張慧儒 呂會新 康希 林麗霞

茯苓多糖抗2型糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化作用研究

張慧儒 呂會新 康希 林麗霞

目的 研究茯苓多糖抗2型糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用。方法 雄性大鼠60只，通過喂養(yǎng)制作2型糖尿病腎病模型，通過常規(guī)結(jié)扎左側(cè)輸尿管制作腎纖維化模型。隨機分為4組，即空白對照組和3組不同的茯苓多糖劑量組。并取其尾部靜脈血，測定尿素氮、肌酐、白蛋白等情況，并收集24小時尿液測定其尿蛋白定量；之后分別給予空白對照組、A組、B組、C組，茯苓多糖0 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg、12 mg/kg的劑量灌胃，喂養(yǎng)5周后取24 h尿液，測定24小時尿蛋白定量。實驗結(jié)束后取尾部靜脈血，測定尿素氮、肌酐、白蛋白，并迅速打開腹膜后取出腎臟。梗阻側(cè)取經(jīng)腎門正切的腎組織用10%甲醛溶液固定、常規(guī)方法制備切片。結(jié)果 茯苓多糖喂養(yǎng)大鼠前后可以使大鼠的血肌酐、24小時尿蛋白含量水平均減低，血漿白蛋白增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；組間比較不同濃度的茯苓多糖對以上生化指標均有改善，茯苓多糖與血肌酐之間的變化發(fā)現(xiàn)，二者呈正相關(guān)關(guān)系（r=3.207，P＜0.05)；腎間質(zhì)病理學提示腎小管減少、管腔內(nèi)蛋白管型、腎間質(zhì)內(nèi)彌漫性纖維化的數(shù)目以及腎間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞浸潤的數(shù)目均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論 茯苓多糖可以防治大鼠的腎間質(zhì)纖維化。

茯苓多糖；糖尿病腎??；腎間質(zhì)纖維化；尿蛋白；血肌酐

茯苓(wolfiporia cocos wolf)別名松苓、云苓，為一種菌類，它寄生在松樹根上，屬于多孔菌科茯苓(wolfiporia)，非褶菌目(aphyllophorales)，莖可做藥用。從外觀看茯苓很像甘薯，它的外皮是黑褐色，里肉是粉紅色或白色。其原生物大多生長于赤松或馬尾松的根部。茯苓的氣味甜、淡，性平，當作藥用具有利水滲濕、有益于胃和脾、養(yǎng)心安神的功用。菌核的70%～90%都是茯苓多糖，它主要由線型β(1，3)－D－葡聚糖組成。研究發(fā)現(xiàn)，茯苓具有提高機體抵抗能力，明顯的抵抗腫瘤浸潤、延緩衰老、保護肝功能的作用[1]。李緒亮等[2]報道茯苓多糖(pachymaran，PPS)對慢性腎臟病具有保護腎功能、延緩腎衰進展的作用。本文旨在研究茯苓多糖對2型糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美國Sigma公司，貨號S 0130)；茯苓多糖(江西康道生物有限公司)；24小時尿蛋白定量及生化指標(日立全自動生化分析儀，型號7108)測定；腎組織病理有具有多年經(jīng)驗的病理檢驗師雙盲法查看。腎病理檢查采用：（1）脫水機(湖北孝感，ZT-12 P 2)；（2）包埋機(湖北孝感，TB-718)；（3）冷臺(湖北孝感，TB-718)；（4）切片(德國萊卡，RM 2126 RT)；（5）烤片(湖北孝感，TB-718)；（6） 染色；（7）顯微鏡（德國萊卡，DM 750）。

1.2 實驗動物與分組 由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供的SD大鼠，合格證號為：42000500001560。動物許可證：SJZSDYYY（冀）2003-0002。選SD大鼠60只，體質(zhì)量（260±20）g，隨機分為4組，空白對照組15只，每天僅給予普通飼料喂養(yǎng)，不應用茯苓多糖；A組（n=15）：給予3 mg/kg的茯苓多糖(由寧波德康生物制品有限公司提供)；B組（n=15）：給予6 mg/kg的茯苓多糖；C組（n=15）：給予12 mg/kg的茯苓多糖。4組大鼠一般資料差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

1.3 腎組織病理學觀察 光鏡：切片厚度3 μm，均常規(guī)進行蘇木素伊紅染色(HE)、馬松染色(Masson)、過碘酸雪夫染色(PAS)。由多年具有腎病理經(jīng)驗的病理師采用雙盲法進行檢測。

1.4 試驗方法 適應性飼養(yǎng)5 d后，均收集24小時尿液，測定24小時尿蛋白定量，并取尾部靜脈血，測定尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白蛋白(ALB)等化驗指標。A、B、C 3組大鼠均給予高糖高脂(在普通飼料中加入2.5%的膽固醇、0.4%膽酸鈉、10%蔗糖、10%豬油)飼料喂養(yǎng)。2周后禁食12 h，腹腔內(nèi)注射1%STZ溶液35 mg/kg，4周后糖尿病腎病模型成立。實驗室內(nèi)溫度為

22℃～25℃，室內(nèi)濕度為30%～40%，每天喂食2次，即每天的6:00、18:00各喂食1次，每天更換1次飲水和墊料。4周末用代謝籠收集小鼠24 h尿液，測定24小時尿蛋白定量(Upr)，取大鼠的尾部靜脈血，測定尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白蛋白(ALB)等化驗指標。5周后結(jié)扎左側(cè)輸尿管制作腎纖維化模型，并迅速取出腎臟。梗阻側(cè)取經(jīng)腎門正切的腎組織用10%甲醛溶液固定、常規(guī)方法制備切片。

1.5 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計軟件17.0處理。計量資料采用“x±s”表示；組內(nèi)比較采用配對比較的t檢驗，組間比較采用多個樣本均數(shù)間每兩個均數(shù)比較的Newmankeuls檢驗，指標間相關(guān)性比較用two-way ANONA檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 茯苓多糖對大鼠生化指標的影響比較 C組BUN治療后顯著降低（P＜0.05），A組和B組BUN變化不明顯，A、B、C 3組消失Scr、ALB以及Wpr指標經(jīng)過治療均存在顯著變化（P＜0.05），隨著茯苓多糖劑量的提高，BUN、Scr、ALB、及24小時尿蛋白定量各項生化指標均明顯改善，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 4組大鼠服用不同劑量的茯苓多糖前、后生化指標的變化（s）

表1 4組大鼠服用不同劑量的茯苓多糖前、后生化指標的變化（s）

組別例數(shù)時間BUN (mmol/L) Upr (g/d)對照組1520.2±5.5210.4±10.230.2±9.42.1±0.8 A組15治療前21.5±5.5212.5±11.130.0±12.32.0±0.5治療后18.3±4.5180.3±12.035.2±6.41.8±0.5 B組15治療前20.5±6.2210.2±13.432.5±9.12.0±0.4治療后19.5±6.2120.5±11.338.2±4.31.0±0.3 C組15治療前22.7±5.5212.2±10.231.8±6.32.1±0.3治療后15.2±2.5118.2±14.241.5±2.40.8±0.3 Scr (μmol/L) ALB (g/L)

2.2 不同劑量的茯苓多糖對大鼠腎間質(zhì)病理的影響 通過茯苓多糖喂養(yǎng)大鼠后，各組間腎間質(zhì)出現(xiàn)了顯著的病理變化，3組小鼠腎小管數(shù)量均出現(xiàn)減少情況，均出現(xiàn)管腔內(nèi)蛋白管型、腎間質(zhì)彌漫纖維化、間質(zhì)的淋巴細胞浸潤，A組腎小管數(shù)量減少、管腔內(nèi)蛋白管型、腎間質(zhì)彌漫纖維化、間質(zhì)的淋巴細胞浸潤數(shù)目顯著大于B組和C組（P＜0.05），C組患者腎小管數(shù)量減少、管腔內(nèi)蛋白管型、腎間質(zhì)彌漫纖維化、間質(zhì)的淋巴細胞浸潤數(shù)目顯著低于B組和A組（P＜0.05）。見表2。

表2 服用不同劑量的茯苓多糖后3組大鼠腎病理變化情況（s）

表2 服用不同劑量的茯苓多糖后3組大鼠腎病理變化情況（s）

PPS (mg/kg)例數(shù)腎小管數(shù)量減少(個)間質(zhì)的淋巴細胞浸潤A組1520±619±519±719±6 B組1513±413±512±412±4 C組156±26±26±26±2 Hc6.014.55.67.2 P值＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05管腔內(nèi)蛋白管型(個)腎間質(zhì)彌漫纖維化(個)

2.3 不同劑量茯苓多糖與腎功能之間的關(guān)系 通過比較茯苓多糖與血肌酐之間的變化發(fā)現(xiàn)，二者呈正相關(guān)關(guān)系（r=3.207，P＜0.05)；BUN與茯苓多糖劑量之間沒有明顯關(guān)系(r=0.019,P＞0.05)。

3 討論

茯苓多糖具有抗氧化、抗腫瘤作用已被大量實驗所證實。李燕凌等[3]通過分光光度法證實了茯苓多糖具有抗氧化作用。候安繼等[4]應用40只大鼠，隨機分為老齡對照組、茯苓多糖組3 mg/ kg、6 mg/kg、9 mg/kg 4組，10天后發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶組(T-SOD、Cu-SOD)均明顯升高，MDA含量降低，并具有一定的量效關(guān)系；雄性小鼠分別給予不同濃度茯苓多糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)茯苓多糖組小鼠的鼻孔入水時間以及死亡時間均延長，而且隨著茯苓多糖劑量的增加兩個時間也不同程度的延長，說明茯苓多糖具有抗衰老作用。它的許多作用日漸被人們所認識。

茯苓多糖還可以增強機體的抵抗力。彭小彬等[5]曾報道茯苓多糖對50只小鼠，分為5組即正常對照組、正常對照+茯苓多糖組、環(huán)磷酰胺組、環(huán)磷酰胺+茯苓多糖組(50 mg)、環(huán)磷酰胺+茯苓多糖組(100 mg)，10天后發(fā)現(xiàn)，喂飼茯苓多糖組IgG、IgM、IL-4、IL-4 mRNA明顯高于正常對照組，而環(huán)磷酰胺組上述指標明顯降低，環(huán)磷酰胺+茯苓多糖組較單用環(huán)磷酰胺組上述指標升高，并且升高幅度與茯苓多糖用量大小有關(guān)，用量大的升高的要高。以上試驗說明茯苓多糖可以增強機體抗病能力。慢性腎臟間質(zhì)纖維化是大多數(shù)慢性腎臟疾病進行性加重的一個共同的病理過程，是導致慢性腎功能衰竭的共同的病理基礎(chǔ)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)茯苓多糖應用前后尿素氮濃度變化不大，考慮與尿素氮受飲食等影響比較多有關(guān)，與肌酐可以明顯改善，提高白蛋白濃度，延緩腎衰的進展，并且與茯苓多糖的濃度具有正相關(guān)關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖具有抑制慢性腎臟間質(zhì)纖維化、延緩腎衰進展的作用，并且隨著茯苓多糖的劑量增加抑制作用逐漸加強。它可以使腎間質(zhì)小管數(shù)量減少，管腔內(nèi)蛋白管型減少，腎間質(zhì)纖維化數(shù)目減少，腎間質(zhì)淋巴細胞浸潤減少，使腎間質(zhì)纖維化的改變相應的均減輕，推測茯苓多糖具有超過氧化物歧化酶，以及多糖分子上具有還原性的半縮醛羥基，該基團與活性氧自由基發(fā)生氧化還原作用，與OH氫原子結(jié)合成水有關(guān)。在以往研究中，沈曉燕[6]等報道茯苓多糖還可以通過抑制TGF-β具有抗肝臟纖維化作用。腎間質(zhì)纖維化是慢性腎功能衰竭的一個必經(jīng)過程，到了這一步幾乎所有的腎功能不可逆轉(zhuǎn)，但該課題為我們指明了思路，可以借用中成藥來延緩腎衰的到來。本研究還發(fā)現(xiàn)茯苓多糖對腎臟生化的影響，它可以降低蛋白尿，增加血漿白蛋白含量，保護腎功能，為我們以后藥物的選擇提供了理論依據(jù)。

[1] 梁亦龍 曾垂省,王允,等.茯苓多糖的抗氧化作用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2012,40(7):288-289.

[2] 李緒亮,焦慶才,陳群,等.慢性腎功能衰竭的防治作用[J].中國藥學雜志,2005,40(12):908-911.

[3] 李燕凌,張志旭,胡令,等.茯苓多糖抗氧化性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012,24(8):1126-1128.

[4] 候安繼,陳騰云,彭施萍,等.茯苓多糖抗衰老作用研究[J].中藥藥理與臨床,2004,20(3):10-11.

[5] 彭小彬,邱小惠,余傳林,等.茯苓多糖對環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠體液免疫功能的影響[J].中藥藥理與臨床,2013,9(5):69-72.

[6] 沈曉燕,胡艷,周維,等.羧甲基茯苓多糖抗大鼠實驗性肝纖維化作用的研究[J].中國民族民間醫(yī)藥,2009,22(20):9-10.

Objective To investigate the influence of the Pachymaran on the renal interstitial fibrosis in the diabetic rats. Methods 60 male rats were fed to make type 2 diabetic nephropathy model,and renal fibrosis model was made by conventional ligation of left ureter. Rats were randomly divided into blank control group and three groups of different doses of the polysaccharide. The tail vein blood was collected urea nitrogen,creatinine, albumin,and 24 h urine samples. then were given in the blank control group,group A,group B,group C,pachyman 0 mg/kg,3 mg/kg,6 mg/kg, 12 mg/kg dose irrigation gastric. After 5 weeks of feeding,24 h urine was taken,and urine protein was measured for 24 hours. After the end of the experiment,the blood was taken from the tail vein,the urea nitrogen,creatinine and albumin were determined. Fixed with 10%formaldehyde solution, the conventional method of obstructed kidney from renal hilar tangent sections. Results Serum creatinine,a24-hour urine protein levels were lower by pachymaran,serum albumin was increased,the difference was statistically significant (P＜0.05);Pachymaran comparison between groups with different concentrations of the above biochemical indexes were improved,and the change of polysaccharides found between serum creatinine,both positively correlated (r=3.207,P＜0.05);reduction in renal tubules interstitial pathology prompt,intra-luminal protein casts,renal interstitial the number of diffuse fibrosis and the number of renal interstitial infiltration of lymphocytes were significantly reduced,with significant differences (P ＜0.05). Conclusion The pachymaran can prevent the renal interstitial fibrosis of the diabetic rats.

Pachymaran;Diabetic nephropathy;Renal interstitial fibrosis;Urinary proteinuria;Creatinine

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.8.001

石家莊市科學技術(shù)研究與發(fā)展指導計劃項目 （141462943）

河北 300000 河北省石家莊市第一醫(yī)院腎內(nèi)科 （張慧儒 康希）河北省石家莊市第一醫(yī)院藥劑科 （呂會新） 河北省石家莊市第一醫(yī)院營養(yǎng)科（林麗霞）