尚　卿，劉遠梅，高明娟

(1.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 普通外科，河南 新鄉(xiāng)　453003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 小兒普胸泌外科，貴州 遵義　563099)

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技術(shù)與方法

新生大鼠腸神經(jīng)嵴干細胞的體外培養(yǎng)和鑒定

尚卿1，劉遠梅2，高明娟2

(1.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 普通外科，河南 新鄉(xiāng)453003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 小兒普胸泌外科，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 探索體外分離培養(yǎng)新生大鼠腸神經(jīng)嵴干細胞(ENCSCs)的方法，觀察腸神經(jīng)嵴干細胞神經(jīng)球(NLBs)的原代及分化情況。方法 取新生SD大鼠，無菌環(huán)境下解剖分離從小腸至直腸的腸管，胰酶消化成單細胞懸液后，接種于培養(yǎng)瓶行原代培養(yǎng)，并傳代；傳到第3代時，加入分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)。觀察ENCSCs原代培養(yǎng)及分化培養(yǎng)的情況，免疫熒光染色觀察NLBs巢蛋白(nestin)的表達以及分化后ENCSCsHuD蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達情況。結(jié)果 ENCSCs原代培養(yǎng)第1天，可見細胞貼壁成長，第2天，貼壁細胞減少，出現(xiàn)大量懸浮的細胞團，第4天，懸浮細胞團增大，形成體積稍小的NLBs，7 d后，大量NLBs漂浮于培養(yǎng)液中。未分化的NLBs行免疫熒光染色可見nestin陽性表達；NLBs分化后貼壁的細胞可見HuD、GFAP陽性表達。結(jié)論 新生大鼠腸道可提取出ENCSCs，培育出ENCSCs神經(jīng)球，并能夠分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。

[關(guān)鍵詞]腸神經(jīng)嵴干細胞；細胞培養(yǎng)；細胞分化

腸道的運動由腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)控制，其所有神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞均起源于神經(jīng)嵴干細胞(neural crest stem cell，NCSCs),各種原因引起的神經(jīng)嵴干細胞遷移、增殖和分化異常，均會造成腸神經(jīng)元解剖和功能異常，可導(dǎo)致先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung’s disease，HD)發(fā)生。目前國外研究較多的是胚胎腸神經(jīng)嵴干細胞(enteric neural crest stem cells,ENCSCs)的分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化和移植，但是胚胎ENCSCs的提取存在倫理學(xué)上的爭議，以及異體干細胞移植所帶來的免疫排斥反應(yīng)，因此，成體ENCSCs的體外研究將為以后的移植試驗帶來新的契機。本研究通過細胞培養(yǎng)和免疫熒光染色方法觀察新生大鼠腸道ENCSCs的分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化以及增殖情況，檢測NLBs的nestin及分化后貼壁細胞的HuD蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達，探討成體ENCSCs體外增殖、分化的特性，為移植治療巨結(jié)腸提供可靠的供體細胞。

1材料與方法

1.1實驗動物選用出生24 h內(nèi)的SD大鼠，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供的成年健康未經(jīng)產(chǎn)雌鼠所產(chǎn)。本實驗設(shè)計符合動物保護條例并經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院動物保護委員會批準(zhǔn)。

1.2主要試劑ENCSCs完全培養(yǎng)基：每100 mL DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)含B27添加劑2 mL，β巰基乙醇5 μmol(美國Gibco公司)，重組人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)2 μg，表皮生長因子(EGF)2 μg(美國peprotech公司)，青鏈霉素各10 000 U(北京索萊寶科技有限公司)；ENCSCs分化培養(yǎng)基：90 mL完全培養(yǎng)基加10 mL胎牛血清(美國Hyclone公司)混合。胰酶(北京索萊寶科技有限公司)，一抗小鼠抗鼠HuD多克隆抗體、兔抗鼠Nestin多克隆抗體、兔抗鼠GFAP多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，二抗FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國Proteintech Group公司)，DAPI熒光染料(瑞士Roche公司)。

1.3試驗方法

1.3.1提取ENCSCs進行原代培養(yǎng)于無菌環(huán)境中，取一窩新生24 h內(nèi)的乳鼠，取出從小腸至直腸的全部腸管組織，剪碎、胰酶分別消化2次后，取得腸管組織細胞懸浮液，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL后接種至25 cm培養(yǎng)瓶，置于37 ℃，5%CO2水平培養(yǎng)箱中行原代培養(yǎng)；孵育24 h后，3/4量換液，之后每2天半量換液1次，觀察記錄ENCSCs的生成神經(jīng)球(NLBs)的情況并及時傳代，傳至3代進行Nestin免疫熒光染色。

1.3.2進行ENCSCs的分化培養(yǎng)將傳至第3代的NLBs接種于35 mm細胞培養(yǎng)皿，添加分化培養(yǎng)基1 mL，置于37 ℃，5%CO2水平培養(yǎng)箱中行分化培養(yǎng)，每2天半量換液1次，觀察記錄分化細胞生長情況，待細胞長滿皿底后行HuD、GFAP免疫熒光染色。

2結(jié)果

2.1ENCSCs的原代培養(yǎng)及分化培養(yǎng)原代培養(yǎng)第1天，可見不同形態(tài)的貼壁細胞，大量懸浮死細胞及細胞碎片，培養(yǎng)基渾濁(見圖1A)；第2天，貼壁細胞數(shù)量減少，可見許多由幾個或十幾個細胞組成的細胞團懸浮，體積小，形態(tài)不規(guī)則，培養(yǎng)瓶底可見大量細胞碎片(見圖1B)；第4～5天時，細胞團增大，形態(tài)規(guī)則，成球狀，經(jīng)多次換液后，瓶底較之前清晰(見圖1C)；至第7天時，可見培養(yǎng)液中大量NBLs形成，呈懸浮生長(見圖1D、E)。添加分化培養(yǎng)基后1 d，NLBs開始貼壁，可見單個細胞從NLBs中爬出呈貼壁生長，至第7天，NLBs基本消失，貼壁細胞基本長滿培養(yǎng)皿，呈單層細胞生長，細胞形態(tài)多樣。

A:原代第1天(×100)；B：原代第2天(×100)；C：原代第4天(×100)；D：原代第7天(×40)；E：原代第7天(×400)。圖1　ENCSCs經(jīng)原代培養(yǎng)后不同時間段的鏡下觀察結(jié)果

2.2NLBs的nestin以及分化后的HuD、GFAP免疫熒光染色結(jié)果可見NLBs細胞核呈明亮的藍色熒光(DAPI染色)，nestin表達陽性，呈黃綠色熒光，提示存在神經(jīng)干細胞(見圖2)。分化后的貼壁細胞經(jīng)HuD、GFAP免疫熒光染色后，鏡下見分化后的貼壁細胞HuD、GFAP陽性表達，呈黃綠色熒光、DPAI染色呈藍色熒光(見圖3～4)。

圖2　NLBs的nestin免疫熒光染色結(jié)果(×200)

圖3　NBLs分化后的HuD免疫熒光染色結(jié)果(×200)

圖4　NBLs分化后的GFAP免疫熒光染色結(jié)果(×200)

3討論

人體胃腸道受到中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)和腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)共同支配，雖然后者受到前者的調(diào)控，但腸神經(jīng)系統(tǒng)存在獨立的反射弧，具有神經(jīng)元信號整合功能，可直接接受胃腸道內(nèi)的各種信息，并調(diào)控胃腸道功能，可以說是一個相對獨立的神經(jīng)系統(tǒng)，同時，消化道壁內(nèi)的神經(jīng)細胞數(shù)量僅次于大腦，因此，腸神經(jīng)系統(tǒng)也被稱作腸腦。腸神經(jīng)系統(tǒng)包含胃腸道的黏膜下神經(jīng)叢和腸肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)節(jié)細胞、中間連結(jié)纖維以及神經(jīng)叢發(fā)出供應(yīng)胃腸道平滑肌、腺體和血管的神經(jīng)纖維，這些神經(jīng)元細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞均起源于ENCSCs。胚胎第5周開始神經(jīng)管原ENCSCs通過迷走神經(jīng)由口端向尾端遷徙，約第12周時完成遷徙，最后定居于全部腸道，形成腸神經(jīng)系統(tǒng)的主要組成部分[1]。因此，各種因素導(dǎo)致ENCSCs的遷徙、分化和存活障礙，均會造成腸神經(jīng)系統(tǒng)的功能異常[2]。

現(xiàn)今，國內(nèi)外學(xué)者已對ENCSCs進行了大量的研究，李仲榮等[3]利用神經(jīng)干細胞特異性標(biāo)志來研究ENCSCs的增殖、凋亡、遷徙和分化特性，證實了大鼠胚胎腸管培養(yǎng)出的ENCSCs移植到同種幼鼠的結(jié)腸和幽門基層后能夠存活，并向四周遷移的同時分化成神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，肖莉等[4]依據(jù)神經(jīng)干細胞經(jīng)典培養(yǎng)法，聯(lián)合應(yīng)用特殊培養(yǎng)基和連續(xù)傳代法成功地進行了小鼠胚胎及成體小鼠ENCSCs的體外分離培養(yǎng)及鑒定，且證明均能在體外分化成腸神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞類型，Lindley等[5]從胚胎鼠及巨結(jié)腸患兒腸管中分離出ENCSCs并移植入無神經(jīng)節(jié)胚胎鼠腸管，發(fā)現(xiàn)移植細胞能夠協(xié)調(diào)腸環(huán)形肌層鈣離子活動、并部分恢復(fù)腸管的收縮性，Metzger等[6-7]也從80歲老人腸管分離出ENCSCs，并分化為具有腸神經(jīng)系統(tǒng)特征的神經(jīng)元及其亞型和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，Azan等[8]和張建軍等[9]的實驗分別證實了成人和HD患兒正常腸黏膜下層存在可以修復(fù)外周神經(jīng)系統(tǒng)腸神經(jīng)干細胞，甚至可以從腸黏膜活檢標(biāo)本中分離、體外培養(yǎng)腸神經(jīng)干細胞。這些方法都為ENCSCs移植治療HD提供了可靠的理論基礎(chǔ)，因此將ENCSCs移植到神經(jīng)元發(fā)育缺陷腸段，通過干細胞在腸壁內(nèi)遷移、分化、增殖，恢復(fù)正常腸神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，達到根治HD的目的，可能是一種理想的方法。

神經(jīng)干細胞標(biāo)記物nestin是一種中間絲狀蛋白(神經(jīng)巢蛋白)，是早期胚胎神經(jīng)上皮干細胞和神經(jīng)干細胞的特異性生物學(xué)標(biāo)記物[10]，到目前為止，大多數(shù)研究仍然用nestin陽性作為神經(jīng)干細胞的標(biāo)記。有研究表明HuD的表達可以加速胚胎19d大鼠表皮神經(jīng)元的軸突生長[11]，而HuD缺陷小鼠則表現(xiàn)出胚胎腦神經(jīng)發(fā)育障礙，提取了這種小鼠的腦組織培養(yǎng)出的神經(jīng)球，其分化成神經(jīng)元的數(shù)量明顯小于正常小鼠[12]，這證明HuD在神經(jīng)元的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，此外，林中等[13]的研究發(fā)現(xiàn)HuD可以較明顯的標(biāo)記出豚鼠腸肌間神經(jīng)節(jié)細胞，表明HuD完全可以作為腸道神經(jīng)元的標(biāo)記物。GFAP是一種酸性蛋白，屬細胞骨骼蛋白，以中間微絲蛋白和可溶性蛋白兩種形式存在于膠質(zhì)細胞胞質(zhì)中，被認為是星形膠質(zhì)細胞的特異性標(biāo)記物[14]，常被用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標(biāo)記。

本實驗通過提取出生24 h內(nèi)的新生鼠腸管組織，體外培養(yǎng)形成NLBs，且表達神經(jīng)干細胞標(biāo)記物nestin，表明我們所培養(yǎng)的細胞有一定的干細胞特性，與此同時，我們對該NLBs進行了分化誘導(dǎo)，通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，分化后的細胞內(nèi)HuD蛋白、GFAP表達陽性，說明新生鼠腸管組織可以提取出ENCSCs并于體外分化為腸神經(jīng)系統(tǒng)的細胞類型，這為我們以后移植治療巨結(jié)腸動物模型提供了可靠的供體。

但是，本研究我們只單純檢測了nestin的表達，若要完全證實神經(jīng)嵴干細胞的存在，尚需檢測多種神經(jīng)干細胞不同時期的標(biāo)記物。此外由于取材部位的廣泛，即使經(jīng)過培養(yǎng)基的選擇作用以及反復(fù)傳代后的純化，仍然無法保證培育出的NLBs的純度。Becker等[15]對鼠類肌層和粘膜層分別取材培養(yǎng)出來的NLBs進行比較，無論從大小、生長速度、神經(jīng)干細胞標(biāo)記物表達含量上，肌層均明顯優(yōu)于粘膜層，而Binder等[16]通過流式細胞儀技術(shù)在小鼠和人身上提取出腸神經(jīng)嵴干細胞及非腸神經(jīng)嵴干細胞，再對這兩類細胞進行體外培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，兩者形成NLBs的形態(tài)、大小無明顯差異，而且nestin染色均為陽性，但前者p75、Sox100(均為神經(jīng)干細胞標(biāo)記物)表達陽性，后者卻表達陰性，這也進一步說明取材不同，培育出的NLBs存在本質(zhì)的差別。同時Hotta等[17]的實驗還證明，純的ENCSCs移植進入宿主腸管后，不僅能夠遷移分化，而且還可以與宿主ENS整合到一起，更有利于ENS功能的發(fā)揮。可以看出純的ENCSCs的分離培養(yǎng)為移植治療HD提供了一種新的研究方向，也為我們今后的實驗提供了著手點，可以相信，對ENCSCs的深入研究將給未來完全治愈HD帶來可能。

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[收稿2016-03-24;修回2016-04-20]

(編輯：王福軍)

[基金項目]貴州省科科學(xué)技術(shù)基金資助項目(NO：黔科合J字[2012]2364)。

[通信作者]劉遠梅，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：先天性肛門直腸畸形及先天性巨結(jié)腸，E-mail:yuanmei116@aliyun.com。

[中圖法分類號]R656.9

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)03-0314-05

Culture and identify enteric neural crest stem cells from neonatal rats in vitro

ShangQing1，LiuYuanmei2，GaoMingjuan2

(1.Department of General Surgery，Xinxiang Central Hospital，Xinxiang Henan 453003，China；2.Department of Pediatric General，Thoracic and Urinary Surgery，Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective To explore the method of ENCSCs’culture invitro,observe the primary culture cells and the differentiated cells.Methods Gut tissues of the neonatal rats within 24 h after birth were collected, digested into single cell suspension by trypsin, and transfered into culture bottles for primary cultures,subcultures and differentiation cultures at the 3rd generations.Observed and recorded the each period of cells, the expression of nestin in NLBs and the expression of HuD protein,GFAP in ENCSCs after differentiation was examined through immunofluorescence(IF) staining.Results The primary cultures: few cells attached to the bottom on the first day; the adherent cells were decreased and small cell clusters suspension formed on the second day; the suspension cell clusters increased in size and formed little NLBs after 4 days;a large number of NLBs floating in the medium at 1 week.The immunofluorescence staining: positive expression of nestin in NLBs and positive expression of Hud and GFAP in differentiated cells.Conclusion The intestine of postnatal rats could be used to extract ENCSCs successfully,and generate NLBs in vitro,which could differentiate into neurons and glial cells.

[Key words]enteric neural crest stemcells；cell culture；cell differentiation