劉仰斌，張志花

(贛南醫(yī)學(xué)院　基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西　贛州　341000)

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠骨代謝生化指標(biāo)的影響

劉仰斌，張志花

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西贛州341000)

【摘要】目的：探討苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠骨代謝的影響。方法：用去卵巢方法建立豚鼠骨代謝紊亂動物模型，30只雌豚鼠，隨機(jī)分為5組：正常對照組、骨質(zhì)疏松模型組、陽性藥物組、低劑量苦菜總黃酮組(0.1 mg/kg)、高劑量苦菜總黃酮組(0.3 mg/kg)。建模1周后，分別給予生理鹽水、雌激素和不同劑量的苦菜總黃酮，給藥6周后，檢測豚鼠骨長度和骨質(zhì)量指數(shù)，同時檢測血清電解質(zhì)、堿性磷酸酶(AKP)、骨鈣素(BGP)和肝組織抗酒石酸酸性磷酸酶(TrACP-5b)等生化指標(biāo)。結(jié)果：①苦菜總黃酮可以增大股骨和脛骨長度指數(shù)；②苦菜總黃酮可提高降鈣素的含量；③苦菜總黃酮能升高血清AKP，降低TrACP-5b的含量。結(jié)論： 苦菜總黃酮可通過調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收途徑，改善去卵巢豚鼠骨代謝的紊亂，顯示類雌激素樣功效，對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可能起治療作用。

【關(guān)鍵詞】苦菜；總黃酮；去卵巢；豚鼠；骨代謝

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.03.002

隨著年齡的增長，女性卵巢的功能在減退，尤其是絕經(jīng)后雌激素的下降，導(dǎo)致其各代謝系統(tǒng)出現(xiàn)改變，如血脂增高、動脈硬化、骨質(zhì)疏松等[1-2]。臨床上多用雌激素來治療女性因雌激素下降而引起的癥狀，但各種合成的雌激素不良反應(yīng)較大，使其在臨床上的應(yīng)用受限。苦菜在國內(nèi)分布很廣，日常生活中人們長期應(yīng)用。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)苦菜總黃酮具有降血脂、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、改善血液系統(tǒng)等作用[3-7]，可以降低去卵巢豚鼠的Lee′s指數(shù)并改善其血脂代謝情況[8]。為進(jìn)一步研究和推廣苦菜的作用，我們通過建立去卵巢豚鼠的骨質(zhì)疏松模型，觀察苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠骨代謝的生化指標(biāo)影響，為苦菜總黃酮在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑苦菜總黃酮按照文獻(xiàn)[3]的方法先配制好，實(shí)驗(yàn)前用雙蒸水稀釋至實(shí)驗(yàn)各組所需濃度。戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號：030A)，降鈣素(calcitonin，CT)、血清骨鈣素(bone gla protein,BGP)、抗酒石酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TrACP-5b)、血清堿性磷酸酶(alkaline aphosphatase,AKP)測試盒(均為上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。水合氯醛(天津海晶精細(xì)化工廠，批號：20061215)，其他試劑均為市售分析純。

1.2主要儀器設(shè)備Gemini XPS熒光酶標(biāo)儀(美谷分子儀器上海有限公司)；超速低溫離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特有限公司)；SN-695型智能放免γ測量儀(上海核輻光電儀器有限公司)；HD-F2600全自動生化分析儀(濟(jì)南漢方醫(yī)療器械有限公司)。

1.3動物分組豚鼠30只，SPF級,均為雌性，自由飲食，體質(zhì)量350～400 g，由贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SYXK(贛)2007-0002。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則，在實(shí)驗(yàn)前所有豚鼠均給予人道的關(guān)懷，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)時30只豚鼠隨機(jī)分為5組(每組6只)：①正常對照組(假手術(shù)組)，②骨質(zhì)疏松模型組(卵巢切除組)，③陽性藥物對照組[卵巢切除+戊酸雌二醇，80 mg/(kg·d)]，④低劑量組(卵巢切除+苦菜總黃酮，0.1 mg/kg)，⑤高劑量組(卵巢切除+苦菜總黃酮，0.3 mg/kg)。

1.4方法

1.4.1動物模型制備術(shù)前豚鼠禁食1 d，不禁水。用10%的水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉后，于平臥位消毒，打開腹腔，行腹側(cè)雙側(cè)卵巢切除；正常對照組僅探查卵巢，不切除，余操作同模型組。術(shù)后1周各組行陰道脫落細(xì)胞檢查，以明確卵巢切除成功。陽性藥物組按80 mg/kg戊酸雌二醇混懸液灌胃，苦菜總黃酮組分另按0.1 mg/kg、0.3 mg/kg劑量灌胃，給藥體積為0.5 mL/100g 體質(zhì)量，對照組及骨質(zhì)疏松模型組大鼠給予等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)6周。

1.4.2血清生化檢測給藥6周后，麻醉大鼠，腹腔動脈取血，2000 r/min，4 ℃，離心15 min，分離血清，于-80 ℃冰箱保存。全自動生化分析儀檢測血清鈣、鎂和磷的水平；酶分析方法檢測血清AKP和TrACP-5b活性。

1.4.3放射免疫學(xué)方法檢測血清BGP和CT的含量：取血清，解凍后，3000 r/min，離心10 min，取上清100 μL于已編寫號碼的放免專用試管中，加入相應(yīng)的抗血清100 μL，混勻，再分別加入125I標(biāo)記的BGP、CT，混勻，另設(shè)總放射值管、非特異反應(yīng)管(不加入抗血清)及標(biāo)準(zhǔn)管(S0～S5)，4 ℃孵育24 h。除總放射管值外，每管加入免疫分離劑500 μL，充分混勻，室溫放置20 min后，4 ℃，3000 r/min，離心10 min，棄上清，在SN-695型智能放免γ測量儀上測定cpm(每分鐘多少次衰變)值，半對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算每管血清BGP、CT的含量。

1.4.4骨質(zhì)量及長度指數(shù)檢測分別稱量腰椎、股骨、脛腓骨質(zhì)量，測量股骨、脛腓骨長度，計(jì)算腰椎、股骨、脛腓骨質(zhì)量指數(shù)(骨質(zhì)量/豚鼠質(zhì)量)，股骨和脛腓骨長度指數(shù)(骨質(zhì)量/骨質(zhì)長度)。

2結(jié)果

2.1血清Ga2+、Mg2+、磷含量與正常對照組相比，模型組豚鼠血清Ca2+和Mg2+含量降低、磷含量升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性藥物組血Ca2+水平升高,磷下降(P<0.05)，苦菜總黃酮各組血Ca2+含量升高(P<0.05)，磷含量與模型組無明顯差異，見表1。

表1苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠血清電解質(zhì)含量的影響

分組nGa2+/(mmol/L)Mg2+/(mmol/L)磷/(mmol/L)正常對照組64.83±0.311.78±0.092.54±0.31模型組64.08±0.34*1.70±0.10*2.90±0.22*陽性藥物組64.70±0.68#1.74±0.042.76±0.18#低劑量組65.09±0.39#1.66±0.012.95±0.21高劑量組64.85±0.58#1.75±0.052.85±0.20F3.7122.9332.994P<0.05<0.05<0.05

注：*P<0.05與正常對照組相比，#P<0.05與模型組相比。

2.2血清AKP活性和肝組織TrACP-5b活性與正常對照組相比，模型組豚鼠血清AKP活性降低(P<0.01)，肝組織TrACP-5b活性升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性藥物組肝組織TrACP-5b活性降低(P<0.01)，苦菜總黃酮各組AKP活性升高(P<0.01)，肝組織TrACP-5b活性降低(P<0.05)，見表2。

表2苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠血清AKP及肝臟TrACP-5b活性的影響

分組nAKP/(U/L)TrACP-5b/(U/L)正常對照組612.67±3.613.17±0.42模型組68.17±1.89**3.99±0.31**陽性藥物組68.55±2.902.89±0.30#低劑量組613.10±4.51##3.01±0.31#高劑量組615.10±2.20##3.20±0.34#F5.4819.714P<0.05<0.05

注：*P<0.05,**P<0.01與正常對照組相比，#P<0.05，##P<0.01與模型組相比。

2.3血清BGP和CT含量與正常對照組相比，模型組豚鼠血清CT含量降低(P<0.05)；與模型對照組相比，陽性藥物組血清CT含量升高(P<0.01)，苦菜總黃酮各組CT含量升高(P<0.01)，見表3。

2.4骨密度、骨長度和骨質(zhì)量指數(shù)與正常對照組相比，模型組豚鼠的股骨和脛骨長度指數(shù)均減小(P<0.05，P<0.01)；實(shí)驗(yàn)6周后與模型組相比，陽性藥物組、苦菜總黃酮各組股骨、脛骨長度指數(shù)均提高(P<0.05，P<0.01)，見表4。

表3苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠BGP、CT的影響

分組nBGP/(ng/mL)CT/(pg/mL)正常對照組68.39±1.63138.02±23.43模型組611.09±2.1989.13±11.06*陽性藥物組68.55±1.51124.61±25.94##低劑量組69.82±1.55111.09±14.97##高劑量組610.32±1.79124.01±19.29##F2.6155.256P>0.05<0.05

注：*P<0.05與正常對照組相比，##P<0.01與模型組相比。

表4苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠骨長度和骨質(zhì)量指數(shù)的影響

分組n腰椎質(zhì)量指數(shù)/(g/kg)股骨質(zhì)量指數(shù)/(g/kg)脛腓骨質(zhì)量指數(shù)/(g/kg)股骨長度指數(shù)/(mm/kg)脛骨長度指數(shù)/(mm/kg)正常對照組64.99±0.574.15±0.1418.61±0.66135.35±8.59149.31±8.91模型組64.28±0.363.46±0.0618.14±1.05119.87±3.68**133.01±6.45**陽性藥物組64.90±0.744.23±0.2018.50±0.93137.99±5.70##183.76±7.59##低劑量組65.29±0.423.91±0.8618.70±1.01124.53±4.32#139.71±6.78#高劑量組64.98±0.803.99±0.9818.98±1.02127.67±5.94#143.21±7.69#F2.2691.5380.6309.76441.787P>0.05>0.05>0.05<0.01<0.01

注：**P<0.01與對照組相比，#P<0.05，##P<0.01與模型組相比。

3討論

正常情況下，骨形成和骨吸收通過各種調(diào)節(jié)信號緊密相連。當(dāng)骨吸收活躍并引起骨密度降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞時，就會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，隨之而來就是骨脆性增加和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。骨質(zhì)疏松癥并發(fā)脆性骨折可使患者致殘，嚴(yán)重危及患者生活質(zhì)量[9]。盡管骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)是嚴(yán)重威脅老年人健康的疾病，但是如何診斷和評估骨質(zhì)疏松癥危害性卻一直沒有定論。國內(nèi)外比較常用的是通過雙能X線進(jìn)行骨密度檢測[10]，但是最近研究認(rèn)為它僅僅能檢測受測部位的骨代謝，不能做全身骨質(zhì)情況評估，更不能很好地預(yù)測患者骨折的風(fēng)險(xiǎn)，因此評估骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)往往需要綜合個體情況及骨生化指標(biāo)來完成[11]。骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)(bone turnover markers，BTMs)雖然不是診斷骨質(zhì)疏松的標(biāo)準(zhǔn)，臨床效用有限，但是抗骨質(zhì)疏松治療后，可以通過骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)全面評價(jià)人體骨的代謝情況，從而間接判斷抗骨質(zhì)疏松效果并預(yù)測骨折的風(fēng)險(xiǎn)，因此得到不少學(xué)者的高度重視[12]。

目前用于制作骨質(zhì)疏松模型的動物很多，其中實(shí)驗(yàn)鼠因操作簡單，成本低，實(shí)驗(yàn)要求差異性最少而成為最常用的模型動物。實(shí)驗(yàn)鼠模型制作方法很多，可行卵巢、睪丸、垂體切除，也可使用激素類藥物達(dá)到骨丟失的目的，但最終仍是通過生化檢查、骨形態(tài)計(jì)量學(xué)等方法監(jiān)測和評價(jià)該動物模型在預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的效果[13]。本研究中，我們僅通過切除成年雌性豚鼠的卵巢模擬婦女絕經(jīng)后的狀態(tài)，獲得了去卵巢骨質(zhì)疏松豚鼠模型，實(shí)驗(yàn)過程中各組豚鼠均保持平穩(wěn)狀態(tài)，沒有出現(xiàn)豚鼠異?；蛩劳霈F(xiàn)象，顯示本模型穩(wěn)定性好，可重復(fù)操作。

成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)和破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)是骨代謝最重要的核心細(xì)胞，骨代謝的關(guān)鍵就是這兩種細(xì)胞代謝變化的結(jié)果[14-15]。目前反映成骨細(xì)胞的標(biāo)志物較多，如AKP、BGP、Ⅰ型前膠原羧基末端肽(PICP)等，其中AKP和BGP因擁有較好的生物穩(wěn)定性、較低的個體差異性且檢測方法簡單成為評估成骨細(xì)胞活性的重要指標(biāo)[16]，PICP作為成骨代謝產(chǎn)物也是反映成骨細(xì)胞活性的重要指標(biāo)，但是其結(jié)果易受干擾，如半衰期只有6～8 min[17]，且在體內(nèi)受不同時間變化而變化，研究發(fā)現(xiàn)PICP人體含量凌晨比中午高20%，Vasikaran S等研究認(rèn)為PICP可能不僅僅來源于骨代謝，因此沒有很好的特異性，一定程度上限制了其在實(shí)踐中的運(yùn)用[18]。TrACP是目前臨床上判斷成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性的重要生化標(biāo)志物，也是骨質(zhì)疏松癥重要監(jiān)測指標(biāo)之一。體外實(shí)驗(yàn)證明，在骨吸收過程中，破骨細(xì)胞活躍，同時大量分泌TrACP，因此TrACP 水平可反映破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀態(tài)[19]。絕經(jīng)期后的女性因內(nèi)源性雌激素減少，骨重建失衡，骨吸收大于骨形成，會出現(xiàn)TrACP顯著增加。在正常人血清中，TRACP 以兩種基化形式存在：TRACP-5a 和TRACP-5b。其中TRACP-5b 主要由破骨細(xì)胞分泌，故測定血清中的TRACP-5b 活性，可以反映體內(nèi)OC 活性和骨吸收狀態(tài)。目前研究認(rèn)為TRACP-5b 的活性直接反映了OC 在骨組織中的數(shù)量，是反映OC活性的特異性指標(biāo)，目前已經(jīng)成為第二代骨吸收生化標(biāo)志[19]。

本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠骨代謝的生化指標(biāo)影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦菜總黃酮可改善去卵巢豚鼠骨代謝有關(guān)的生化指標(biāo)，可以提高AKP活性，降低肝組織TrACP-5b活性，說明其可以提高成骨細(xì)胞活性，抑制破骨細(xì)胞活性，達(dá)到改善骨代謝作用。結(jié)果提示苦菜總黃酮可通過調(diào)節(jié)骨代謝水平而改善絕經(jīng)后婦女因體內(nèi)雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥的可能，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

總之，苦菜總黃酮對去卵巢成年動物的骨代謝失衡有改善作用，能夠提高成骨細(xì)胞數(shù)量和功能，產(chǎn)生類雌激素對破骨細(xì)胞的抑制作用。通過對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用，在整體上對絕經(jīng)后的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行改善，降低骨折風(fēng)險(xiǎn)，這為進(jìn)一步臨床運(yùn)用提供理論基礎(chǔ)。另外苦菜總黃酮水溶性很好，利用度高，不良反應(yīng)少，來源天然，價(jià)格便宜,因此具有較好的開發(fā)前景。

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Effects of total flavonoids in the Sonchus oleraceus L.on biochemical index of bone metabolism in ovariectomized guinea pigs

LIU Yangbin,ZHANG Zhihua

School of Preclinical Medicine,Gannan Medical University,Ganzhou 341000,China

【Abstract】Objective：To observe the effect of the total flavonoids in the Sonchus oleraceus L.on bone metabolism in ovariectomized guinea pig.Methods:Thirty female guinea pigs were randomly divided into 5 groups,namely control group,ovariectomized model group,positive drug group,and difference dosage groups of total favonoids from Sonchus oleraceus L.(0.1 mg/kg or 0.3 mg/kg).One week following ovariectomy,the pigs were intragastrically administrated with saline,estradiol valerate or total favonoids from Sonchus oleraceus L.respectively,once a day for six weeks.Then all pigs were sacrificed,and the sera were obtained to detect the electrolytes,bone gla protein (BGP),calcitonin(CT),alkaline aphosphatase (AKP),and liver tissues were taken to observe the tartrate-resistant acid phosphatase (TrACP-5b).Bone length and mass index were also determined in all pigs.Results:Total favonoids from Sonchus oleraceus L.was capable of increasing the length index of the femur and tibia,improving the calcitonin content,and elevating serum AKP level and reducing liver TrACP-5b content.Conclusion:Total favonoids from Sonchus oleraceus L.can improve bone metabolism in ovariectomized pigs through regulating bone formation and resorption,which indicates that this agent can produce estrogen-like effect and be potential therapeutic results for postmenopausal osteoporosis.

【Key words】Sonchus oleraceus L.；total flavonoids；ovariectomy；guinea pig；bone metabolism

文章編號：1002-0217(2016)03-0210-04

基金項(xiàng)目：江酉省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃課題(20122033)

收稿日期：2015-10-08

作者簡介：劉仰斌(1970-)，男，副教授，碩士，(電話)15979776628，(電子信箱)15979776628@163.com．

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】【中圖號】R 285.5A