王朝明,陳俊培,胡 繩，張方亮，張連勝,李烜楨

(1 河南省水文地質(zhì)工程地質(zhì)勘察院有限公司，河南 鄭州 450003； 2 山東省冶金設(shè)計(jì)院股份有限公司，山東 濟(jì)南 250101； 3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002)

石油污染土壤的微生物修復(fù)及其去毒效果研究

王朝明1,陳俊培1,胡 繩2，張方亮1，張連勝1,李烜楨3

(1 河南省水文地質(zhì)工程地質(zhì)勘察院有限公司，河南 鄭州 450003； 2 山東省冶金設(shè)計(jì)院股份有限公司，山東 濟(jì)南 250101； 3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002)

從中原油田石油污染土壤中分離到1株石油降解菌HNS-2，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為芽孢桿菌屬。該菌在10 d內(nèi)降解56.7%的石油，該菌對(duì)土壤中石油具有一定的降解能力，60 d 可降解46.3%的石油，添加營養(yǎng)劑、秸稈、十二烷基硫酸鈉以及進(jìn)行擾動(dòng)處理均可促進(jìn)菌株對(duì)石油的降解，其中以“連續(xù)投加菌劑+營養(yǎng)劑+秸稈”處理的效果最佳，降解率可達(dá)66.1%。通過蘿卜種子發(fā)芽試驗(yàn)，比較了不同處理對(duì)石油污染土壤的去毒效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)石油的降解率與發(fā)芽率基本一致，其中以“菌劑+營養(yǎng)劑+秸稈+擾動(dòng)”處理的發(fā)芽率最高。

微生物；降解；石油；土壤；修復(fù)

石油是原油和石油制品的總稱，是一種由多種烴類及少量非烴化合物和有機(jī)金屬組成的復(fù)雜混合物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國每年約有60多萬t的石油及其制品通過各種途徑進(jìn)入環(huán)境，污染土壤、地下水、河流、海洋[1]。石油進(jìn)入土壤后可引起一系列不良反應(yīng)，如通透性降低，肥力下降；阻礙根系呼吸與水分吸收，引起根系腐爛；改變土壤微生物數(shù)量和種群多樣性等[2]。因此，石油污染已引起人們的高度關(guān)注。對(duì)于土壤中的石油污染，目前有物理、化學(xué)和生物方法將其去除。物理和化學(xué)方法雖然見效快，但是成本較高，而且容易造成2次污染，因此限制了其在土壤修復(fù)中的應(yīng)用[3]。生物方法多采用微生物對(duì)石油進(jìn)行降解，該方法成本較低，而且不會(huì)造成二次污染，有望成為具有廣闊應(yīng)用前景的修復(fù)方法[4]。

本研究從中原油田土壤中篩選得到1株高效石油降解菌，比較了不同強(qiáng)化措施對(duì)菌株降解土壤中石油的影響，為石油污染土壤原位修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

石油污染土壤采自中原油田，用于分離石油降解菌。蘿卜種子(翠綠1號(hào))由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送。秸稈采自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場。

石油培養(yǎng)基成分為：石油10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaNO30.5 g， MgS04·7H2O 0.2 g，KH2PO41.0 g，NaH2PO4·H2O 1.0 g，CaCl2H2O 0.02 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基在石油培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加18g·L-1瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min即可。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，NH4NO32 g，K2HPO40.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，無水CaCl20.02 g，NaCl 5 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.02 g，蒸餾水l L，自然pH值，105 ℃滅菌20 min。

營養(yǎng)劑：KH2PO42 g，NH4NO32 g，蒸餾水1 L。

1.2降解菌株的篩選

取1 g石油污染土壤添加到100 mL石油培養(yǎng)基中，避光培養(yǎng)(28 ℃，180 r·min-1)7 d后，轉(zhuǎn)接于新的石油培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復(fù)5 次。取0.1 mL 培養(yǎng)液均勻涂布在含固體培養(yǎng)基的平板上，30 ℃避光培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況。待菌落長出，挑選形態(tài)不同的菌落轉(zhuǎn)接到新的含固體培養(yǎng)基的平板上，如此反復(fù)數(shù)次，直到形成形態(tài)單一的菌落，即為純化的菌株，4 ℃保存，備用。

將上述菌株接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1周(30 ℃、180 r·min-1)。取1 mL菌液(OD=0.8)接種于100 mL石油培養(yǎng)基中，建立降解體系并進(jìn)行培養(yǎng)(30 ℃、180 r·min-1)，10 d后分析降解體系中石油含量，以不接菌的處理作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，比較不同菌株的石油降解能力。

1.3菌株鑒定

將純化后的菌株接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d(28 ℃)，觀察形態(tài)特征，采用DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)提取菌株總DNA；采用引物27F及1492R進(jìn)行石油降解菌的16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性8 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)，最后72 ℃繼續(xù)延伸8 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物由北京美億美生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果導(dǎo)入GenBank數(shù)據(jù)庫中，通過BLASt進(jìn)行同源性比較。

1.4菌株對(duì)土壤中石油的降解

秸稈收獲后，用去離子水清洗3次，烘至恒重(60 ℃)，采用粉碎機(jī)充分粉碎后備用。 取老化的石油污染土壤200 g裝入玻璃杯中，按照表1進(jìn)行處理，維持田間最大持水量的60%，暗室培養(yǎng)(30 ℃)

表1 試驗(yàn)處理Table 1 Treatments of experiment

注：菌株接種于石油培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)7 d(180 r·min-1，30 ℃)即為菌劑；處理6中在培養(yǎng)第30 天第2次添加菌劑；處理8中擾動(dòng)處理即每周翻土1次；SDS為十二烷基硫酸鈉；TX-100為曲拉通 X-100。

Note：The microbial inoculum was made by incubation of strain in the culture contained oil after 7 d under 180 r·min-1，30 ℃. In treatment 6, the microbial inoculum was added twice on the 30th incubation day. In treatment 8, the soil was dug each week. SDS presented sodium dodecyl sulfate. TX-100 presented triton-100.

60 d，取樣分析石油含量。每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，以不添加菌劑和其他化學(xué)物質(zhì)的處理作為對(duì)照。試驗(yàn)分2批，一批用于石油含量分析，另一批進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)。

1.5土壤石油含量分析

采用質(zhì)量法分析石油含量[5]。具體方法為：稱取5.00 g風(fēng)干土樣于50 mL離心管中，加入20 mL二氯甲烷，密封，超聲提取15 min，離心(4 000 r·min-1)10 min，將上清液倒入烘至恒重的燒瓶中，重復(fù)萃取，如此反復(fù)3次，將上清液全部倒入燒瓶中，54 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，在通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)至恒重，稱重測量。

1.6種子發(fā)芽試驗(yàn)

取30 g 處理后的土壤平鋪于培養(yǎng)皿，播種20粒水蘿卜種子，表層敷上2～3 mm 厚土壤，維持最大田間持水量的60%，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，光照時(shí)間為8 h， 溫度25 ℃。培養(yǎng)第10天 統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)， 并計(jì)算發(fā)芽率。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1不同菌株對(duì)石油的降解能力

經(jīng)過初步篩選得到4株形態(tài)不同的菌株，分別命名為HNS-1、HNS-2、HNS-3和HNS-4。通過搖瓶試驗(yàn)比較了4株菌對(duì)石油的降解能力(表2)，發(fā)現(xiàn)

HNS-2對(duì)石油的降解率最高，達(dá)到45.2%。

表2 不同菌株對(duì)石油的降解能力Table 2 Oil degradation of different strains

2.2菌株鑒定

對(duì)分離到的石油降解菌HNS-2進(jìn)行形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)菌株菌落圓形，邊緣整齊，無色透明，光滑有光澤，呈半粒水珠狀，粘稠有彈性，菌體桿狀，大小為0.80～1.5 μm×2.4～5.0 μm。提取該菌DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增、16S rDNA測序，然后通過BLAST檢索并與Genebank中序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌基因序列與Bacillussp. 較為相似(圖1)，從圖1可知該菌屬于芽孢桿菌屬。

2.3菌株HNS-2對(duì)石油的降解

通過搖瓶試驗(yàn)研究了菌株HNS-2對(duì)石油的降解能力(圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌可以以石油為唯一碳源生長。在0.5%～2.5%內(nèi)，隨著石油的濃度的增加，降解率逐漸降低。石油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)降解率最高，為56.7%，較另一株芽孢桿菌屬H1的降解率(35%)高[2]，由此可見，菌株HNS-2具有較強(qiáng)的石油降解能力，有望用于石油污染的修復(fù)。

圖1 菌株HNS-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16s rDNA sequences of the strain HNS-1

含有同一字母的處理表示在0.05水平上差異不顯著。下同。The treatments with the same letter are not significantly different (P>0.05).The same as below.

2.4菌株HNS-2及不同強(qiáng)化措施對(duì)石油污染土壤修復(fù)效果

通過微宇宙試驗(yàn)研究了菌株HNS-2對(duì)石油污染土壤的修復(fù)效果，以及不同強(qiáng)化措施對(duì)該過程的影響(圖3)。從圖3可知，有21.1%的石油被去除，這有可能是土著微生物的降解作用造成的。處理3石油降解率顯著高于對(duì)照，達(dá)到46.3%，表明添加菌劑顯著提高了石油的降解率，菌株HNS-2具有降解土壤中石油的能力。處理4石油降解率為52.5%，高于處理3，表明添加營養(yǎng)劑一定程度上提高了菌株的石油降解率，有可能是營養(yǎng)劑中的氮和磷營養(yǎng)刺激了微生物代謝活性造成的。多項(xiàng)研究表明，在微生物修復(fù)石油污染土壤的過程中，

圖3 菌株HNS-2及不同強(qiáng)化措施對(duì)污染土壤的修復(fù)效果Fig. 3 Remediation efficiency of oil contaminated soil bystrain HNS-2 with different augmentation measures

合適的C∶ N∶ P比非常重要，以約100∶ 10∶ 0.3左右為宜[6]，而對(duì)于多數(shù)老化石油污染土壤，碳元素含量過高，而氮和磷容易虧缺，由此可見適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充氮磷營養(yǎng)是一種重要的石油污染土壤修復(fù)措施。同時(shí)發(fā)現(xiàn)菌劑與營養(yǎng)劑的聯(lián)合作用(處理4)大于單一營養(yǎng)劑(處理2，40.2%)，提示菌株HNS-2在石油污染土壤修復(fù)中發(fā)揮了重要作用。處理5的降解率(56.3%)高于處理4，表明添加秸稈一定程度上提高了石油的降解率，可能是由于秸稈增加了土壤的通氣度，從而提高了微生物的代謝活性。處理6的降解率(50.5%)低于處理5，而處理8的降解率(66.1%)顯著高于處理5，表明投菌量對(duì)修復(fù)效果的影響較大，連續(xù)投菌有利于石油降解。處理7的降解率(60.2%)高于處理5，表明擾動(dòng)可提高石油的降解率，與楊金鳳等[7]的研究結(jié)果一致。事實(shí)上，翻耕土壤是一種常用輔助修復(fù)措施，其原理是通過增加土壤中氧氣的含量提高修復(fù)效率[8-10]，這一現(xiàn)象在本研究中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。處理9的降解率(61.5%)高于處理5，而處理10的降解率(52.5%)低于處理5，SDS的效果優(yōu)于TX-100。石油屬于疏水性污染物，為了增加石油的生物可利用性，人們常常通過添加表面活性劑提高石油的降解率[11-14]，本研究結(jié)果表明，并非每種表面活性劑均可促進(jìn)石油降解，有可能與表面活性劑本身毒性有關(guān)。

由此可知，采用微生物修復(fù)石油污染土壤是有效的，其修復(fù)效果與投菌量有較大關(guān)系，連續(xù)投菌有助于石油的降解；添加營養(yǎng)劑、秸稈和對(duì)土壤進(jìn)行擾動(dòng)，均可在一定程度上強(qiáng)化修復(fù)效果。

2.5不同強(qiáng)化措施對(duì)石油污染土壤的去毒效果

土壤中石油的降解并不一定意味著毒性的去除，石油的中間代謝產(chǎn)物仍可能存在毒性，如作為石油主要成分的多環(huán)芳烴，被降解后其產(chǎn)物仍具毒性[15]，因此在實(shí)際修復(fù)過程中應(yīng)對(duì)石油污染土壤做毒性評(píng)價(jià)，以確定不同修復(fù)措施的去毒效果。本研究通過蘿卜種子發(fā)芽試驗(yàn)，評(píng)價(jià)了微生物修復(fù)及其強(qiáng)化措施對(duì)土壤的去毒效果(圖4)，研究發(fā)現(xiàn)，石油降解率與種子發(fā)芽率基本相符，即降解率越高，種子發(fā)芽率也越高，如對(duì)照中僅有42.1%的種子發(fā)芽率，而石油降解率較高的處理2和處理3的發(fā)芽率分別為55.2%和59.5%，均高于對(duì)照。但是，也存在一些特殊現(xiàn)象，如處理7的降解率低于處理8，而發(fā)芽率恰恰相反，這有可能是石油污染土壤經(jīng)過通風(fēng)處理后，其中間產(chǎn)物更容易被土著菌代謝，從而更為有效地去除了毒性。由此可見，通風(fēng)對(duì)石油污染具有較好的去毒效果。

圖4 菌株HNS-2及不同強(qiáng)化措施對(duì)污染土壤的去毒效果Fig. 4 Detoxifcation efficiency of oil contaminated soil bystrain HNS-2 with different augmentation measures

3 結(jié)論

從中原油田石油污染土壤中分離到1株石油降解菌HNS-2，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為芽孢桿菌屬。該菌可以以石油為唯一碳源進(jìn)行生長，在10 d內(nèi)降解56.7%的石油。該菌對(duì)土壤中石油具有一定的降解能力，60 d 可降解46.3%的石油，添加營養(yǎng)劑、秸稈、SDS以及進(jìn)行擾動(dòng)處理均可促進(jìn)菌株對(duì)石油的降解，其中以“連續(xù)投加菌劑+營養(yǎng)劑+秸稈”處理的效果最佳，降解率可達(dá)66.1%，而添加TX-100未能提高降解率。通過種子發(fā)芽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，石油的降解率與去毒效果基本一致，其中以“菌劑+營養(yǎng)劑+秸稈+擾動(dòng)”的聯(lián)合去毒效果最佳。

[1] 袁紅莉，楊金水，王占生. 降解石油微生物菌種的篩選及降解特性[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2003, 23(2): 157-161.

[2] 辛蘊(yùn)甜. 石油降解菌的降解性能、固定化及降解動(dòng)力學(xué)研究[D].上海：東華大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2013, 25-25.

[3] 吳凡，劉訓(xùn)理. 石油污染土壤的生物修復(fù)研究進(jìn)展[J]. 土壤, 2007, 39(5): 701-707

[4] 劉五星，駱永明，滕應(yīng)，等. 石油污染土壤的生物修復(fù)

研究進(jìn)展[J]. 土壤, 2006, 38(5): 634-639.

[5] 王如剛，王敏，牛曉偉，等. 超聲/索氏萃取一重量法測定土壤中總石油烴含量[J]. 分析化學(xué), 2010, 38(3): 417-420.

[6] LACOTTE D J, MILLE G, ACQUAVIVAH M, In vitro biodegradation of Arabian Light 250 by amarine mixed culture using fertilizers as nitrogen and phosphorous sources[J]. Chemosphere, 1995, 31(11/12): 4351-4358.

[7] 楊金鳳，陳鴻漢，王春艷，等. 生物通風(fēng)技術(shù)修復(fù)柴油污染土壤的土柱模擬實(shí)驗(yàn)[J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2012, 6(2): 653-657.

[8] 沈鐵孟，黃國強(qiáng)，李凌，等. 石油污染土壤生物通風(fēng)修復(fù)及其強(qiáng)化技術(shù)[J]. 環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備, 2002, 3(7): 67-70.

[9] 武海杰, 張秀霞, 白雪晶, 等. 用于石油污染土壤降解的高效降解菌的篩選及其降解條件優(yōu)化[J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2014, 8(3): 1229-1234.

[10] 董亞明, 劉其友, 趙東風(fēng), 等. 石油烴降解混合菌修復(fù)稠油污染土壤的影響因素[J]. 干旱區(qū)研究, 2013, 30(4): 603-608.

[11] 曹娟，徐志輝，李凌之，等. 產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解菌AcinetobacterBHSN的研究[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào), 2009, 25(1): 73- 78.

[12] 張偉娜, 殷永泉, 冉德欽, 等. 陰-非離子表面活性劑復(fù)配修復(fù)石油污染的土壤[J]. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2014, 34(3): 279-283.

[13] 馬超，劉光全，趙林，等. 表面活性劑在油污土壤修復(fù)中的應(yīng)用[J]. 污染防治技術(shù), 2013, 26(5): 55-59.

[14] 汪志榮, 馬傳鑫, 李燕妮, 等. 植物和微生物修復(fù)石油污染土壤的研究進(jìn)展[J]. 土壤, 2014, 46(2): 193-203.

[15] BAMFORTH S M, SINGLETON I. Bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons: current knowledge and future directions[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2005, 80(7): 723-736.

(責(zé)任編輯：朱秀英)

Microbioremediationofoilcontaminatedsoilanditsdetoxificationeffects

WANG Chaoming1， CHEN Junpei1， HU Sheng2， ZHANG Fangliang1， ZHANG Liansheng1，LI Xuanzhen3

(1.Henan Province Hydrogeology and Engineering Geology Exploration Institute Co., Ltd., Zhengzhou 450003,China； 2.Shandong Province metallurgical engineering Co., Ltd., Jinan 250101, China； 3.College of Forestry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

A strain HNS-2 with oil degrading ability was isolated from soil in Zhongyuan oil field. The strain was identified asBacillussp. based on the 16S rDNA sequencing analysis. The strain HNS-2 could grow with oil as the sole carbon source and degrade 56.7% of the oil within 10 d in liquid system. In case of soil, the strain could degrade 46.3% of the oil within 60 d. All treatment of addition of nutritional agents, straw, sodium dodecyl sulfate and disturbance could improve the oil degradation. The maximal degradation rate (66.1%) was observed under treatment of “addition microbial inoculum successively + nutritional agents + straw”. The germination test was performed to evaluated detoxification efficiency of different remedial treatment using radish seed. The results showed that oil degradation rate was nearly agreement with germination percentage. However, the highest germination percentage was observed under treatment of “microbial inoculum + nutritional agents + straw + disturbance”.

microorganism； degradation； oil； soil； remediation

2015-05-19

濮陽市中原油田(五廠)石油污染重點(diǎn)區(qū)土壤修復(fù)項(xiàng)目(2012)512號(hào)

王朝明(1976-)，男，河南周口人，主要從事環(huán)境微生物研究。

張連勝(1963-)，男，河南蘭考人，教授級(jí)高級(jí)工程師。

1000-2340(2016)04-0558-05

X 703

：A