吳一塵，杜　星，李平華，2，吳　艷，王鈞順，劉紅林，李齊發(fā)

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院，江蘇淮安 223005；3淮陰種豬場(chǎng)，江蘇淮安 223322）

蘇淮豬VRTN基因克隆、組織表達(dá)特征與多態(tài)性分析

吳一塵1，杜星1，李平華1，2，吳艷3，王鈞順3，劉紅林1，李齊發(fā)1

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院，江蘇淮安 223005；3淮陰種豬場(chǎng)，江蘇淮安 223322）

【目的】獲得蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)序列，了解其序列特征和組織表達(dá)特征，分析蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)的多態(tài)性?！痉椒ā恳蕴K淮豬卵巢組織cDNA為模板，采用克隆測(cè)序技術(shù)分離獲得蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)序列。利用BioEdit 7.0軟件分析其序列特征和蛋白理化性質(zhì)。利用Clustal W軟件進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析。利用UCSC基因組瀏覽器與NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行豬VRTN基因的染色體定位和基因組結(jié)構(gòu)分析。利用SMART軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能域，CPHmodels軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。隨機(jī)選取3頭成年蘇淮豬母豬，屠宰后立即采集心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、肌肉和卵巢等組織，提取組織總RNA，采用RT-PCR技術(shù)分析蘇淮豬VRTN基因的組織表達(dá)譜。采集106頭成年蘇淮豬繁殖母豬耳組織樣，提取基因組DNA，采用 PCR-凝膠電泳分析蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)的多態(tài)性?！窘Y(jié)果】蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)為2 097bp，與其它哺乳動(dòng)物如人、小鼠、牛和羊的一致性分別為84.98%、74.53%、85.84%和86.45%，而與雞的一致性只有54.42%。基因組結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)豬VRTN基因由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，定位在豬7號(hào)染色體上。蘇淮豬VRTN基因編碼蛋白含有698個(gè)氨基酸殘基，與人、小鼠、牛和羊等的一致性分別為85.55%、70.07%、86.20%和86.06%，但與雞的一致性只有51.17%，可見(jiàn)哺乳動(dòng)物VRTN基因在進(jìn)化過(guò)程中比較保守。氨基酸組分分析顯示蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列存在全部20種氨基酸，其中Leu（亮氨酸）含量最高，達(dá)到10.44%，而Asp天冬氨酸含量最低，只有1.43%。蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)蘇淮豬VRTN蛋白含有 HTH結(jié)構(gòu)域等典型結(jié)構(gòu)域，由6個(gè)α螺旋、5個(gè)β折疊以及若干無(wú)規(guī)則卷曲組成。RT-PCR分析表明VRTN基因在蘇淮豬心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、卵巢和肌肉組織等組織中均有表達(dá)，說(shuō)明VRTN基因是一個(gè)廣泛表達(dá)的基因。在蘇淮豬群體中檢測(cè)到VRTN基因ins291位點(diǎn)的3種基因型，其中僅有93bp條帶的為野生純合型（wt/wt），僅有384bp條帶的為突變純合型（Q/Q），含有384和93bp條帶的為雜合型（wt/Q）。在蘇淮豬群體中wt/wt型為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.717；wt為優(yōu)勢(shì)等位基因，基因頻率是0.816；高脊椎數(shù)等位基因Q的頻率為0.184。遺傳多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)的多態(tài)信息含量為0.331，為中度多態(tài)位點(diǎn)，雜合度為0.40，變異程度相對(duì)較低?！窘Y(jié)論】 獲得了蘇淮豬VRTN基因序列，其表達(dá)無(wú)組織特異性；蘇淮豬群體中存在高脊椎數(shù)等位基因Q。

蘇淮豬；VRTN基因；克隆；組織表達(dá)譜；多態(tài)性

0　引言

【研究意義】脊椎數(shù)是影響豬胴體長(zhǎng)和產(chǎn)肉量的重要經(jīng)濟(jì)性狀，也是一個(gè)高遺傳力性狀（遺傳力可達(dá)0.7以上）［1］。家豬的祖先野豬的胸腰椎數(shù)共有19根［2］，而西方商業(yè)豬種在長(zhǎng)期選育的過(guò)程中對(duì)體型的大小特別是體長(zhǎng)進(jìn)行了高強(qiáng)度的人工選擇，胸腰椎數(shù)可達(dá)20—23根［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)每增加一根脊椎數(shù)可使成年豬的胴體增長(zhǎng)80mm，體重可增加4—8 kg，單位產(chǎn)肉效率明顯提高［5-6］。因此，揭示豬脊椎數(shù)性狀形成的分子機(jī)制對(duì)提高豬的產(chǎn)肉性能和養(yǎng)殖效益等均具有重要的實(shí)踐意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】由于與生產(chǎn)性能關(guān)系密切，豬脊椎數(shù)性狀在生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)研究領(lǐng)域均引起了廣泛關(guān)注，科學(xué)家一直在尋找影響豬脊椎數(shù)的QTL、主效基因和遺傳標(biāo)記。2000年WADA等［7］首先利用318個(gè)遺傳標(biāo)記（主要為微衛(wèi)星）對(duì)梅山豬×哥廷根豬資源家系進(jìn)行全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)在1號(hào)和2號(hào)染色體上存在影響豬脊椎數(shù)的QTL。2003年SATO等［8］利用180個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記和梅山豬×杜洛克豬家系，發(fā)現(xiàn)7號(hào)染色體上也存在影響豬脊椎數(shù)的QTL。2011年MIKAWA等［9］將7號(hào)染色體上影響豬脊椎數(shù)的QTL進(jìn)行了精細(xì)定位，認(rèn)為精細(xì)QTL內(nèi)唯一的編碼蛋白基因VRTN（Vertebrae Development Homolog，是人類(lèi)C14orf115同源基因）是候選基因，且Q/Q型個(gè)體的脊椎數(shù)顯著高于wt/wt型。隨后多個(gè)課題組利用Illumina PorcineSNP60 Beadchip在不同的資源家系和群體中均發(fā)現(xiàn)VRTN是影響豬脊椎數(shù)的主效基因，如REN等［10］和FAN等［11］在白色杜洛克豬×二花臉豬家系，F(xiàn)AN等［11］在二花臉豬×通城豬家系、蘇太豬群體和杜長(zhǎng)大三元雜交豬群體，DUIJVESTEIJN等［12］在大白豬群體。歐陽(yáng)子璇［13］在白色杜洛克豬×二花臉豬家系中發(fā)現(xiàn)VRTN基因ins291和NV027 C＞A等2個(gè)位點(diǎn)符合因果突變的條件，其中ins291位點(diǎn)為291 bp的大片段插入突變（PRE1元件），為因果突變的可能性更大。FAN等［11］進(jìn)一步證實(shí)ins291突變可能就是影響豬脊椎數(shù)的致因突變?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)，在國(guó)內(nèi)豬新品種（品系）培育過(guò)程中脊椎數(shù)的選育正逐漸引起關(guān)注［13］。蘇淮豬是2011年國(guó)家審定的新品種，是以新淮豬為母本，與大白豬雜交培育而成的。但目前關(guān)于蘇淮豬脊椎數(shù)的研究還未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】擬以蘇淮豬為研究對(duì)象，以VRTN為候選基因，克隆蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)全序列，了解其序列特征和組織表達(dá)特征，分析蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)的多態(tài)性，以期為揭示蘇淮豬脊椎數(shù)性狀形成機(jī)制和蘇淮豬選育提高提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2014年12月至2015年10月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物

在淮陰種豬場(chǎng)隨機(jī)選取3頭成年蘇淮豬，屠宰后立即采集心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、肌肉和卵巢等組織，置于液氮中凍藏，用于提取組織總RNA。隨機(jī)選取健康無(wú)病、體況良好的成年蘇淮豬繁殖母豬106頭，采集耳組織樣，置于裝有75%酒精的離心管中，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，用于提取基因組DNA。

1.3DNA和RNA提取

采用常規(guī)的酚/氯仿法提取蘇淮豬耳基因組DNA。采用TRlzol Reagent（Invitrogen公司）提取蘇淮豬各組織總RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒（Takara公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體方法詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃冰箱中保存。

1.4RT-PCR反應(yīng)與克隆測(cè)序

根據(jù)豬VRTN基因序列（NM_001195113.1），利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物（P1和P2），擴(kuò)增蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)序列，引物序列見(jiàn)表1。RT-PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性30s；98℃ 5 s、退火30 s、72℃ 1.5 min 35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用Gel Purification Kit凝膠回收試劑盒（Omega公司）進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。純化產(chǎn)物克隆入pMD19-T vector（TaKaRa公司），并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中；采用質(zhì)粒提取試劑盒（Axygen公司）提取質(zhì)粒，送由蘇州金唯智公司進(jìn)行測(cè)序。

表1　PCR引物及反應(yīng)條件Table 1　Primers and conditions of PCR

1.5序列分析

采用DNAMAN、BioEdit 7.0等生物信息學(xué)軟件對(duì)蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)序列進(jìn)行拼接、氨基酸序列預(yù)測(cè)和蛋白性質(zhì)分析。用Clustal W（http://www.ebi. ac.uk）進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析。利用UCSC基因組瀏覽器（http://genome.ucsc. edu/cgi-bin/hgBlat）與NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ mapview/）進(jìn)行豬VRTN基因的染色體定位和基因組結(jié)構(gòu)分析。利用SMART軟件（http://smart.emblheidelberg.de）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能域，CPHmodels軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。哺乳動(dòng)物VRTN基因序列均從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載，包括人（NM_018228.2）、倭黑猩猩（XM_003824163）、小鼠（NM_001168588.1）、大鼠（XM_003750199.3）、綿羊（XM_012111602.1）、牛（NM_001206630.1）和雞（XM_421265.4）。

1.6蘇淮豬VRTN基因組織表達(dá)譜分析

以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)豬VRTN基因（NM_001195113.1）和GAPDH基因mRNA序列（NM_001206359.1）設(shè)計(jì)引物P3、P4（表1），以蘇淮豬各組織cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果并拍照記錄。

1.7蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)的多態(tài)性分析

根據(jù)文獻(xiàn)［11］中報(bào)道的影響豬脊椎數(shù)性狀的VRTN基因的g.20311_20312 ins291位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物P5（表1），以蘇淮豬基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，根據(jù)條帶大小對(duì)蘇淮豬不同個(gè)體VRTN基因ins291位點(diǎn)進(jìn)行分型。多態(tài)信息含量和雜合度等的計(jì)算方法見(jiàn)文獻(xiàn)［14］。

2　結(jié)果

2.1蘇淮豬VRTN基因PCR擴(kuò)增

以蘇淮豬肌肉組織cDNA為模板，利用引物P1與P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到特異性良好且與目的片段大小一致的擴(kuò)增片段（圖1）。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為1 328和898 bp，與引物設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)期長(zhǎng)度一致。

2.2蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)序列分析

圖1　蘇淮豬VRTN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig. 1　Agarose gel photograph of VRTN gene in Suhuai pig

圖2　蘇淮豬VRTN基因核苷酸序列與預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig. 2　Nucleotide and amino acid sequence of VRTN gene in Suhuai pig

通過(guò)克隆測(cè)序和序列拼接獲得了蘇淮豬VRTN基因完整的編碼區(qū)序列，序列長(zhǎng)度為2 097 bp（圖2）。采用BioEdit 7.0軟件對(duì)蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)核苷酸序列的堿基組成進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CG含量（64.27%）明顯高于AT含量（35.73%）。BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)核苷酸序列與引物源序列（NM_001195113.1）的一致性為99.95%。蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)核苷酸序列與其它哺乳動(dòng)物如人、倭黑猩猩、小鼠、大鼠、牛和羊的一致性分別為84.98%、85.12%、74.53%、73.68%、85.84%和86.45%，而與雞的一致性只有54.42%。哺乳動(dòng)物相近物種間VRTN基因編碼區(qū)核苷酸序列的一致性更高，如人和倭黑猩猩（99.38%）、牛和羊（96.48%）。電子染色體定位發(fā)現(xiàn)VRTN基因定位在豬7號(hào)染色體上，介于AbcD4基因（XM_013989158.1）與SYNDIG1L基因（XM_013989161.1）之間?；蚪M結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)豬VRTN基因由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。

2.3蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列分析

圖3　蘇淮豬 VRTN基因氨基酸序列與其他哺乳動(dòng)物的同源性比較Fig. 3　Identical alignments of VRTN amino acid sequence in Suhuai pig with other mammals

蘇淮豬VRTN基因編碼蛋白含有698個(gè)氨基酸殘基（圖3）。氨基酸組分分析顯示蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列存在全部20種氨基酸，其中Leu（亮氨酸）含量最高，達(dá)到10.44%，而Asp天冬氨酸含量最低，只有1.43%。氨基酸殘基中酸性氨基酸（Asn、Asp、Gln、Glu）有98個(gè)，堿性氨基酸（Arg、His、Lys）有89個(gè)；正電荷殘基（Asp、Glu）有52個(gè)，負(fù)電荷殘基（Arg、Lys）有75個(gè)。同源性分析發(fā)現(xiàn)蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列與人、倭黑猩猩、小鼠、大鼠、牛和羊等的一致性分別為85.55%、84.80%、70.07%、70.33%、86.20%和86.06%，但與雞的一致性只有51.17%。同樣地，哺乳動(dòng)物相近物種間VRTN蛋白氨基酸序列一致性更高，如人和倭黑猩猩（99.00%）、牛和羊（96.71%）。

圖4　蘇淮豬VRTN蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 4　Space structure prediction analysis of VRTN protein in Suhuai pig

2.4蘇淮豬VRTN基因編碼蛋白特征分析

蘇淮豬VRTN蛋白的分子量為77.8467kD，理論等電點(diǎn)pI為 9.37，體外半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)63.41，疏水性均值（GRAVY）為-0.274。ProtScale和BioEdit軟件分析發(fā)現(xiàn)在蘇淮豬VRTN蛋白270—320、400—450、550—600氨基酸之間有3個(gè)較強(qiáng)的親水性區(qū)域，說(shuō)明蘇淮豬VRTN蛋白具有較強(qiáng)的親水性。NCBI與SMART在線(xiàn)軟件對(duì)VRTN蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果并未在蘇淮豬VRTN蛋白上發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，但發(fā)現(xiàn)蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列存在2個(gè)低復(fù)雜區(qū)域（LCR）（5Glu—20Glu；247Glu—275Ser）和2個(gè)內(nèi)部重復(fù)序列（RPT）（291Val—436Arg；530Ser—687Ala），另外檢測(cè)到一個(gè)HTH結(jié)構(gòu)域（276Gln—306Glu）（圖3）。利用CPHmodels在線(xiàn)工具進(jìn)行蘇淮豬VRTN蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出VRTN蛋白包含6個(gè)α螺旋、5個(gè)β折疊以及若干無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。

圖5　蘇淮豬VRTN基因組織表達(dá)譜Fig. 5　Normal expression profile of VRTN gene in Suhuai pig

2.5蘇淮豬中VRTN基因組織表達(dá)譜分析

以蘇淮豬各個(gè)組織cDNA為模板，利用引物P3與P4進(jìn)行RT-PCR分析，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖5?？梢钥闯?，在蘇淮豬心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、卵巢和肌肉等組織中均檢測(cè)到VRTN基因的表達(dá)，說(shuō)明VRTN基因是一個(gè)廣泛表達(dá)的基因。

2.6蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)多態(tài)性分析

圖6　蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)基因分型Fig. 6　The genotype patterns of the VRTN ins 291 mutation in Suhuai pig individuals

在蘇淮豬群體中檢測(cè)到VRTN基因ins291位點(diǎn)的3種基因型（圖6），其中僅有93bp條帶的為野生純合型（wt/wt），僅有384 bp條帶的為突變純合型（Q/Q），含有384和93 bp條帶的為雜合型（wt/Q）。蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)的基因型頻率、基因頻率分析結(jié)果見(jiàn)表2。在蘇淮豬群體中wt/wt型為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.717；wt為優(yōu)勢(shì)等位基因，基因頻率是0.816。另外，遺傳多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)的多態(tài)信息含量為0.331，為中度多態(tài)位點(diǎn)，雜合度為0.40，變異程度相對(duì)較低。

表2　蘇淮豬和其它豬種VRTN基因ins291位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率Table 2　Polymorphism of VRTN ins291 in Suhuai pig and other pig breeds

3　討論

研究表明在豬基因組上存在著大量的QTL，而在這些QTL內(nèi)一些候選基因的多態(tài)性與豬性狀之間存在著潛在的聯(lián)系，例如IGF2基因內(nèi)含子3上g.3072G＞A位點(diǎn)多態(tài)性與豬肌肉生長(zhǎng)高度關(guān)聯(lián)［15］，MC4R基因上 p.D298N（c.892G＞A）位點(diǎn)錯(cuò)義突變導(dǎo)致豬采食量和日增重都顯著減少［16］，VRTN基因ins291突變是影響豬脊椎數(shù)的致因突變［11］，PPARD基因G32E 位點(diǎn)多態(tài)性與豬耳朵面積顯著關(guān)聯(lián)［17］，PHKG1基因g.8283C＞A突變引起豬肌糖原含量升高和肉質(zhì)下降［18］，等等。VRTN基因位于豬7號(hào)染色體上，介于控制脂肪分解和乳頭數(shù)性狀的數(shù)量性狀基因座之間［9，12］。豬VRTN基因全長(zhǎng)9 570 bp，有2個(gè)外顯子，其中一個(gè)是編碼蛋白［19］。本文通過(guò)克隆測(cè)序獲得了蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)蘇淮豬核甘酸（氨基酸）序列與其它哺乳動(dòng)物比較的一致性均高于73%（70%），明顯低于豬某些基因和哺乳動(dòng)物其它物種的同源性，如Smad4基因（高于86%和98%）［20］、ECE基因（高于87%和96%）［21］、Rb1基因（高于89%和91%）［22］和MSRB3基因（高于84%和88%）［23］，而與豬NR5A2基因［24］相近，說(shuō)明哺乳動(dòng)物VRTN基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守，這與前人研究發(fā)現(xiàn)VRTN基因位于突變位點(diǎn)較為常見(jiàn)的區(qū)域是一致的［9，12］。蘇淮豬VRTN蛋白特征預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)VRTN蛋白不具備跨膜功能，包含2個(gè)LCR和2個(gè)RPT區(qū)域，以及1個(gè)HTH結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)HTH結(jié)構(gòu)域包含螺旋-反轉(zhuǎn)-螺旋基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，為一個(gè)序列特異性結(jié)構(gòu)單元，常見(jiàn)于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子蛋白，用以識(shí)別靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列［25］，提示VRTN蛋白可能具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄的功能，但目前尚未見(jiàn)到相關(guān)研究報(bào)道。

VRTN基因是影響豬脊椎數(shù)性狀的主效基因，于2011年首先在大白豬群體中被鑒定［9］。VRTN基因多態(tài)性被認(rèn)為是影響豬脊椎數(shù)變異的主要因素，MIKAWA等［9］在豬VRTN基因中檢測(cè)到9個(gè)突變位點(diǎn)，其中單倍型Q比單倍型wt的脊椎數(shù)多1.02根，且這些突變影響VRTN基因在胚胎發(fā)育早期的轉(zhuǎn)錄，其中單倍型Q型高于單倍型wt。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，NV123位點(diǎn)中Q等位基因是插入了一個(gè)291bp的PRE1元件（一種豬SINE元件）形成的，而SINE元件可以作為增強(qiáng)子元件調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)［9，26］。歐陽(yáng)子璇［13］利用白色杜洛克豬×二花臉豬家系研究認(rèn)為NV123ins291位點(diǎn)可能是影響豬脊椎數(shù)性狀的因果突變位點(diǎn)（QTN），隨后FAN等［11］進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)。本研究以ins291位點(diǎn)為對(duì)象，分析了蘇淮豬群體VRTN基因ins291位點(diǎn)的多態(tài)性，結(jié)果在蘇淮豬群體中發(fā)現(xiàn)了高脊椎數(shù)等位基因的存在，Q等位基因的頻率為0.18，明顯低于另一個(gè)等位基因wt的頻率（0.82）。研究發(fā)現(xiàn)在西方豬商業(yè)化豬種中VRTN基因ins291位點(diǎn)Q等位基因頻率均較高，例如杜洛克豬、長(zhǎng)白豬、大白豬和皮特蘭豬中Q等位基因頻率分別高達(dá)0.54、0.71、0.66和0.50（表2），這與西方豬種脊椎數(shù)較多和體長(zhǎng)較長(zhǎng)是一致的［1，11］。國(guó)內(nèi)地方豬種中一般檢測(cè)不到Q等位基因或其頻率較低，如梅山豬、金華豬等Q等位基因頻率均為0［11］。中外豬種脊椎數(shù)和VRTN基因ins291位點(diǎn)Q等位基因頻率的差異，是因?yàn)槲鞣截i種在近、現(xiàn)代選育過(guò)程中注重對(duì)豬體長(zhǎng)的選育，高強(qiáng)度地選育了具有較多脊椎數(shù)的品種，從而人為的提高了西方豬種Q等位基因頻率［27］。在蘇淮豬群體中檢測(cè)到VRTN基因ins291位點(diǎn)Q等位基因，可能與蘇淮豬血統(tǒng)有關(guān)，即在蘇淮豬的培育過(guò)程中引入了西方豬種大白豬的血統(tǒng)［28］。

4　結(jié)論

本研究分離了蘇淮豬脊椎數(shù)主效基因VRTN基因編碼區(qū)全序列，了解了其基因特征和蛋白性質(zhì)。RT-PCR發(fā)現(xiàn)VRTN基因在蘇淮豬各種組織中廣泛表達(dá)。在蘇淮豬群體中鑒定出VRTN 基因ins291位點(diǎn)高脊椎數(shù)等位基因Q的存在，為蘇淮豬胴體長(zhǎng)和產(chǎn)肉性狀的進(jìn)一步選育提高提供了理論基礎(chǔ)和分子標(biāo)記。

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（責(zé)任編輯林鑒非）

Sequence Cloning， Tissue Expression Profile and Polymorphism of VRTN Gene in Suhuai Pig

WU Yi-chen1， DU Xing1， LI Ping-hua1，2， WU Yan3， WANG Jun-shun3， LIU Hong-lin1， LI Qi-fa1
（1College of Animal Science and Technology， Nanjing Agriculture University， Nanjing 210095；2Huaian Academy of Nanjing Agricultural University， Huaian 223005， Jiangsu；3Huaiyin Pig Breeding Farm， Huaian 223322， Jiangsu）

【Objective】The aim of this study is to obtain the coding region sequence of Suhuai VRTN gene， identify its characteristics and expression patterns， analyze the polymorphism of VRTN ins291 in Suhuai pig population. 【Method】The codingsequence of Suhuai pig VRTN gene was isolated by cloning and sequencing. The BioEdit 7.0 software was used to analyze the molecular characteristics and physicochemical properties of Suhuai pig VRTN. Nucleotide and amino acid sequences alignment was performed using Clustal W. Genomic organization and chromosomal locations were investigated by comparing the cDNA and corresponding genomic sequence （UCSC server and NCBI database）. Motif analysis was performed using the online programs SMART， and protein tertiary structure was predicted by CPHmodels server. Tissue samples of heart， liver， spleen， lung， kidney，hypothalamus， ovary and skeleton muscle were obtained from adult female Suhuai pigs （n=3）. Total RNA was extracted using a Trizol kit， and the expression patterns of VRTN gene of Suhuai pig were analyzed by RT-PCR. The ear samples were obtained from adult female Suhuai pigs （n=106）， and genomic DNA was extracted by a conventional phenol-chloroform extraction method. PCR-Gel electrophoresis was performed to analyze the polymorphism of VRTN ins291. 【Result】The full length of the coding sequences of Suhuai pig VRTN gene is 2097 bp， which shared similarities of 84.98%， 74.53%， 85.84% and 86.45% to human， mouse，cattle and sheep， respectively， but only 54.42% to chicken. Genomic structure analysis showed that pig VRTN gene includes 2 exons and 1 intron， and is located on chromosome 7. The Suhuai pig VRTN gene encodes 698 amino acid residues， which shared similarities of 85.55%， 70.07%， 86.20% and 86.06% to human， mouse， cattle and sheep， respectively， but only 51.17% to chicken，indicated that VRTN is conserved in the evolution process of mammalian. Protein structure analysis found that VRTN protein of Suhuai pig contains several typical domains including HTH domain， and comprised 6 α-helices， 5 β-sheets and many random coils. Real-time PCR analysis revealed that the VRTN gene is expressed in heart， liver， spleen， lung， kidney， hypothalamus， ovary and skeleton muscle of Suhuai pig， suggesting that VRTN is widely expressed in various tissues of pig. Genotyping ins291 of VRTN gene in 106 Suhuai pigswas done， and three genotypes were detected. In Suhuai pigs， the frequencies of wt/wt， wt/Q and Q/Q genotypes were 0.717， 0.198 and 0.085. The frequencies of high vertebrate number of Q allele was 0.184. The polymorphic information content of VRTN ins291 in Suhuai pigs was 0.331. The heterozygosity of VRTN ins291 in Suhuai pigs was 0.40.【Conclusion】 The coding region of VRTN gene was isolated， and its expression showed no tissue-specificity. The presence of high number of vertebrate Q allele in Suhuai pig population was confirmed.

Suhuai pig； VRTN gene； cloning； tissue expression profile； polymorphism

2015-12-26；接受日期：2016-07-08

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2015BAD03B01）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（SCX（12）2097）、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)SRT計(jì)劃（1515A08）

聯(lián)系方式：吳一塵，E-mail：wuyichen@njau.edu.cn。杜星，E-mail：2014205003@njau.edu.cn。吳一塵和杜星為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者李齊發(fā)，E-mail：liqifa@njau.edu.cn