàng)目(No. 2013022037)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長(zhǎng)基金-奧鴻博澤大學(xué)生科技創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(No. 2015D20)

[收稿日期]2015- 10- 10[修回日期] 2015- 12- 09

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)03- 0464- 06

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