朱文明，潘旭輝，郭珍珍，王亞賓,2，胡 慧,2，陳麗穎,2

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院, 河南 鄭州450002； 2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州450002)

粗提牛白細(xì)胞抗菌肽對(duì)冷藏肉的抑菌效果觀察

朱文明1，潘旭輝1，郭珍珍1，王亞賓1,2，胡 慧1,2，陳麗穎1,2

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院, 河南 鄭州450002； 2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州450002)

為探討粗提牛白細(xì)胞抗菌肽對(duì)冷藏肉的抑菌效果，通過牛白細(xì)胞粗提抗菌肽的制備、粗提抗菌肽的抑菌活性測(cè)定與最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定、生鮮豬肉冷藏期間菌落總數(shù)的變化測(cè)定和抗菌肽對(duì)冷藏肉保鮮效果的觀測(cè)，對(duì)添加粗提抗菌肽的生鮮豬肉在冷藏期間菌落總數(shù)的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，牛白細(xì)胞抗菌肽對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)均具有明顯的抑菌活性；粗提抗菌肽對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均是0.619 μg·μL-1；生鮮豬肉樣品在冷藏過程中的自身菌落變化規(guī)律是前期保持細(xì)菌正常鐘形生長曲線，隨著冷藏時(shí)間的延長，嗜冷細(xì)菌逐漸適應(yīng)開始另一段生長趨勢(shì)；在表面噴灑粗提抗菌肽后108 h內(nèi)，冷藏肉的感官指標(biāo)明顯優(yōu)于對(duì)照組，其菌落總數(shù)也比對(duì)照組有顯著降低(P<0.05)，抑菌率維持在60%～99%，效果最高時(shí)可達(dá)99%。研究結(jié)果表明粗提牛白細(xì)胞抗菌肽可以有效抑制冷藏肉中的細(xì)菌增殖，可延長冷藏肉的保存期限，具有良好抑菌效果。

白細(xì)胞；抗菌肽；冷藏肉；抑菌效果；防腐保鮮

抗菌肽(Antibacterial Peptide, ABP)又稱抗微生物肽(Antimicrobial Peptide, AMP)或肽抗生素(Peptide Antibiotics)，廣泛分布于細(xì)菌、病毒和各種動(dòng)植物體內(nèi)，是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[1]。研究表明，抗菌肽抗菌肽對(duì)絕大多數(shù)革蘭陰性菌和革蘭陽性菌有顯著的抗菌活性，不易引起耐藥性，有望作為抗生素的替代物[2]；并且抗菌肽對(duì)病毒、真菌甚至寄生蟲也有一定的殺傷作用[3-4]。尤其是抗菌肽僅作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞[5]，還具有調(diào)節(jié)先天免疫和中和內(nèi)毒素的功能等優(yōu)點(diǎn)，因此抗菌肽有望開發(fā)成為新一代抗細(xì)菌、真菌、抗病毒和抗癌藥物，具有開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。另有研究表明，血中性白細(xì)胞的粗提液存在抗菌活性的主要原因是由于其中的內(nèi)源性抗菌多肽類物質(zhì)富含脯氨酸和精氨酸[6]。然而在粗提液中也存在其他的抗菌成分如較大的免疫相關(guān)蛋白的小碎片[7]。冷藏肉的保鮮一直是制約肉類食品食用安全的關(guān)鍵因素，而化學(xué)防腐劑本身存在著毒副作用或?qū)θ梭w健康具有潛在危害，其應(yīng)用受到各種限制?？咕囊蚱渚G色、天然、無毒害的特質(zhì)而有望被開發(fā)為新型食品防腐保鮮劑。其中，來自乳酸菌的細(xì)菌素——乳球菌肽(Nisin)對(duì)多種革蘭氏陽性菌有強(qiáng)烈抑制作用，已在乳制品加工、酒精飲料生產(chǎn)等方面得到廣泛應(yīng)用[8]。本研究利用從牛血液的白細(xì)胞中分離、提取的抗菌肽進(jìn)行體外抗菌活性試驗(yàn)，并應(yīng)用該粗提物進(jìn)行了冷藏肉防腐保鮮效果觀察，以期為進(jìn)一步開發(fā)新的肉品保鮮材料和保鮮方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)準(zhǔn)菌種和抗生素標(biāo)準(zhǔn)品

大腸桿菌(E.coli)ATCC43895和金黃色葡萄球菌(S.aureus) 1056MRSA，由本實(shí)驗(yàn)室保存。安普霉素、氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2生鮮肉樣品

新鮮豬里脊肉購自冷鮮肉超市，去脂肪、筋腱，根據(jù)試驗(yàn)需要分割成質(zhì)量及表面積大致相同的肉塊，放入保鮮盒中，于(4.0±0.5)℃冰箱中儲(chǔ)藏。全過程均在無菌條件下進(jìn)行。

1.3牛白細(xì)胞抗菌肽的粗提取

提取抗菌肽參考陳麗穎等[9]的方法。臨用時(shí)用0.01 %醋酸溶液稀釋至抗菌肽蛋白質(zhì)量濃度為3.13 g·L-1。

1.4粗提抗菌肽的平板抑菌試驗(yàn)

本試驗(yàn)采用微量瓊脂糖彌散法[10]。取抗菌肽粗提液和對(duì)照抗生素溶液，分別作用于對(duì)數(shù)生長期的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌受試菌株。同時(shí)設(shè)0.01 %乙酸為陰性對(duì)照。經(jīng)37 ℃過夜后測(cè)量各孔的抑菌圈直徑。并按下列公式計(jì)算抑菌活性單位。

抑菌活性單位=[抑菌環(huán)(圈)直徑(mm)-2]×10

1.5粗提抗菌肽的最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定

本試驗(yàn)采用96孔微量反應(yīng)板法[11]測(cè)定藥物和粗提抗菌肽的最小抑菌濃度。

1.5.1 細(xì)菌的準(zhǔn)備 該試驗(yàn)使用對(duì)數(shù)生長期的標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌株。將標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌株的菌種各50 μL接種在5 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床搖菌過夜培養(yǎng)所得。

1.5.2 抗菌肽與藥物的準(zhǔn)備 取白細(xì)胞粗提抗菌肽，用0.01%醋酸溶液稀釋至抗菌肽蛋白質(zhì)量濃度為3.13 mg·mL-1。將各抗生素用生理鹽水稀釋，使每個(gè)藥物質(zhì)量濃度為320 μg·mL-1。4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 MIC測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長期的標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌株菌液稀釋后加入于96孔板中，第1孔加入126 μL菌液，剩余7孔分別加入70 μL菌液。第1孔加入14 μL粗提抗菌肽溶液，混勻；吸出70 μL到第2孔，混勻；吸出70 μL到第3孔，混勻；如此依次稀釋到第8孔，棄去70 μL。用保鮮膜密封好，37 ℃靜置過夜(12～16 h)。對(duì)照組加入的為稀釋好的藥液(氨芐青霉素)14 μL。觀察結(jié)果，以≥50 %生長受抑制者為陽性，根據(jù)出現(xiàn)陽性孔的最高稀釋倍數(shù)計(jì)算MIC。每個(gè)菌株做2次重復(fù)，取平均值，即得到氨芐青霉素和抗菌肽的MIC。

1.6生鮮肉冷藏期間菌落總數(shù)的變化測(cè)定

該試驗(yàn)主要采用食品細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定的方法。過程如下。從將冷藏肉放入冰箱開始計(jì)時(shí)(以0 h計(jì))，每隔12 h(共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)至84h)取樣一次進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定。測(cè)定方法按GB/T 4789.2—2010[12]進(jìn)行并作適當(dāng)調(diào)整，本試驗(yàn)中取樣量為10 g，培養(yǎng)條件為37 ℃需氧培養(yǎng)，36 h后取出進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。根據(jù)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，繪制細(xì)菌生長曲線。

1.7抗菌肽對(duì)冷藏肉的保鮮作用觀察

根據(jù)所測(cè)得的粗提抗菌肽MIC和細(xì)菌生長曲線，結(jié)合具體的實(shí)際應(yīng)用，將粗提抗菌肽應(yīng)用于冷藏的生鮮豬肉，觀察其保鮮效果。

1.7.1 材料處理 粗提抗菌肽使用液：臨用時(shí)用0.01 %無菌乙酸溶液稀釋粗提抗菌肽至1倍MIC濃度。自制噴瓶，并設(shè)定其一次噴涂的面積。使用前以75 %酒精浸泡滅菌，然后用0.01 %無菌乙酸溶液沖洗。

將生鮮豬肉分為2組，每組10塊。用滅菌噴瓶將粗提抗菌肽使用液均勻噴涂于各肉塊表面，對(duì)照組肉樣噴灑同體積的0.01%無菌乙酸溶液。然后分別置于無菌保鮮盒中擺放均勻，用聚乙烯保鮮膜封口包好，放入(4.0±0.5)℃冰箱中冷藏。

1.7.2 菌落總數(shù)測(cè)定 按照前述方法取樣并進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定，計(jì)數(shù)后計(jì)算粗提抗菌肽的抑菌率。同時(shí)觀察并記錄試驗(yàn)組和對(duì)照組肉樣的感官變化。

抑菌率=[(對(duì)照組-試驗(yàn)組)/對(duì)照組]×100 %

2 結(jié)果與分析

2.1粗提抗菌肽的提取量

通過氯化銨裂解紅細(xì)胞、攪拌器破碎白細(xì)胞和離心除去雜質(zhì)等方法從所采集的牛血中分離提取到粗提物40ml，即粗提抗菌肽的產(chǎn)量為 0.001 3 mL·mL-1。將干粉溶于的0.01 %乙酸溶液中，經(jīng)分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定為41.395 g·L-1。

2.2粗提物的抑菌活性測(cè)定

微量瓊脂糖彌散試驗(yàn)抑菌圈直徑見表1。試驗(yàn)表明，制備的粗提牛白細(xì)胞抗菌肽對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有抑菌作用，而對(duì)大腸桿菌的抑菌作用更強(qiáng)，這與其它文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。

表1 粗提抗菌肽和抗生素的抑菌圈直徑

2.3粗提物的最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定

本試驗(yàn)用來檢測(cè)所獲抗菌肽的最小抑菌濃度，對(duì)照藥品為氨芐青霉素。表2所示為96孔微量反應(yīng)板在藥物作用下的長菌孔。

表2 氨芐青霉素和粗提抗菌肽的MICTable 2 MIC of crude extract from antimicrobial peptides and the AMP

2.4冷藏條件下肉樣中菌落總數(shù)的變化動(dòng)態(tài)

經(jīng)測(cè)定，冷藏肉在0、12、24、36、48、60、72、84 h的菌落總數(shù)變化結(jié)果如圖1所示。

圖1 生鮮豬肉冷藏期間的菌數(shù)變化動(dòng)態(tài)Fig.1 Dynamic states of colony counts in chilledraw pork during preservation

檢測(cè)結(jié)果表明，冷藏肉的細(xì)菌數(shù)目變化基本符合細(xì)菌的生長曲線規(guī)律，而同時(shí)具有自己獨(dú)有的特點(diǎn)，在形成一個(gè)鐘形生長曲線后，細(xì)菌總數(shù)又有了快速上升。

另外，從感官上看，冷藏肉在放入4 ℃冰箱72 h后開始出現(xiàn)發(fā)粘，肉色變暗，并且已略顯臭味。

2.5粗提抗菌肽對(duì)冷藏肉的保鮮效果

試驗(yàn)組和對(duì)照組冷藏肉在0、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h的菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果表3所示。

表3 不同處理肉樣在冷藏期間的菌落總數(shù)Table 3 Colony counts of treated samples during preservation

由表3可以看出，試驗(yàn)組和對(duì)照組的菌數(shù)變化總體趨勢(shì)一致，但使用1倍MIC處理的實(shí)驗(yàn)組肉樣菌落總數(shù)均明低于噴灑0.01 %乙酸溶液的對(duì)照組。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，粗提抗菌肽的抑菌率為60 %～99 %，具有顯著性差異(P<0.05)，而且在12～48 h之間抑菌效果最佳(圖2)。而從菌數(shù)隨時(shí)間的變化上來看，試驗(yàn)組在72 h時(shí)菌數(shù)才達(dá)到與對(duì)照組36 h菌數(shù)相當(dāng)?shù)乃?，這說明，粗提抗菌肽可延緩冷藏肉中的細(xì)菌增殖，由此可推測(cè)使用粗提抗菌肽能延長保質(zhì)期約36 h。

圖2 粗提抗菌肽在不同時(shí)間點(diǎn)的抑菌率Fig.2 Inhibition rate of crude AMP extracts atdifferent time points

另外，試驗(yàn)組和對(duì)照組肉樣的感官變化也明顯不同。對(duì)照組在冷藏24 h時(shí)便可聞到變質(zhì)臭味，同時(shí)出現(xiàn)肉色變暗、肉樣略發(fā)粘的現(xiàn)象，研磨后肉樣稀釋液也發(fā)黃偏暗，隨冷藏時(shí)間的延長，該類情況在緩慢加劇后趨于穩(wěn)定；而試驗(yàn)組在冷藏60 h后才逐漸出現(xiàn)類似情況。

3 小結(jié)與討論

本研究表明，粗提牛白細(xì)胞抗菌肽可以有效抑制冷藏肉中的細(xì)菌增殖，可延長冷藏肉的保存期限，具有良好的應(yīng)用前景。粗提物的抑菌活性測(cè)定和MIC測(cè)定為驗(yàn)證性試驗(yàn)，通過該試驗(yàn)確定了牛白細(xì)胞粗提抗菌肽具有良好的抗菌活性。

從本研究結(jié)果可知，生鮮肉冷藏期間菌落總數(shù)的變化和常規(guī)培養(yǎng)條件下細(xì)菌的生長曲線不一樣。冷藏肉中的菌數(shù)在形成一個(gè)鐘形生長曲線后，細(xì)菌總數(shù)又有了上升。新鮮肉品自購買、處理后在4 ℃冰箱保存，根據(jù)細(xì)菌生長規(guī)律，出現(xiàn)了圖1中0～60 h期間圖像；但肉品所含細(xì)菌種類多樣，在冷藏過程中各種嗜溫細(xì)菌逐漸死亡，隨后各種嗜冷細(xì)菌逐漸大量增殖并成為優(yōu)勢(shì)菌群，圖1中60 h后的菌數(shù)變化動(dòng)態(tài)便體現(xiàn)了這一變化。抗菌肽對(duì)冷藏肉的保鮮作用從結(jié)果來看和預(yù)期效果存在一定的差距，這或許要?dú)w因于隨著冷藏時(shí)間的延長，肉中所含嗜溫菌和冷營菌群的菌相交替現(xiàn)象。

目前市場(chǎng)上的防腐保藏劑種類繁多，但大多都對(duì)人體有一定的毒害作用。本試驗(yàn)采取在冷藏肉表層噴灑抗菌肽粗提取物的方法來延長生鮮肉的保藏時(shí)間。總體上來看，抗菌肽在1倍MIC的濃度下即對(duì)冷藏肉保鮮具有明顯的促進(jìn)作用，且抑菌效果很顯著，可有效延長肉品的保鮮期。這對(duì)于今后開發(fā)抗菌肽制品作為生物防腐劑、保鮮劑具有良好的參考價(jià)值。

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(責(zé)任編輯：蔣國良)

To explore the crude extract of frozen meat of bovine leukocyte antimicrobial peptides inhibitory effect, including the preparation of antimicrobial peptides of bovine leukocyte crude extract, crude extracts antibacterial activity of antimicrobial peptides determined the minimum inhibitory concentration (MIC) determination of the total number of colonies change during the determination of chilled fresh pork and antimicrobial peptides observations of the effect of frozen meat preservation. The results showed that bovine leukocyte antimicrobial peptides against gram-negative bacteria (E.coli) and Gram -positive bacteria ( Staphylococcus aureus ) had obvious antibacterial activity; crude extracts antimicrobial peptides on Escherichia coli and Staphylococcus aureus MIC were 0.619 μg·μL-1;the colony variation of fresh pork samples were frozen during the early phase of bacterial growth normal bell curve, with the extension of frozen time, psychrotrophic bacteria gradually adapt to start another period of growth trends. After spraying the surface of the crude extract of antimicrobial peptides within 108 h, frozen meat sensory indicators were significantly better than the control group.The total number of colonies was also significantly lower than in the control group(P<0.05),and the inhibitory rate was generally maintained at 60 % to 99%, the highest 99 %. These results indicate that the crude extract of bovine leukocyte antimicrobial peptides can inhibit the proliferation of bacteria in frozen meat, to extend shelf life, with good antibacterial effect.

leukocyte; antibacterial peptides; chilled meat; bacteriostatic effect; preservation

2015-11-20

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(122102110042)；河南省教育廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(152102310081)

朱文明(1994-),男,河南羅山人,碩士研究生,從事動(dòng)物性食品安全及肉類防腐保鮮研究。

陳麗穎(1967-)，女，河南南陽人，教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師。

1000-2340(2016)04-0512-04

S852

：A

Observationofbacteriostaticeffectonchilledmeatbyantimicrobialextractfrombovineleukocytes

ZHU Wenming1, PAN Xuhui1, GUO Zhenzhen1, WANG Yabin1,2, HU Hui1,2, CHEN Liying1,2(1.Engineering College of Animal Husbandry and Veterinary Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002，China; 2. Henan Key Laboratory for Animal-Derived Food Safety, Zhengzhou 450002,China)