鮭魚甲病毒E1基因高保守區(qū)融合表達(dá)及免疫特性的分析

蔣　燁，杜　航，唐麗杰，喬薪瑗，王　麗，管雪婷，姜艷平，崔　文，李一經(jīng)，劉　敏

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,哈爾濱　150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱　150030)

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鮭魚甲病毒E1基因高保守區(qū)融合表達(dá)及免疫特性的分析

蔣燁1，杜航1，唐麗杰2，喬薪瑗2，王麗2，管雪婷1，姜艷平2，崔文2，李一經(jīng)2，劉敏1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,哈爾濱150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱150030)

摘要：根據(jù)GenBank中公布的鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus，SAV)SAV 1、SAV 2和SAV3三個基因型中E1基因，選擇高保守序列702 bp(436-1137)合成基因，命名為SAV E1，將其克隆到原核表達(dá)載體pCold TF中構(gòu)建重組質(zhì)粒。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中，經(jīng)終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western blot鑒定，重組蛋白均獲得了表達(dá)，表達(dá)E1重組蛋白約95 kD。用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白，制備抗血清。間接ELISA結(jié)果顯示，鼠抗重組蛋白E1血清效價為1∶25 600；間接免疫熒光結(jié)果顯示，鼠抗重組E1蛋白血清可與SAV發(fā)生特異反應(yīng)，由此表明表達(dá)的E1重組蛋白具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，為SAV檢測方法的建立提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus，SAV)；E1高保守蛋白；原核表達(dá)；免疫特性

鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus，SAV)隸屬于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)，主要感染大西洋鮭(salmosalar)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)引起胰腺、心肌炎癥和昏睡等癥狀，致死率達(dá)1%～48%，并在水產(chǎn)養(yǎng)殖的各個階段均有爆發(fā)[1-2]。自從1995年Nelson等在愛爾蘭成功分離出該病毒，至此已發(fā)現(xiàn)六個基因型(SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV 5、SAV 6)[3-4]。SAV 2、SAV 3可感染虹鱒引起睡病(Sleeping disease，SD)；SAV 1、SAV 2、SAV 4、SAV 5、SAV 6基因型可感染大西洋鮭引起胰腺病(Salmon pancreas disease，PD)。目前該病廣泛流行于蘇格蘭、挪威、愛爾蘭、法國等歐洲國家，據(jù)統(tǒng)計從1995年至2007年發(fā)病率逐年增加高達(dá)90%，每年由此疫病造成巨大的經(jīng)濟損失[5-6]。雖然我國目前尚未發(fā)現(xiàn)該病，但是隨著近年我國對鮭科魚類進(jìn)口的增加，該病傳入我國的風(fēng)險也日益增大，因此有必要盡早建立對鮭魚甲病毒快速靈敏的檢測方法，防止該病傳入我國。

SAV病毒粒子呈球形，有囊膜，直徑為(65.5 ±4.3)nm[7]，能夠通過敏感細(xì)胞系大鱗大馬哈魚(O.tshawytscha)胚胎細(xì)胞(CHSE-214)進(jìn)行分離和繁殖[8]。SAV是單股正鏈RNA病毒，基因組長11～12 kb，含有兩個開放閱讀框。其中3′ 端開放閱讀框編碼26S子基因的mRNA，最終產(chǎn)生5個結(jié)構(gòu)蛋白，依次是衣殼蛋白，糖蛋白E3和E2、6K和E1，已被證實衣殼蛋白、E1和E2在病毒復(fù)制時被表達(dá)，其中衣殼蛋白構(gòu)成病毒的衣殼，E3、E2、6K和E1共同構(gòu)成了病毒的包膜糖蛋白。E2和E1為跨膜蛋白暴露于病毒粒子表面，E1和E2形成異源二聚體，E2位于遠(yuǎn)端并且最有可能同細(xì)胞的受體互作[9-10]。E2上有絕大部分的中和抗原決定簇，它的作用是識別并同細(xì)胞表面的受體結(jié)合；而E1中含有較多保守和交叉反應(yīng)性的抗原決定簇[11]，各亞型之間E1蛋白具有很強的保守性，其中436～1137 bp這段基因在各亞型之間100%保守。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成熟完善，具有繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定，目的基因表達(dá)水平高，抗污染能力強等優(yōu)點，被廣泛引用于重組蛋白藥物的研究和生產(chǎn)[12-13]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體眾多，筆者曾嘗試多種表達(dá)載體表達(dá)E1蛋白，如pProEX HTa、Pgex-6p-1和pET系列，但都未獲得可溶形式的重組蛋白。本研究利用原核表達(dá)載體pCold TF表達(dá)SAV E1蛋白的高保守區(qū)(702 bp)，獲得可溶形式的重組蛋白E1，并制備抗血清，并初步研究重組蛋白E1的免疫特性，為E1蛋白在SAV檢測方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1毒株、菌株和質(zhì)粒

SAV1(V4640)毒株由英國蘇格蘭海洋實驗室饋贈；CHSE-214、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TG1、BL21和pCold TF均由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑

辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、異硫氰酸突光素(FITC)標(biāo)記羊抗鼠IgG和HIS標(biāo)簽抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2SAV E1保守基因的設(shè)計合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已公布的SAV E1基因的基因序列及其蛋白空間構(gòu)象，分析其同源序列及保守區(qū)域，選取其共保守序列，設(shè)計了共737 bp的DNA序列，包括上下游酶切位點EcoRI、XbaI，終止密碼子，其中編碼E1基因的堿基702 bp(436～1137 bp)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并連接到克隆載體pUC57。

1.3重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-E1的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pUC57-E1與原核表達(dá)載體pCold TF，分別用EcoRI、XbaI雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收純化試劑盒切膠回收兩段目的基因，將E1與pCold TF用T4DNA連接酶連接，16 ℃連接12 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)中，涂布于含有50 g/mL的Amp+LB平板上，待菌液全部被培養(yǎng)基吸收后放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置培養(yǎng)12 h。挑取單個菌落提質(zhì)粒，進(jìn)行單、雙酶切鑒定。

1.4重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-E1的鑒定

隨機挑取LB轉(zhuǎn)化平板中的若干菌落，接種于5 mL含100 g/mL Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，提取質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒pCold TF-E1進(jìn)行EcoRI和XbaI單、雙酶切鑒定。0.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察單雙酶切得到的目的片段大小是否與預(yù)期大小相符。測序確定E1基因是否正確的插入到pCold TF載體中。

1.5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定

重組質(zhì)粒pCold TF-E1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中后，挑取轉(zhuǎn)化子至含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物按1%的接種量接入10 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約0.4時，取1 mL菌液作未誘導(dǎo)對照，剩余菌液添加IPTG至1 mmol/L，重組大腸桿菌pCold-E1/BL21，16 ℃，200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜，菌液經(jīng)超聲破碎后，制備蛋白樣品，用于SDS-PAGE檢測分析。用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白。

將制備好的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜，用HIS標(biāo)簽抗體作為一抗，進(jìn)行Western-blot鑒定。

1.6抗血清的制備

將純化好的蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合充分乳化，腹腔注射6～8周齡BALB/c雌鼠，每只小鼠100 g，分離接種前鼠尾靜脈血清作為陰性對照。第一次免疫14 d后，用純化好的蛋白與等量的弗氏不完全佐劑混合充分乳化進(jìn)行第二次免疫；之后再隔14 d后用第二次免疫的方法對小鼠進(jìn)行第三次免疫。第三次免疫后第7天小鼠眼球采血，無菌分離血清，-80 ℃保存。

1.7抗體效價的測定

用重組E1蛋白作為抗原包被ELISA板，用制備好的鼠抗E1蛋白血清和鼠陰性血清作為一抗，HPR標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗，OPD避光顯色。結(jié)果判定：當(dāng)P/N(陽性血清OD490 nm值-空白孔OD490 nm值)/(陰性血清OD490 nm值-空白孔OD490 nm值)>2時，此孔記為陽性孔，陽性血清的最大稀釋度即為血清抗體效價。

1.8間接免疫熒光(IFA)檢測免疫原性

將無菌玻片放于6孔板中，將CHSE-214細(xì)胞接種于6孔板，使其長成致密單層。常規(guī)方法接種SAV1，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。15 ℃培養(yǎng)7 d后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；每孔加入2%Triton-100，37 ℃10 min，PBS洗滌3次，每次5 min；每孔加入1%BSA，37 ℃封閉1 h，PBS洗滌3次，每次5 min；加入鼠抗E1蛋白血清，37 ℃孵育1h，PBS洗滌3次，每次5 min；加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶5000)，37 ℃避光孵育30 min，PBST洗滌3次，每次5 min；在免疫熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-E1的單、雙酶切鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-E1用EcoRI或XbaI單酶切得到6 600 bp的片段，EcoRI和XbaI雙酶切得到5 800 bp和780 bp的目的片段(見圖1)；結(jié)果表明已獲得攜帶有目的基因E1的重組質(zhì)粒。

圖1　重組質(zhì)粒pCold-E1酶切鑒定結(jié)果

M：DNA Marker8000bp；1：EcoRI單酶切結(jié)果；2：XbaI單酶切結(jié)果；3：EcoRI XbaI雙酶切結(jié)果

2.2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

重組表達(dá)載體pCold TF-E1中E1基因與His標(biāo)簽、分子伴侶融合表達(dá)，His標(biāo)簽蛋白分子量約6 KD，分子伴侶蛋白分子量48 KD，目的蛋白E1約為29 KD，以及HRV 3C蛋白酶、凝血酶，則融合蛋白分子量大小約為95 KD。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在約95 KD處出現(xiàn)明顯的條帶，即為目的蛋白(見圖2)。對誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行超聲破碎，pCold-E1/BL21表達(dá)的蛋白主要存在于破碎上清，而破碎后的沉淀里只含有很少的一部分，表達(dá)形式為可溶形式。

圖2　pCold-E1/BL21SDS-PAGE表達(dá)鑒定

M：蛋白Marker；1：pCold-E1/BL21誘導(dǎo)前菌體； 2：pCold-E1/BL21誘導(dǎo)后菌體； 3：pCold-E1/BL21超聲后上清； 4：pCold-E1/BL21超聲后沉淀；

將重組E1蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，與抗His標(biāo)簽的單抗室溫作用2 h，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG室溫作用2 h，ECL顯色液顯色后，可在預(yù)期位置觀察到明顯的特異性條帶，表明制備的重組E1蛋白表達(dá)(見圖3)。

圖3　pCold-E1/BL21Western blot表達(dá)鑒定

M：蛋白Marker；1:pCold-E1/BL21誘導(dǎo)前菌體；2:pCold-E1/BL21誘導(dǎo)后菌體；

2.3抗體效價的測定

將重組E1蛋白作為抗原，免疫前的鼠血清作為陰性血清，制備的鼠抗E1血清作為待檢樣品，進(jìn)行間接ELISA實驗。結(jié)果表明，制備的鼠抗E1血清與相應(yīng)的重組E1蛋白有較強的反應(yīng)性，血清最大稀釋度為1∶25 600，即為鼠抗E1蛋白血清效價(見表1)。

2.4間接免疫熒光檢測免疫原性

接種SAV 1的CHSE-214細(xì)胞和未接種病毒的CHSE-214細(xì)胞分別與制備的鼠抗E1血清作用，經(jīng)間接免疫熒光試驗檢測，結(jié)果顯示接種SAV的細(xì)胞能發(fā)出不同程度的綠色熒光，而細(xì)胞對照則未見熒光，說明鼠抗E1血清與SAV發(fā)生特異性反應(yīng)(見圖4)。

表1　間接ELISA檢測SAV E1蛋白結(jié)果

圖4　鼠抗E1血清與SAV的間接免疫熒光試驗(100×)

3討論

近年來鮭科魚類養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，各養(yǎng)殖區(qū)之間貿(mào)易頻繁，SAV感染鮭科魚類引起鮭魚胰腺病和暈睡病已經(jīng)擴散至歐洲各國家[14-16]，給鮭鱒的養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。我國目前尚未發(fā)現(xiàn)此病的發(fā)生，為防止該病傳入我國，建立 SAV 的快速、靈敏、特異的檢測方法，對防范外來水生動物疫病的傳入工作的開展尤為重要。

建立特異靈敏的檢測方法，首先需要制備高效的檢測試劑。E1蛋白是SAV的結(jié)構(gòu)蛋白，大小為461個氨基酸，為跨膜糖蛋白暴露于病毒粒子表面。各基因型之間E1蛋白98%以上的氨基酸保守，其中436～1137 bp這段基因在各亞型之間100%保守，且沒有糖基化位點[17]。因此，選擇SAV各基因型E1蛋白(436～1137 bp)基因進(jìn)行原核表達(dá)，制備的檢測試劑可以檢測已發(fā)現(xiàn)六個基因型的SAV。

以純化的SAV病毒作為檢測試劑，存在操作繁鎖、穩(wěn)定性差、產(chǎn)量低、成本高和生物安全隱患等方面問題[18]。原核表達(dá)系統(tǒng)作為成熟的操作系統(tǒng)，具有成本低、表達(dá)量高、操作簡單、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于診斷試劑制備、蛋白功能研究和亞單位疫苗的生產(chǎn)等方面[19]。

本研究將SAV E1 436～1137 bp這段高保守基因pCold TF表達(dá)載體連接并構(gòu)建重組表達(dá)系統(tǒng)，獲得的重組pCold TF-E1蛋白作為免疫原免疫小鼠，制備抗血清。重組pCold TF-E1蛋白以可溶形式存在，且具有較好的反應(yīng)性，利于后期采用親和層析法純化目的蛋白，在實際應(yīng)用中可縮短生產(chǎn)時間，降低成本。通過間接免疫熒光實驗表明，鼠抗E1蛋白血清可與SAV發(fā)生特異反應(yīng)，表明制備的可溶重組E1蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。這為E1高保守區(qū)蛋白作為SAV的檢測試劑及檢測SAV方法的建立提供了理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

收稿日期：2015-05-19；

修訂日期：2016-03-25

第一作者簡介：蔣燁(1988-)，男，碩士研究生，專業(yè)方向為水產(chǎn)動物醫(yī)學(xué)。E-mail:356916269@qq.com 通訊作者：劉敏。E-mail:liumin-707@163.com

中圖分類號：S941.41

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)04-0049-05

Prokaryotic expression and analysis of a recombinant fusion protein of highly conserved region of salmonid alphavirus E1 gene

JIANG Ye1,DU Hang1,TANG Li-jie2,QIAO Xin-yuan2,WANG Li2,GUAN Xue-ting1,JIANG Yan-ping2,CUI Wen2,LI Yi-jing2,LIU Min1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

Abstract：Highly conservative sequence of salmonid alphavirus E1 gene (702 bp) was synthesized according to sequences of E1 gene of SAV1,SAV2 and SAV3 published in GenBank.It was cloned into prokaryotic expression vector pCold TF to construct recombinant plasmid.The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 cells.The expression of recombinant plasmid pCold TF in E.coli BL21 was induced using IPTG at 1.0 mmol/L.The target protein of 95 kD was obtained and confirmed by SDS-PAGE and Western blot.The recombinant protein was purified by nickelionaffinity chromatography,and antiserum was produced.Indirect ElISA showed the antiserum against E1protein had OD values at least twice that obtained for the negative control serum at a dilution of 1∶25 600.IFA showed the antiserum against E1 protein reacted specifically with SAV.The results indicated that the recombinant E1 protein was immunogenical and antigenical,which established a foundation for further study on detection method of SAV.

Key words：salmonid alphavirus,highly conserved E1 protein,prokaryotic expression,immunogenicity

資助項目：國家科技支撐計劃(2013BAD12B02)