FOXQ1基因介導了Shh誘導的SW480 細胞血管生成及增殖

朱雙偉，　李相述，　彭旭東，　陳　誠，　陳小龍，　魏正強

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科, 重慶 400016)

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FOXQ1基因介導了Shh誘導的SW480 細胞血管生成及增殖

朱雙偉，李相述，彭旭東，陳誠，陳小龍，魏正強△

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科, 重慶 400016)

[摘要]目的： 探討FOXQ1基因沉默對大腸癌SW480細胞血管生成及增殖能力的影響及其在Sonic hedgehog(Shh)通路中的作用。方法：以攜帶FOXQ1-shRNA的慢病毒載體感染SW480細胞，將細胞株分為FOXQ1-shRNA和NC-shRNA組，利用臍靜脈內皮細胞系926細胞行體外血管形成實驗，熒光顯微鏡觀察2組細胞血管形成能力，MTT、倍增時間、平板克隆形成實驗檢測2組細胞的存活率，real-time PCR、Western blot檢測血管內皮生長因子(VEGF)-A、基質金屬蛋白酶(MMP)2和cyclin D1 mRNA和蛋白水平。利用重組Shh蛋白誘導上述2組細胞，觀察誘導前后細胞存活率及血管形成能力的變化，檢測上述分子的表達差異。結果：與NC-shRNA組細胞相比，F(xiàn)OXQ1-shRNA組細胞的體外血管形成能力降低，而存活率無明顯變化，real-time PCR及Western blot顯示FOXQ1基因沉默后，VEGF-A和MMP2的表達下調，cyclin D1表達無顯著差異。與NC-shRNA組比較，重組Shh蛋白誘導的FOXQ1-shRNA體外血管形成能力更低，存活率無明顯差異。結論：FOXQ1基因介導了大腸癌SW480細胞的血管形成能力，對存活率無明顯影響，并且可能受到Shh通路調控。

[關鍵詞]FOXQ1基因； Sonic hedgehog； 大腸癌； 細胞增殖； 血管生成

結直腸癌在世界多數(shù)國家的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢[1]。結直腸癌細胞的惡性行為包括過度異常的增殖、血管形成能力、侵襲遷移、對藥物敏感性的變化等，涉及Wnt/β-catenin、Hedgehog、TGF-β/Smads等多種信號通路及轉錄因子(snail、GLI2等)[2-4]。

FOXQ1基因是叉頭框(forkhead box，F(xiàn)OX)基因家族的重要成員之一[3]。近年來，其作為原癌基因的角色逐漸被人們認識，其與信號通路間的相互作用與腫瘤密切相關[4-5]。研究表明在大腸癌組織中FOXQ1基因表達明顯增高，并與腫瘤的分期及轉移相關，這提示其可能參與了結直腸癌發(fā)生發(fā)展，但具體機制尚待進一步研究[6-7]。我們前期的實驗已證實，其與大腸癌上皮間質轉化關系密切[8-9]，而FOXQ1是否參與了大腸癌細胞的血管形成及增殖尚待進一步研究。

Sonic hedgehog(Shh)信號通路在胚胎發(fā)育、細胞分化、維持組織極性及組織損傷與修復過程中發(fā)揮重要作用，在正常成熟組織中處于失活狀態(tài)，近年來在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)Shh信號通路異常激活，參與調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展及惡性生物學行為的維持[10-11]。研究表明Shh的表達與大腸癌的關系密切，參與了大腸癌細胞的增殖、血管形成及遠處轉移[12-13]。FOX為近年來新發(fā)現(xiàn)的轉錄因子超家族，其中有許多受到Shh通路的調節(jié)，參與腫瘤的發(fā)展[14]，F(xiàn)OXQ1與Shh信號通路的關系待進一步研究。

本研究利用基因沉默技術沉默大腸癌細胞SW480的FOXQ1基因，觀察FOXQ1基因沉默對SW480細胞血管形成和存活率的影響。為了探索FOXQ1是否介導了Shh通路所誘導的惡性行為，我們采用重組Shh蛋白誘導SW480 細胞，觀察誘導前后細胞的血管形成及存活率的改變。

材料和方法

1材料

大腸癌SW480細胞株、臍靜脈內皮細胞系926細胞株(EA.hy926)由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗研究中心保存；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清為HyClone產品；FOXQ1-shRNA沉默慢病毒載體、陰性對照(negative control,NC)慢病毒載體均購于上海紐恩生物科技公司；重組蛋白Shh購于PeproTech；real-time PCR相關試劑盒及擴增引物均為TaKaRa產品；兔抗人FOXQ1蛋白抗體為Santa Cruz產品；兔抗人血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)-A、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2和細胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗體為武漢三鷹公司的產品；鼠抗人GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠 II 抗、兔抗兔 II 抗均為ABgent產品；Western blot相關試劑盒均購于上海碧云天公司。

2實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)SW480細胞和EA.hy926細胞在含12%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基、5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。重組蛋白Shh誘導細胞的濃度為10 μg/L，誘導時間為48 h。

2.2慢病毒轉染及有效沉默序列的篩選用于轉染的攜帶FOXQ1-shRNA(3種)及陰性NC-shRNA慢病毒沉默序列分別如下：FOXQ1-sh1為5′-CGCGGACUUUGCACUUUGA-3′，F(xiàn)OXQ1-sh2為5′-CCAGCTCCTTCGCCATCGACA-3′，F(xiàn)OXQ1-sh3為5′-GGCUGGCUUCAUCCACUGC-3′，NC-shRNA為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。消化調整細胞濃度為2×108/L，取每孔1 mL種于6孔板中(分陰性組、sh1組、sh2組和sh3組，每組3個復孔)，搖勻后常規(guī)培養(yǎng)。14 h后 以MOI=30分別加入上述4種病毒載體，并每孔加入終濃度為5 mg/L的轉染增敏劑polybrene，16 h后換液。轉染72 h后于熒光顯微鏡下觀察熒光強度，明確轉染效率。消化擴大培養(yǎng)后提取總RNA和總蛋白檢測沉默效果，選取效果最好的慢病毒載體為后續(xù)轉染載體，將細胞分為FOXQ1-shRNA組(感染FOXQ1-sh慢病毒的SW480細胞)和NC-shRNA組(感染陰性對照序列的SW480細胞)。采用NC-shRNA序列轉染EA.hy926細胞，除鋪板是密度為每孔5×104外，其余方法同上。

2.3Real-time PCR法檢測FOXQ1、VEGF-A、MMP2和cyclin D1 mRNA的水平檢測用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄得到cDNA，用CFX96擴增儀分別擴增各目的基因。擴增條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán); 最后72 ℃ 10 min。各目的基因引物序列見表1。

表1　各目的基因的引物序列

2.4FOXQ1、VEGF-A、MMP2和cyclin D1蛋白水平的檢測提取總蛋白并測濃度，電泳時每個泳道分別加入50 μg蛋白，電泳時間約為2 h。根據(jù)各目的蛋白分子量切膠，并轉至PVDF膜上，TBST洗膜后5%脫脂牛奶封閉2 h，分別用GAPDH(1∶2 000)、FOXQ1(1∶2 000)、VEGF-A(1∶500)、MMP2(1∶500)、cyclin D1(1∶500) I抗，4 ℃過夜。37 ℃復溫2 h后，分別用辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠、兔抗兔 II 抗，37 ℃孵育2 h。利用ECL發(fā)光液顯色，F(xiàn)usion軟件分析光密度。

2.5體外血管形成實驗取各組細胞不換液連續(xù)培養(yǎng)3 d后的培養(yǎng)基1 mL，再與1 mL完全培養(yǎng)基混勻后加入6孔板中。取2.5×105個NC-shRNA病毒感染的EA.HY926細胞接種于上述培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，顯微鏡下觀察血管形成情況，攝片，計數(shù)。

2.6MTT法檢測細胞存活率和生長曲線取對數(shù)生長期的2組細胞，消化并計數(shù)，制成1×107/L細胞懸液，每孔接種200 μL至96孔板內，設6個平行孔。即刻、24 h、48 h、72 h每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，4 h后去上清液，每孔加150 μL DMSO，在全波長自動酶標儀570 nm處比色測吸光度(A)值。以橫坐標為時間，縱坐標為吸光度值，繪制3組細胞生長曲線。倍增時間：取2×103細胞加入培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)7 d，每組重復3次。第7天消化、計數(shù)，計算倍增時間(h)=7×[lg2/(lgN7-lgN0)]×24(N0、N7分別為首次、7 d時的細胞數(shù))。平板克隆形成實驗：取狀態(tài)良好的細胞，用0.125%胰蛋白酶消化吹勻，計數(shù)，取2 000個細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每組設3個重復孔，常規(guī)培養(yǎng)15 h。4%多聚甲醛固定后，結晶紫染色，用CanoScan 9000F MarkII 掃描儀進行集落掃描，計數(shù)每孔集落數(shù)(以大于50 個細胞聚集計為1 個集落)。

3統(tǒng)計學處理

采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量的方差分析；多組之間的均數(shù)比較采用完全隨機設計的方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1FOXQ1-sh1成功沉默SW480細胞FOXQ1基因

Real-time PCR和Western blot 實驗結果表明，第一條序列即FOXQ1-sh1沉默效果最佳。FOXQ1-sh1組與NC-shRNA組比較其mRNA水平下降了85.3%，蛋白質水平下降了75.7%，F(xiàn)OXQ1的mRNA和蛋白表達量在陰性組和對照組之間的差異沒有統(tǒng)計學顯著性，見圖1。后續(xù)實驗均以FOXQ1-sh1為沉默載體轉染細胞，命名為FOXQ1-shRNA組。NC-shRNA組轉染的細胞為陰性對照組，未轉染細胞為正常對照(control)組。

2沉默F(xiàn)OXQ1基因對SW480細胞的血管形成能力的影響

FOXQ1-shRNA組管腔形成的數(shù)量明顯少于NC-shRNA組(P<0.05)，同時FOXQ1-shRNA組大多沒有形成的完整管腔，且直徑明顯小于對照組,見圖2。

3沉默F(xiàn)OXQ1基因對SW480細胞存活率的影響

利用MTT、倍增時間及平板克隆來檢測2組細胞存活率的差異。結果表明，2組細胞的存活率沒有明顯差別。FOXQ1-shRNA組與NC-shRNA組細胞發(fā)生倍增的時間、集落形成數(shù)及細胞的存活率均無明顯差異,見圖3。

4沉默F(xiàn)OXQ1基因對SW480細胞VEGF-A、MMP2和cyclin D1 mRNA和蛋白表達的影響

FOXQ1-shRNA組的VEGF-A、MMP2的相對表達量分別為NC-shRNA組的(33.8±1.4)%和(35.7±9.4)%(P<0.01)，cyclin D1表達無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

5Shh通路可誘導SW480 細胞的FOXQ1表達

利用含重組Shh蛋白(10 μg/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)SW480細胞，48 h后，檢測細胞FOXQ1的表達變化，結果表明,重組蛋白Shh的處理能夠明顯增加SW480細胞FOXQ1的表達，見圖5。

6FOXQ1介導了Shh誘導的細胞血管生成能力的改變

在NC-shRNA組中，Shh的誘導明顯增強了細胞的血管形成，而在FOXQ1-shRNA組中Shh促血管形成能力程度有所減弱,見圖6。

細胞存活率實驗表明Shh的誘導明顯增強了NC-shRNA組細胞的存活率，且與FOXQ1-shRNA組無明顯差異，見圖7。

在NC-shRNA組的細胞中，Shh誘導上調了MMP2、VEGF-A和cyclin D1的表達；在FOXQ1-shRNA組的細胞中，Shh誘導也可導致上述變化，但MMP2和VEGF-A的誘導程度均較NC-shRNA組細胞低，cyclin D1的誘導程度無明顯差異，說明FOXQ1基因沉默可以部分逆轉Shh所誘導的VEGF-A和MMP2的表達，見圖8。

討論

FOXQ1基因是叉頭框基因家族的重要成員之一[3]。近年來，其作為原癌基因的角色逐漸被人們認識，與多種信號通路間的相互作用均與腫瘤密切相關[6-7]。國內外的研究表明在大腸癌組織中FOXQ1基因表達明顯增高，并與腫瘤的分期及轉移相關，已證實在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中，F(xiàn)OXQ1與腫瘤發(fā)生EMT關系密切，其異常表達可能導致E-cadherin的下調從而促進發(fā)生上皮間質轉化，但其在結直腸癌的血管形成和生存率的作用及機制的研究，鮮有報道。

Figure 1.Silencing ofFOXQ1 expression in SW480 cells determined by real-time PCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsFOXQ1-sh3;##P<0.01vscontrol group.

圖1Real-time PCR和Western blot 檢測FOXQ1基因干擾的效率

Figure 2.The images of angiogenesisinvitroassay. The number of tube formation of human umbilical vein endothelial cells in various groups were counted by fluorescence microscopy (×100).

圖2體外血管形成實驗

Figure 3.The proliferation ability of SW480 cells in different treatment groups. A: the effect ofFOXQ1 gene on the cell activity in each group was detected by MTT assay; B: after regular cultured for 7 d, the cell doubling time was calculated according to the formula; C: the images of the colony formation test in the 2 groups were showed. Mean±SD.n=3.

圖3FOXQ1基因沉默對SW480細胞的生長能力、細胞倍增時間和平板克隆實驗結果的比較

Kaneda等[6]的研究通過微陣分析，發(fā)現(xiàn)FOXQ1可通過上調WNT3A、RSPO2等基因從而調控結腸腫瘤的血管生成。我們的研究結果表明，F(xiàn)OXQ1可以通過對MMP2及VEGF-A的調控從調控的血管生成能力，這進一步闡明了其具體機制；Kaneda等[6]的研究還發(fā)現(xiàn)，在體外和體內實驗中FOXQ1對增殖能力的影響呈相反表現(xiàn)，但在乳腺癌及胰腺癌等的研究中FOXQ1能促進增殖能力[15]，我們的研究中FOXQ1對cyclin D1促增殖基因無調控作用，致其對生存率無影響支持其體外實驗的結論，這會不會與缺氧等微環(huán)境因素相關或者干細胞特性獲取有關，值得進一步研究。

Shh信號通路轉錄因子包括Gli1、Gli2和Gli3。Chatel等[16]報道在Shh通路在大腸癌SW480細胞株并沒有完整表達，主要是缺乏終末轉錄因子Gli1。然而大量的臨床研究及細胞學實驗都表明Shh的表達與大腸癌的關系密切[17]。仔細分析前人的研究，我們可以發(fā)現(xiàn)Gli2是Shh通路中除Gli1外的第二重要轉錄因子，基因組學研究表明它可以直接上調Gli1、CCND1、FOXA2、FOXC2、FOXP3等基因[17]，聯(lián)系我們的結果，課題組認為正是Gli2調控FOXQ1的表達，而FOXQ1又可以發(fā)揮管理細胞惡性行為的作用，從而導致FOXQ1沉默可以部分逆轉Shh通路所誘導的促血管生成作用，而之所以FOXQ1基因對Shh所誘導增殖無明顯影響是因為FOXQ1基因自身對Cyclin D1等促增殖基因無調控作用。

Figure 4.The expression of VEGF-A, MMP2 and cyclin D1 at mRNA and protein levels in the cells with or without silencing of FOXQ1 was detected by real-time PCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC-shRNA group.

圖4Real-time PCR和Western blot檢測VEGF-A、MMP2和cyclin D1的mRNA和蛋白表達水平

Figure 5.After induced by recombinant Shh proteins for 48 h, the FOXQ1 expression at mRNA and protein levels in the SW480 cells was determined by real-time PCR and Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNc-shRNA group.

圖5利用含重組蛋白Shh培養(yǎng)基培養(yǎng)NC-shRNA轉染細胞48 h后檢測FOXQ1基因的表達情況

本研究的結果進一步揭示了FOXQ1在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子作用機理，這可能為尋找大腸癌生物治療新的作用靶點提供理論依據(jù)，為大腸癌的靶向治療提供新的思路。

Figure 6.FOXQ1 gene silencing partially reversed the angiogenic ability induced by Shh protein induction. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsShh+NC-shRNA group.

圖6FOXQ1基因沉默可部分逆轉Shh所誘導SW480細胞的促血管生成能力

Figure 7.FOXQ1 gene silencing had no obvious difference on proliferation ability induced by Shh protein induction. Mean±SD.n=3.

圖7FOXQ1基因沉默對Shh所誘導SW480細胞增殖能力的影響

Figure 8.FOXQ1 gene silencing partially reversed the expressions of VEGF-A and MMP2 at mRNA and protein levels in the cells induced by Shh protein induction. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsShh+NC-shRNA group.

圖8FOXQ1基因沉默對3組細胞VEGF-A、MMP2和cyclin D1表達情況的影響

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

FOXQ1 gene mediate angiogenesis and proliferation induced by Shh in SW480 cells

ZHU Shuang-wei, LI Xiang-shu, PENG Xu-dong, CHEN Cheng, CHEN Xiao-long, WEI Zheng-qiang

(DepartmentofGeneralSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:384535713@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effect of FOXQ1 gene silencing on angiogenesis and proliferation ability of colon cancer cells induced by Sonic hedgehog (Shh). METHODS: Lentivirus expressing different FOXQ1-shRNA or negative cantrol (NC)-shRNA was used to infect the SW480 cells. The best silencing condition was screened and used in the following experiments. The SW480 cells were divided into interfered group (FOXQ1-shRNA) and control group (NC-shRNA). The MTT assay was used to observe the doubling time and cell activity. Tube formation assay was performed to detect the ability of angiogenesis. Meanwhile, the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)-A, matrix metalloproteinase (MMP) 2 and cyclin D1 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot. After induction of the cells by recombinant Shh proteins, the changes of angiogenesis and proliferation ability in each group were detected. At the same time, the transformation of related gene was examined. RESULTS: Compared with control group, the angiogenic ability in interfered group was decreased, and no obvious difference of proliferation ability was observed. The expression of VEGF-A and MMP2 was declined significantly, and the expression of cyclin D1 was not obviously changed. Recombinant Shh proteins improved the expression of FOXQ1 gene. Compared with NC-shRNA group, after induction, the angiogenic ability of FOXQ1-shRNA group was decreased, and the proliferation ability was not obviously changed. CONCLUSION: FOXQ1 gene mediates the angiogenic ability but does not affect the proliferation ability of SW480 cells. Meanwhile, it may be regulated by shh pathway.

[KEY WORDS]FOXQ1 gene; Sonic hedgehog; Colorectal cancer; Cell proliferation; Angiogenesis

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.014

[中圖分類號]R730.23； R392-33； R735.3+4

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 023-89011172; E-mail：384535713@qq.com

[收稿日期]2015- 08- 21[修回日期] 2015- 12- 24

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0470- 07

雜志網址： http://www.cjpp.net