鄭華峰 陶晶 張斌 王純 吳淳

基礎(chǔ)研究

MiR-495通過下調(diào)PCNA抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用研究

鄭華峰 陶晶 張斌 王純 吳淳

目的 探討microRNA-495（miR-495）對人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用及其分子作用機制。方法 選擇人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，將 miR-495 mimics（模擬物）或miR-495 inhibitors（抑制物）轉(zhuǎn)染HUVECs，分別以mimics control和inhibitors control作為對照。通過MTT實驗分析過表達(dá)或干擾miR-495對HUVECs細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)而通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，熒光定量PCR及Western blot，預(yù)測并驗證miR-495靶基因，最后通過功能互補實驗，觀察提高或敲低增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)對HUVECs細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 體外細(xì)胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-495可明顯抑制HUVECs細(xì)胞的增殖，而干擾miR-495則可促進(jìn)HUVECs細(xì)胞的增殖。PCNA是miR-495的靶基因，過表達(dá)miR-495可明顯下調(diào)HUVECs細(xì)胞中PCNA mRNA及蛋白表達(dá)水平。功能互補實驗顯示，敲低PCNA的表達(dá)亦可降低HUVECs細(xì)胞的增殖，反之促進(jìn)HUVECs細(xì)胞的增殖。結(jié)論 MiR-495可抑制HUVECs細(xì)胞的增殖,其作用機制主要通過下調(diào)PCNA的表達(dá)而實現(xiàn)。

MiR-495； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 增殖； 增殖細(xì)胞核抗原

缺血性疾病引起的組織缺血和功能障礙與供血不足密切相關(guān)，缺血刺激下的自然修復(fù)過程常常不足以對抗血管狹窄或閉塞引起的組織血流灌注不足。臨床治療性血管形成主要應(yīng)用于不適應(yīng)手術(shù)治療的冠心病、腦及外周血管疾病等缺血性疾病[1,2]。故此，探討生理和病理狀態(tài)下血管形成和消退規(guī)律及其分子機制，將為缺血性疾病的治療提供新的實驗支持[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells）是血管內(nèi)膜主要的構(gòu)成細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，多種生物活性物質(zhì)可以調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的功能，如一氧化氮（NO）、血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等[4,5]。

MicroRNAs（MiRNAs）是一類內(nèi)生性的、長約22個堿基的小分子RNA，主要通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控下游基因表達(dá)[6]。大量研究表明，miRNAs可廣泛參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、血管生成、腫瘤形成及損傷修復(fù)等幾乎所有生理病理過程[7,8]。近年來越來越多的研究表明，miRNAs在血管形成過程中也發(fā)揮著重要作用，如miR-107具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞（VSMCs）增殖作用[9]；血管形成過程中表達(dá)升高的miR-21具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增值和分化的作用[10,11]；表達(dá)降低的miR-92a可顯著抑制血管重構(gòu)過程中血管生成[12]。MiR-495屬于miRNAs家族成員之一，目前關(guān)于miR-495對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用尚未見研究報道。本研究第一次通過體外細(xì)胞實驗證明，miR-495具有抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，并初步探索其分子機制，為研究缺血性疾病中血管形成分子生物學(xué)機制奠定新的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 總RNA提取試劑 Trizol（Invitrogen，USA），反轉(zhuǎn)錄試劑盒 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Takara，Japan），熒光定量試劑盒SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR Kit（Takara，Japan），PCR擴(kuò)增引物由上海生工公司合成。MiR-495 mimics（5′-UCUUCACGUGGUACAAACAA-3′）及mimics control（5′-UAAUGUCCAUACAAUUAA-3′），miR-495 inhibitors（5′-AGAAGUGCACCAUGUUUGUU-3′）及inhibitors control（5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′）；siPCNA（5′-GAACUGCUUCUAAGAUGCCAGCAUA-3′）及siNC（5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUU-3′）均購自蘇州吉瑪公司。鼠抗人PCNA單克隆抗體（ab29）及抗GAPDH單克隆抗體（ab8245）購自英國Abcam。雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。細(xì)胞培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Invitrogen公司。普通PCR儀（BIO-RAD，USA），NanoDrop 2000c紫外分光光度計（ThermoScientific，USA），LightCycler480熒光定量PCR儀（Roche，Germany）等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）購自中科院上海細(xì)胞庫，在超凈臺中將用干冰保存的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入含有5 ml配制好的DMEM培養(yǎng)基的15 ml離心管中，輕輕吹打混勻后進(jìn)行1000 rpm室溫下離心5 min，棄上清后再加入5 ml新的培養(yǎng)基輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)入小號無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。體外實驗均分為2組，其中實驗組分組如下：miR-495 mimics或miR-495 inhibitors，陰性對照組轉(zhuǎn)染mimics control或inhibitors control；siPCNA或pCDNA3.1+PCNA，陰性對照組轉(zhuǎn)染 siNC或 pCDNA3.1+。按照lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，48 h后，按照相應(yīng)實驗需要進(jìn)行處理。

1.3 細(xì)胞總RNA提取及cDNA合成 按Trizol試劑所明書，在每1 ml Trizol中加入適量的細(xì)胞，冰上充分裂解5 min，之后加入氯仿0.2 ml，充分混勻后室溫靜置5 min，以12 000 rpm離心15 min，吸去上清后轉(zhuǎn)入新的Eppendorf管中，加入異丙醇0.5 ml，混勾后放置于4℃冰箱10 min。再次在4℃條件下，12 000 rpm離心10 min，去上清后留取沉淀，加入1 ml 75%已經(jīng)預(yù)冷的乙醇，震蕩洗滌沉淀RNA，12 000 rpm離心5 min，吸去上清后空氣干燥10 min，加入4℃DEPC水以充分溶解。采用NanoDrop 2000c紫外分光光度計對RNA濃度進(jìn)行測定，并按TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒說明書反轉(zhuǎn)合成cDNA，保存-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光定量PCR實驗 按照SYBR premix Ex TaqTMⅡPCR Kit試劑盒說明書，以合成的cDNA作為模版在LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。MicroRNA PCR反應(yīng)體系為：模版cDNA 1μl，miR-495特異性引物 0.4μl，10× miScript Universal Primer 2μl，2×SYBR premix Ex TaqTMⅡPCR 10μl，miR-495上游引物為 5′-TTCTTCACGTGGTACAAACAA-3′，下游引物為Takara公司試劑盒提供的通用引物；以U6作為內(nèi)參，U6上游引物為 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，加RNase-free water至反應(yīng)總體積為20μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃15 min，隨后95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共45個循環(huán)。以實驗所用內(nèi)參U6作為標(biāo)準(zhǔn)化對照，采用ΔΔCT分析方法計算qPCR儀所得數(shù)據(jù)[13]。

普通基因PCR反應(yīng)體系為：模版cDNA 1μl，PCNA上下游引物各 0.8μl，2×SYBR premix Ex TaqTMⅡPCR 10μl，PCNA上游引物為5′-CTGCCTGTAGCGGCGTTGTTGC-3′、下游引物為5′-GGCCTCGTTGATGAGGTCCTTG-3′；以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH上游引物為5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCT-3′、下游引物為5′-ACTCCGACCTTCACCTTCC-3′，加RNase-free water至反應(yīng)總體積為20μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃2 min，隨后95℃10 s，60℃20 s，72℃10 s，共45個循環(huán)。以實驗所用內(nèi)參GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化對照，采用ΔΔCT分析方法計算qPCR儀所得數(shù)據(jù)[13]。

1.5 細(xì)胞生長實驗 將培養(yǎng)好的HUVECs使用96孔板進(jìn)行鋪板，每孔細(xì)胞數(shù)約達(dá)5000個，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)染 miR-495 mimics或 mimics control，miR-495 inhibitors或 inhibitorscontrol；siPCNA 或 siNC，pCDNA3.1+PCNA或pCDNA3.1+。48 h后，所培養(yǎng)細(xì)胞每孔連續(xù)4 d每天加入 16μl MTT（5 g/L， Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）與細(xì)胞共孵育4 h，棄去上清，最后以150μl二甲亞砜溶解，測450 nm波長時的吸光度，各組求均值做生長曲線。

1.6 MiR-495靶基因生物信息學(xué)預(yù)測 采用mi－Randa、TargetScan和PicTar等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-495的靶基因。

1.7 雙熒光素酶報告基因構(gòu)建 以合成的cDNA作為模板，按以下引物擴(kuò)增靶基因PCNA mRNA 3′-UTR區(qū)域。利用引物分析軟件Primer Premier 5.0設(shè)計針對PCNA mRNA 3′-UTR的引物，上、下游引物分別引入限制性內(nèi)切酶XhoI和NotI識別位點。上游引物為 5′-GCATTCTTAAAATTCAAGAAAATAA-3′（XhoI），下游引物為5′-TGATGTTTGAAATTCAAGTAACTT-3′（NotI）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用Xhol+Not1雙酶切后，接入同樣經(jīng)過Xhol+Not1雙酶切的雙熒光素酶報告載體psiCHECK2中，將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，使用PCR鑒定菌落。將含有目的片段的菌落進(jìn)行搖菌，按照質(zhì)粒提取試劑盒方法提取質(zhì)粒，將提取好的質(zhì)粒送上海生工公司進(jìn)行序列驗證。PCNA mRNA 3′-UTR結(jié)合miR-495的互補序列進(jìn)行AAACAA到GGGAGG點突變，此序列由上海生工生物工程有限公司制備，并經(jīng)測序驗證。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)后，按一定細(xì)胞數(shù)進(jìn)行24孔板鋪板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到55%～75%時，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，共同轉(zhuǎn)染psiCHECK2-PCNA-WT（野生型）、psiCHECK2-PCNA-MUT（突變型）和miR-495 mimics到HUVECs細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后換液，24 h后裂解細(xì)胞，按照Dual-LuciferaseRReporter Assay System（Promega）試劑盒說明進(jìn)行實驗，分別檢測螢火蟲及海腎的熒光值，驗證靶基因是否正確。

1.9 Western blot 將提取好的蛋白使用BCA定量試劑盒定量到2.5 μg/μl，按比例加入5×SDS上樣緩沖液，105℃加熱15 min使蛋白完全變性。制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量20μl，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入抗PCNA抗體（ab29，1∶1000稀釋），4℃過夜孵育及相應(yīng)的二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光膠片，于室溫下自然風(fēng)干，掃描儀掃描結(jié)果保存。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件。計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)比較采用兩個獨立樣本的Student′s t檢驗，細(xì)胞增殖實驗采用ANOVA檢驗。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 MiR-495對HUVECs細(xì)胞增殖的影響（n=3），a代表P＜0.05

2 結(jié)果

2.1 MiR-495對HUVECs細(xì)胞增殖的影響 MiR-495對HUVECs細(xì)胞增殖曲線見圖 1。MiR-495 mimics轉(zhuǎn)染組HUVECs細(xì)胞增殖速度相對mimics control組明顯下降，miR-495 mimics轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染1、2、3 d后 HUVECs細(xì)胞生長抑制率分別為3.35%、7.29%和11.08%；miR-495 inhibitors轉(zhuǎn)染組HUVECs細(xì)胞增殖速度相對inhibitors control組明顯增加，miR-495 inhibitors轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染1、2、3 d后HUVECs細(xì)胞生長促進(jìn)率分別為4.64%、6.29%和13.32%。

2.2 MiR-495靶基因生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果 利用miRanda、TargetScan和PicTar等數(shù)據(jù)庫分析miR-495的靶標(biāo)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCNA為miR-495的靶標(biāo)基因之一；進(jìn)一步結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)，我們猜測PCNA是miR-495的靶基因。MiR-495與PCNA mRNA 3′-UTR結(jié)合區(qū)域預(yù)測見圖2。

圖2 MiR-495與PCNA mRNA 3′-UTR結(jié)合區(qū)域預(yù)測

2.3 靶基因PCNA熒光素酶試驗 按照 lipofectamine2000說明書，miR-495 mimics和mimics control分別與psiCHECK2-PCNA-WT和psiCHECK2-PCNA-MUT轉(zhuǎn)染 HUVECs細(xì)胞。24 h后利用Promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進(jìn)行螢火蟲及海腎的熒光值測定。結(jié)果見圖3，發(fā)現(xiàn)miR-495可以與PCNA mRNA的3′-UTR結(jié)合，當(dāng)結(jié)合部位突變后，上述結(jié)合能力消失。

圖3 靶基因PCNA熒光素酶試驗（n=3），a代表P＜0.05

2.4 MiR-495對靶基因PCNA mRNA及蛋白水平的調(diào)控 按上述方法轉(zhuǎn)染miR-495 mimics后，經(jīng)熒光定量PCR擴(kuò)增得到各目的基因的Ct值，以2-ΔΔCT相對定量的方法分析各基因與GAPDH拷貝數(shù)的比值，比較miR-495 mimics和mimics control的差異，結(jié)果見圖 4。HUVECs細(xì)胞中 miR-495mimics轉(zhuǎn)染48 h后，靶基因PCNA mRNA表達(dá)水平明顯下降；同樣Western blot結(jié)果顯示，miR-495 mimics組PCNA蛋白表達(dá)水平亦明顯降低。

2.5 PCNA對HUVECs細(xì)胞增殖的影響 HUVECs細(xì)胞增殖曲線見圖5。siPCNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度相對siNC組明顯下降，siPCNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后1、2、3 d細(xì)胞生長抑制率分別為6.29%、8.29%和14.62%；而pCDNA3.1+PCNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后1、2、3 d細(xì)胞生長促進(jìn)率分別為4.63%、9.52%和16.28%。

3 討論

越來越多的研究表明，miRNAs參與了缺血性疾病中血管形成及重塑過程。體外實驗發(fā)現(xiàn)，miR-135b-5p、miR-499a-3p以及miR-206等均可直接促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[14,15]。相反，另一些miRNAs如miR-29c、miR-92a及miR-19b/221/222等具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用[16-18]。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為實驗對象，主要因為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是一種干細(xì)胞，其與人血管內(nèi)皮細(xì)胞功能十分相似，但具有無限次傳代能力且易于實驗操作[19]。

圖4 MiR-495對靶基因PCNA mRNA及蛋白水平的調(diào)控（A：mRNA；B：蛋白）（n=3），a代表P＜0.05

MiR-495定位于人17q11.2。到目前為止，關(guān)于miR-495的研究主要集中在腫瘤的各個方面，如miR-495在乳腺癌和淋巴瘤中明顯低表達(dá)，并發(fā)揮抑癌基因的作用[20,21]。MiR-495通過下調(diào)MTA3基因可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖與遷移[22]。MiR-495可抑制膠質(zhì)瘤及胃癌的遷移及侵襲能力[23,24]。目前關(guān)于miR-495在人血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究尚未見相關(guān)報道。

本研究通過體外MTT實驗，首次證明miR-495具有直接抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-495可顯著抑制HUVECs細(xì)胞的增殖，而干擾miR-495則具有促進(jìn)HUVECs細(xì)胞增殖的作用。大量研究證實，miRNAs對靶標(biāo)基因獨特的作用機制主要通過與靶標(biāo)基因 3′-UTR區(qū)域結(jié)合，從而抑制靶標(biāo)基因表達(dá)[7]。通過分析PCNA mRNA的3′-UTR序列，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)人PCNA mRNA 3′-UTR區(qū)域存在miR-495的結(jié)合位點。進(jìn)一步雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，轉(zhuǎn)染miR-495 mimics對psiCHECK2-PCNA-WT熒光素酶活性有明顯抑制作用，而對psiCHECK2-PCNA-MUT熒光素酶活性無影響。同時，熒光定量PCR和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-495可明顯降低靶基因PCNA mRNA及蛋白表達(dá)水平。

增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是由Miyahci等于1978年首次從系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中發(fā)現(xiàn)的。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，PCNA與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖過程中起重要調(diào)控作用。最近研究報道，PCNA亦可參與許多其他細(xì)胞重要活動，如細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、染色體重組及DNA甲基化等。體外功能互補實驗發(fā)現(xiàn)，干擾PCNA的表達(dá)可降低HUVECs細(xì)胞的增殖，而過表達(dá)PCNA則促進(jìn)HUVECs細(xì)胞的增殖。上述結(jié)果與過表達(dá)或干擾miR-495基本一致，表明miR-495可通過下調(diào)PCNA抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

圖5 PCNA對HUVECs細(xì)胞增殖的影響（n=3），a代表P＜0.05

綜上所述，本實驗首次揭示了miR-495可通過下調(diào)PCNA抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。MiR-495為研究缺血性疾病中血管形成分子生物學(xué)機制奠定了新的基礎(chǔ)。

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MiR-495 inhibits human vascular endothelial cells proliferation by down-regulating PCNA

ZHENG Hua-feng，TAO Jing，ZHANG Bin，et al.Department of Cardiology，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen 518036，China

WU Chun，E-mail：wuchun2012@163.com

Objective To investigate MicroRNA-495（miR-495）inhibits human vascular endothelial cells proliferation，and clarify its molecular mechanism.MethodsWe applied human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）and cultured in Dulbecco′s modified Eagles mediu（DMEM）.MTT assay was used to explore theproliferation ability of HUVECs，after transfected with miR-495 mimics or miR-495 inhibitors，with mimics control or inhibitors control as experimental control.Bioinformatics，luciferase reporter assay，Quantitative RT-PCR and Western blot analyses were used to predict and verify miR-495 target in HUVECs.Finally，HUVECs proliferation was also detected by using MTT assay after knock-down or over-expression PCNA（proliferating cell nuclear antigen）.ResultsOver-expression of miR-495 could significantly inhibit HUVECs proliferation，while interfering miR-495 expression could promote its proliferation in vitro.PCNA was a target gene of miR-495 in HUVECs and its mRNA and protein expression levels were significantly decreased after transfected with miR-495 mimics.Functions complementary experiments showed that knock-down PCNA could also arrest the HUVECs proliferation，and over-expression PCNA promoted cells proliferation.ConclusionMiR-495 could inhibit HUVECs cells proliferation,and its mechanism of action mainly executed by suppressing expression of PCNA.

MiR-495； HUVECs； Proliferation； Proliferating cell nuclear antigen

518036 廣東省深圳市，北京大學(xué)深圳醫(yī)院心內(nèi)科

吳淳，E-mail：wuchun2012@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.04.023

R54

A

1672-5301（2016）04-0374-06

2015-11-16）