莫倩珍　劉靜

摘要：科學(xué)研究的需要，使得倒置熒光顯微鏡在醫(yī)學(xué)科研型研究生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的使用越來(lái)越普遍，因此正確使用和妥善管理顯得尤為重要。本文從使用與管理角度加以討論，總結(jié)了使倒置熒光顯微鏡更好地為實(shí)驗(yàn)教學(xué)服務(wù)的方法。

關(guān)鍵詞：倒置熒光顯微鏡；實(shí)驗(yàn)教學(xué)；正確使用；妥善管理

中圖分類(lèi)號(hào)：G647 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2016）16-0261-02

倒置熒光顯微鏡是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡，其由倒置顯微鏡和落射熒光裝置組成，具有在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行顯微觀察的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)活體細(xì)胞和組織、流質(zhì)、沉淀物等的相差、熒光觀察是科學(xué)研究工作中的理想儀器。所以，在醫(yī)學(xué)科研型研究生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，掌握倒置熒光顯微鏡的使用至關(guān)重要，只有正確的使用和妥善的管理倒置熒光顯微鏡，才能發(fā)揮它的功能和提高使用率，使之更好地為實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科學(xué)研究服務(wù)。

一、倒置熒光顯微鏡的正確使用

倒置熒光顯微鏡是用于高端生物科學(xué)研究領(lǐng)域的多功能顯微鏡，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且價(jià)格昂貴，因此，要想醫(yī)學(xué)研究生正確掌握倒置熒光顯微鏡的操作使用規(guī)范，教師得首先在示范倒置熒光顯微鏡的實(shí)際操作之前，開(kāi)設(shè)學(xué)習(xí)倒置熒光顯微鏡基本知識(shí)的課程，介紹倒置熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理、功能和基本使用方法，再在具體的使用操作中，針對(duì)不同的標(biāo)本，示范不同的功能，由淺入深，逐漸使醫(yī)學(xué)研究生對(duì)倒置熒光顯微鏡的操作使用規(guī)范化。

1.明視野觀察的正確使用。倒置熒光顯微鏡的功能之一是明視野觀察，其基本原理是標(biāo)本經(jīng)光線照射后，各部分對(duì)光吸收的不同而在明亮的背景中實(shí)現(xiàn)成像，主要適用于經(jīng)染色或本身具有顏色的細(xì)胞、組織切片等標(biāo)本的觀察。其基本步驟為：①打開(kāi)外置白光電源供電器開(kāi)關(guān)和倒置熒光顯微鏡左側(cè)的白色按鈕開(kāi)關(guān)；②通過(guò)倒置熒光顯微鏡的左側(cè)光強(qiáng)調(diào)節(jié)旋鈕，調(diào)整到合適的照明亮度；③確認(rèn)照明支柱上方的NCB11、ND、D濾光片推進(jìn)光路；④旋轉(zhuǎn)倒置熒光顯微鏡右側(cè)的旋鈕，使光路處于“EYE”位置；⑤調(diào)節(jié)目鏡筒瞳距和屈光度；⑥旋轉(zhuǎn)聚光鏡轉(zhuǎn)盤(pán)，將“A”檔移入光路；⑦放置切片標(biāo)本，通過(guò)旋轉(zhuǎn)對(duì)焦手輪對(duì)標(biāo)本進(jìn)行聚焦；⑧用所需的放大倍數(shù)物鏡觀察標(biāo)本。明視野觀察是所有顯微鏡具備的功能，普通應(yīng)用于科學(xué)研究中。醫(yī)學(xué)研究生由于本科畢業(yè)于不同的院校，文化背景參差不齊，對(duì)顯微鏡的掌握程度不同，因此教師在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中很有必要再次向他們灌輸良好的使用習(xí)慣。另外，還要向他們講解常見(jiàn)問(wèn)題出現(xiàn)時(shí)應(yīng)采取的策施。例如，接通電源開(kāi)關(guān)而燈不亮?xí)r，可檢查亮度控制按鈕是否打開(kāi)、電源線是否接觸良好、燈泡是否燒壞；視場(chǎng)圖像模糊時(shí)，可通過(guò)逐步移動(dòng)物鏡、目鏡和載玻片來(lái)尋找原因；旋轉(zhuǎn)亮度調(diào)節(jié)旋鈕而亮度無(wú)變化時(shí)，可檢查控制線是否正確連接。

2.相差觀察的正確使用。倒置熒光顯微鏡的功能之二是相差觀察，其基本原理是將樣本不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?，?jīng)過(guò)帶有相位片的相差物鏡和帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡實(shí)現(xiàn)觀測(cè)，主要適用于活細(xì)胞或不染色的組織切片觀察。其基本步驟為：①打開(kāi)外置白光電源供電器開(kāi)關(guān)和倒置熒光顯微鏡左側(cè)的白色按鈕開(kāi)關(guān)；②通過(guò)倒置熒光顯微鏡的左側(cè)光強(qiáng)調(diào)節(jié)旋鈕，調(diào)整到合適的照明亮度；③確認(rèn)照明支柱上方的NCB11、ND、D濾光片推進(jìn)光路；④旋轉(zhuǎn)倒置熒光顯微鏡右側(cè)的旋鈕，使光路處于“EYE”位置；⑤調(diào)節(jié)目鏡筒瞳距和屈光度；⑥旋轉(zhuǎn)聚光鏡轉(zhuǎn)盤(pán)，將合適的相差環(huán)轉(zhuǎn)入光路（4X對(duì)應(yīng)PHL，10X/20X對(duì)應(yīng)PH1，40X對(duì)應(yīng)PH2）；⑦放置細(xì)胞標(biāo)本，通過(guò)粗微調(diào)機(jī)構(gòu)對(duì)標(biāo)本對(duì)焦；⑧用所需的放大倍數(shù)物鏡觀察標(biāo)本。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中，除了正確引導(dǎo)醫(yī)學(xué)研究生遵守相差觀察的基本操作方法，同時(shí)更為重要的是引導(dǎo)他們對(duì)使用相差觀察的標(biāo)本認(rèn)識(shí)和掌握。對(duì)他們來(lái)說(shuō)，在日后的科學(xué)研究中，最為常用的是培養(yǎng)細(xì)胞的顯微觀察。但是學(xué)生在初入研究生階段，可能對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的器材和細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有完整的認(rèn)識(shí)，甚至都未真正接觸，從而不能完全找到正確的視野和正確掌握相差觀察的使用。這就要求教師在教學(xué)過(guò)程中明確地為研究生講解細(xì)胞標(biāo)本的制備方法，并告訴他們?cè)谟^察時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題。首先，對(duì)于細(xì)胞器材的選擇，一般建議使用玻璃材質(zhì)和塑料材質(zhì)的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶。它們多為無(wú)色透明，可直接在倒置熒光顯微鏡上進(jìn)行觀察，不用倒掉細(xì)胞液和經(jīng)過(guò)其他處理。其次，在進(jìn)行顯微觀察中，不要隨意打開(kāi)器材的蓋子，以免污染細(xì)胞。最后，對(duì)于操作人員來(lái)說(shuō)，需佩戴手套、口罩和白大衣，不僅可以保護(hù)自身健康而且可以防止細(xì)胞污染。

3.熒光觀察的正確使用。倒置熒光顯微鏡的功能之三是熒光觀察，其基本原理是利用激發(fā)光激發(fā)樣本產(chǎn)生熒光，從而實(shí)現(xiàn)樣本的形狀與定位觀察，主要適用于熒光標(biāo)記樣本的觀察。其基本步驟為：①通過(guò)相差觀察步驟找到標(biāo)本對(duì)焦；②打開(kāi)外置熒光供電器電源開(kāi)關(guān)，長(zhǎng)按激發(fā)按鈕激發(fā)汞燈；③通過(guò)關(guān)閉倒置熒光顯微鏡左側(cè)的白色按鈕開(kāi)關(guān)來(lái)關(guān)閉白光；④確認(rèn)熒光的視場(chǎng)光闌、孔徑光闌、供電器上的SHUTER光閘全部打開(kāi)；⑤確認(rèn)熒光供電器上的ND旋鈕在1位置、熒光濾色塊轉(zhuǎn)盤(pán)上的熒光光閘在O位置；⑥旋轉(zhuǎn)熒光濾色塊轉(zhuǎn)盤(pán)，使合適的熒光濾光塊進(jìn)入光路；⑦用所需的放大倍數(shù)物鏡觀察標(biāo)本。熒光觀察是倒置熒光顯微鏡的重要功能，其配件昂貴且使用特殊。要想醫(yī)學(xué)研究生正確地掌握熒光觀察的操作使用規(guī)范，教師除了教會(huì)他們掌握基本的操作方法，同時(shí)更為重要的是教會(huì)他們掌握它的特殊性。首先，在標(biāo)本制作中，載玻片和蓋玻片應(yīng)表面光潔且厚度適宜（載玻片在0.8mm～1.2mm之間，蓋玻片在0.17mm左右）；標(biāo)本應(yīng)厚度適宜，同時(shí)避免細(xì)胞重疊或雜質(zhì)掩蓋；封裱劑應(yīng)使用甘油和碳酸鹽緩沖液（0.5mol/L PH9.0～9.5）的等量混合液。其次，在熒光觀察前，應(yīng)關(guān)閉房間內(nèi)的電燈和倒置熒光顯微鏡的白光，確保處于暗室環(huán)境。最后，在熒光觀察中，應(yīng)嚴(yán)格控制觀察時(shí)間，一般以1～2小時(shí)/次為宜，否則熒光會(huì)出現(xiàn)衰減和消失的現(xiàn)象；調(diào)整光源時(shí)應(yīng)佩戴防護(hù)眼鏡，避免紫外線對(duì)眼鏡的傷害。

4.圖像拍攝的正確使用。在科學(xué)研究中，不僅要求倒置熒光顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)多種觀察，而且要求倒置熒光顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)圖像拍攝。倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)通過(guò)光電轉(zhuǎn)換將光學(xué)顯微鏡與計(jì)算機(jī)結(jié)合在一起，不僅可以在目鏡上進(jìn)行顯微觀察，而且可以在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)圖像的觀察、編輯和保存。其基本步驟為：①打開(kāi)電腦，插入軟件加密鎖；②打開(kāi)桌面軟件NIS-ELEMENTS；③倒置熒光顯微鏡的顯微鏡右側(cè)旋鈕，使光路切換至“L”位置，即光路進(jìn)入相機(jī)；④點(diǎn)擊“預(yù)覽圖標(biāo)”，顯示live實(shí)時(shí)圖像；⑤選擇合適的曝光時(shí)間和合適的拍照區(qū)域；⑥點(diǎn)擊“標(biāo)本圖標(biāo)”，確認(rèn)當(dāng)前物鏡倍數(shù)是否與軟件一致；⑦點(diǎn)擊拍照按鈕，保存圖像。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，教師除了教會(huì)醫(yī)學(xué)研究生正確使用倒置熒光顯微鏡的三種觀察，還要教會(huì)他們?nèi)绾问褂门恼蘸途庉嫻δ?。而在拍照中，?yīng)重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)光路的切換。根據(jù)以往的教學(xué)經(jīng)驗(yàn)，總發(fā)現(xiàn)不少研究生未將光路切換至“L”位置就直接進(jìn)行拍照。另外，還要強(qiáng)調(diào)軟件加密鎖的重要性，告誡他們千萬(wàn)不要損壞和丟失，因?yàn)樗粌H價(jià)格昂貴，而且是圖像拍攝和數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵。

二、倒置熒光顯微鏡的維護(hù)與管理

1.倒置熒光顯微鏡的維護(hù)。首先，在使用倒置熒光顯微鏡前，應(yīng)檢查儀器是否良好、環(huán)境是否清潔干燥、儀器是否無(wú)振動(dòng)和磁場(chǎng)干擾以及無(wú)陽(yáng)光或紫外消毒燈照射。確認(rèn)無(wú)誤后，輕輕掀開(kāi)防塵罩，在固定的位置上進(jìn)行觀察，不要輕易搬動(dòng)。同時(shí)，操作人員與倒置熒光顯微鏡應(yīng)保持一定的距離，以免發(fā)生撞碰。其次，在使用倒置熒光顯微鏡過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格遵守各個(gè)功能的操作使用規(guī)范，正確掌握開(kāi)機(jī)順序（先開(kāi)顯微鏡，再開(kāi)相機(jī)電源，最后開(kāi)電腦）和關(guān)機(jī)順序（先關(guān)電腦，再關(guān)相機(jī)電源，最后關(guān)顯微鏡），做到不使用熒光不開(kāi)啟熒光光源、不拍照不開(kāi)啟電腦；注意避免頻繁開(kāi)關(guān)熒光燈，接通電源和關(guān)閉電源的間隔時(shí)間不少于30分鐘，以保證熒光汞燈的正常使用壽命；禁止在系統(tǒng)電腦上連接網(wǎng)線和插入U(xiǎn)盤(pán)或移動(dòng)硬盤(pán)，以免電腦中毒；不得隨意拆取物鏡、目鏡、熒光濾色片等光學(xué)部件，不得隨意調(diào)節(jié)對(duì)中旋鈕以免使光路產(chǎn)生偏差，不得大角度曲折熒光光纖以保持自然彎曲，不得使用暴力操作各儀器部件，不得在電源接通或開(kāi)啟情況下打開(kāi)燈箱更換燈泡。最后，使用倒置熒光顯微鏡結(jié)束后，除熒光觀察外，應(yīng)及時(shí)關(guān)掉電源，使用乙醚和無(wú)水乙醇的混合液（摻和比例為7∶3）擦拭光學(xué)表面，保持倒置熒光顯微鏡的干燥和清潔；不得使用鏡頭紙以外的硬物擦拭鏡頭以免損壞鏡頭鍍膜；若使用圖像拍攝功能，應(yīng)正確退出軟件加密鎖后，再按正確程序關(guān)閉電腦；燈箱冷卻后方可蓋上防塵罩，以免燒壞儀器和發(fā)生火災(zāi)。

2.倒置熒光顯微鏡的管理。由于醫(yī)學(xué)研究生眾多，而倒置熒光顯微鏡稀少，因此妥善的管理顯得尤為重要。它不僅可以防止倒置熒光顯微鏡的損壞，而且可以提高倒置熒光顯微鏡的使用率。我們可以采取以下管理方案：①先學(xué)后用制，即研究生先經(jīng)過(guò)課堂和實(shí)驗(yàn)教學(xué)的學(xué)習(xí)，正確掌握使用方法后才可以使用；②使用登記制，即研究生使用后，需詳細(xì)記錄使用情況，記錄中應(yīng)包括使用時(shí)間、使用人員、使用哪種功能和儀器有無(wú)異常，具有可追溯性；③專(zhuān)人管理制，即設(shè)定專(zhuān)門(mén)的管理人員，負(fù)責(zé)儀器的保管，負(fù)責(zé)儀器的使用安排，定期對(duì)儀器進(jìn)行檢查和保養(yǎng)；④檔案設(shè)定制，即由儀器管理人員建立儀器檔案，內(nèi)容主要包括使用說(shuō)明書(shū)、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)日期、購(gòu)置日期、維護(hù)和維修記錄等。

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