徐元成，楊周亮，呂可君（永康市第一人民醫(yī)院，浙江 永康 321300）

胸水細胞塊在鑒別肺腺癌細胞和間皮細胞中抗體的選擇

徐元成，楊周亮，呂可君
（永康市第一人民醫(yī)院，浙江 永康 321300）

目的探討胸水CEA、TTF-1、MC、CR、CK7、EMA抗體在鑒別診斷肺腺癌細胞和反應(yīng)性增生間皮細胞中的應(yīng)用。方法選擇轉(zhuǎn)移性肺腺癌胸水45例及同期非腫瘤性胸水35例，所有納入病例的胸水標準為常規(guī)涂片或液基細胞涂片中發(fā)現(xiàn)有較多數(shù)量的腺癌細胞或間皮細胞，離心沉淀物做成細胞塊。檢測細胞塊中CEA、TTF-1、MC、CR、CK7、EMA抗體的表達，探討這些抗體在鑒別診斷胸水中肺腺癌細胞和反應(yīng)性增生間皮細胞的作用。結(jié)果CEA在肺腺癌細胞中的陽性率為93.3%，顯著高于反應(yīng)性增生間皮細胞（2.9%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；TTF-1在肺腺癌細胞中的陽性率為86.7%，顯著高于反應(yīng)性增生間皮細胞（0），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；MC在肺腺癌細胞中的陽性率為11.1%，顯著低于反應(yīng)性增生間皮細胞（91.4%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；CR在肺腺癌細胞中的陽性率為4.4%，顯著低于反應(yīng)性增生間皮細胞（88.6%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CK7和EMA在肺腺癌細胞中的表達率與反應(yīng)性增生間皮細胞比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。結(jié)論TTF-1 與CEA在肺腺癌細胞中呈高表達，而CR與MC在反應(yīng)性增生間皮細胞中高表達，可用于肺腺癌與反應(yīng)性間皮細胞增生的鑒別診斷。

胸水；細胞塊；肺腺癌細胞；間皮細胞；免疫組織化學(xué)

胸水細胞學(xué)檢查是肺癌合并胸腔積液患者最常見檢查項目之一，胸水中是否存在腺癌細胞，對肺腺癌患者診斷分期、化學(xué)治療及判斷預(yù)后至關(guān)重要。目前，三級乙等以下基層醫(yī)院病理科胸腹水診斷大多僅僅依靠細胞學(xué)涂片，陽性率偏低，主觀性強，特別是分化好的腺癌細胞與增生間皮細胞或者漿膜腔原發(fā)性間皮腫瘤細胞形態(tài)非常相似，鑒別兩者一直是細胞病理診斷的難點［1-2］。近年來，細胞塊技術(shù)在細胞學(xué)診斷領(lǐng)域取得很大進展［3-4］，本實驗在細胞學(xué)制片基礎(chǔ)上，參照文獻方法［5-6］，通過胸水離心后細胞沉淀物包埋做成蠟塊，結(jié)合免疫組織化學(xué)染色聯(lián)合檢測上皮細胞相關(guān)抗體和間皮細胞相關(guān)抗體，為臨床鑒別肺腺癌細胞和反應(yīng)性增生間皮細胞提供更可靠的依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料2014年1月～2015年8月選擇本院轉(zhuǎn)移性肺腺癌胸水45例（肺腺癌組），男19例，女26例，年齡40～79歲，中位年齡61.6歲，所有病例均經(jīng)過手術(shù)、纖維支氣管鏡或穿刺病理確診。同時選擇同期非腫瘤性胸水35例 （反應(yīng)性間皮細胞增生組），男19例，女16例，年齡35～77歲，中位年齡55.8歲。所有納入病例的胸水標準：常規(guī)涂片或液基細胞涂片發(fā)現(xiàn)有較多數(shù)量的腺癌細胞或間皮細胞。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑萊卡封閉式脫水機、安必平液基細胞制片儀、安徽中科中佳低速離心機，廣州深達生物制品技術(shù)有限公司生產(chǎn)的免疫組化試劑。

1.2.2細胞塊制作方法取新鮮胸水至少100mL，用50mL尖底離心管取兩管胸水置于離心機以2500r/min離心10分鐘，棄去上清液；如細胞沉淀過少，可再將剩余胸水加至離心管離心。棄去上清液，吸取少量沉淀物做常規(guī)涂片或液基細胞制片，剩余沉淀物加入4%中性甲醛10mL，室溫下固定1～24小時；取出沉淀物用包埋濾紙包好，和其他組織學(xué)標本放入自動脫水機中進行處理，制成石蠟細胞塊，切片，采用常規(guī)HE染色及免疫細胞化學(xué)染色，鏡下分析所見細胞的性質(zhì)。

1.2.3免疫組化染色所選抗體包括上皮細胞相關(guān)抗體：甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）、癌胚抗原 （CEA）、細胞角蛋白-7 （cytokeratin-7，CK7）、上皮膜抗原（epithelialmembrane antigen，EMA）和間皮細胞相關(guān)抗體：間皮細胞蛋白（mesothelial cell，MC）、鈣結(jié)合蛋白（calretinin，CR）作為一抗均為單克隆抗體，購自廣州深達生物制品技術(shù)有限公司。所有細胞蠟塊連續(xù)切片，厚度約3μm，于60℃烘干l小時，采用EnVision二步法，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，置顯微鏡下觀察。陰性對照采用PBS緩沖液代替一抗，陽性對照采用已證實為陽性的組織切片。陽性信號定位：CEA和CK7定位在細胞漿，TTF-1定位在細胞核，MC和EMA定位在細胞膜，CR定位在細胞漿或者細胞核，以染色呈黃色至棕褐色為陽性反應(yīng)。腺癌細胞或間皮細胞達到10%以上細胞陽性判斷為陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。

表1　各抗體在肺腺癌及反應(yīng)性增生間皮細胞中的陽性表達比較（n，%）

2　結(jié)果

CEA在肺腺癌細胞中的陽性率為93.3%，顯著高于反應(yīng)性增生間皮細胞（2.9%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；TTF-1在肺腺癌細胞中的陽性率為86.7%，顯著高于反應(yīng)性增生間皮細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；MC在肺腺癌細胞中的陽性率為11.1%，顯著低于反應(yīng)性增生間皮細胞（91.4%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；CR在肺腺癌細胞中的陽性率為4.4%，顯著低于反應(yīng)性增生間皮細胞（88.6%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CK7和EMA在肺腺癌細胞中的表達與反應(yīng)性增生間皮細胞比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。CEA、TTF-1、MC、CR、CK7、EMA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖1～6。

3　討論

胸腔積液中肺腺癌細胞與反應(yīng)性增生的間皮細胞形態(tài)有相似之處，有時單通過形態(tài)學(xué)特征進行鑒別難以作出正確判斷［1］，同一標本采用單純細胞涂片在不同病理醫(yī)師之間會存在診斷結(jié)果的差異。免疫組織化學(xué)染色近年來成為胸腔積液細胞學(xué)鑒別診斷的有效輔助方法，而細胞塊切片是免疫組織化學(xué)染色的良好載體。細胞塊切片背景干凈，較少假陽性情況，容易保存，可作多張切片，便于染色及對比分析［2］。

CEA最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌和胎兒腸組織中，故名癌胚抗原，在包括肺癌在內(nèi)的許多腫瘤中廣泛表達，癌旁正常黏膜CEA含量很少或為陰性。雖然在一些非腫瘤病變（如肺部感染、肝炎、潰瘍性結(jié)腸炎等）中CEA水平也會升高，但與惡性腫瘤相比，無論是升高的幅度還是出現(xiàn)的頻率均遠不及后者。腺癌患者CEA水平較其他病理類型腫瘤更高。本文肺腺癌細胞CEA陽性表達率93.3%，顯著高于反應(yīng)性增生間皮細胞的陽性表達率，可以作為肺腺癌及反應(yīng)性間皮細胞增生的鑒別診斷。TTF-1屬于NKx2家族成員之一，是一種核蛋白，分子量38kD，主要表達于肺及甲狀腺上皮細胞以及相對應(yīng)的癌細胞核，其他上皮細胞（如乳腺導(dǎo)管上皮細胞、胃腸道上皮細胞等）和間皮源性細胞均不表達［1］，因此其可用于肺腺癌細胞與間皮細胞的鑒別診斷。本文肺腺癌細胞標本中86.7%TTF-1表達陽性，與既往研究的敏感性54%～89%相似［7］，而間皮細胞內(nèi)無表達，特異性達到100%。因此TTF-1對轉(zhuǎn)移性肺腺癌的診斷均有較高的價值，尤其是與反應(yīng)性增生間皮細胞間的鑒別診斷，特異性達到100%。

MC主要分布在間皮細胞中，定位于細胞膜，而其他腺癌主要定位在細胞漿。MC在漿膜腔內(nèi)間皮細胞及其腫瘤的陽性表達率達79%［8］，在鑒別肺腺癌細胞和間皮源性細胞具有重要的臨床意義。本文反應(yīng)性增生間皮細胞中MC的陽性表達率為91.4%，顯著高于肺腺癌細胞中的陽性表達率。說明MC是增生間皮細胞的可靠標記物，可以用于鑒別增生間皮細胞和肺腺癌細胞。CR是神經(jīng)特異性鈣結(jié)合蛋白，屬于肌鈣蛋白C超家族，在增生的間皮細胞以及間皮瘤細胞中定位于細胞漿和細胞核，其在腺癌細胞中表達極低或者不表達。間皮細胞中其陽性表達率達到80%以上［8］。本文胸水細胞塊中反應(yīng)性增生間皮細胞CR的陽性表達率為88.6%，顯著高于肺腺癌細胞，說明其鑒別診斷反應(yīng)性增生間皮細胞具有較高的敏感性和特異性。

圖1　CEA在腺癌細胞中的陽性表達（EnVision×400）

圖2　TTF-1在腺癌細胞中的陽性表達（EnVision×400）

圖3　MC在間皮細胞中的陽性表達（EnVision×400）

圖4　CR在間皮細胞中的陽性表達（EnVision×400）

圖5　CK7在腺癌細胞及背景間皮細胞中的陽性表達（EnVision×400）

圖6　EMA在間皮細胞中的陽性表達（EnVision×400）

CK7屬于細胞角蛋白，主要表達在肺、乳腺、胰腺等腺上皮，一般結(jié)腸腺上皮不表達。本文CK7在肺腺癌細胞和間皮細胞的陽性表達率分別為95.6%和80.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。EMA是一種糖蛋白，主要分布于上皮細胞的腔緣表面膜，是上皮源性腫瘤標志物之一。本文肺腺癌細胞中的EMA陽性表達率和間皮細胞中的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

綜上所述，胸水細胞塊切片用做免疫組織化學(xué)染色的載體具有背景清晰、定位良好等優(yōu)點。TTF-1 與CEA在肺腺癌細胞中呈高表達，是肺腺癌的可靠標志物；而CR與MC在反應(yīng)性增生間皮細胞中高表達，是間皮細胞的可靠標志物，以上指標均可用于肺腺癌與反應(yīng)性間皮細胞增生的鑒別診斷；而CK7 和EMA在肺腺癌細胞和反應(yīng)性增生間皮細胞中均有陽性表達，陽性表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

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