陳　琳，周光宏，徐幸蓮，張萬(wàn)剛

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院/肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095）

高氧氣調(diào)包裝對(duì)宰后豬肉蛋白質(zhì)氧化、鈣蛋白酶活性及蛋白質(zhì)降解的影響

陳琳，周光宏，徐幸蓮，張萬(wàn)剛

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院/肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095）

【目的】研究高氧氣調(diào)包裝（HiOx，80% O2/20% CO2）對(duì)宰后豬肉蛋白質(zhì)氧化、鈣蛋白酶活性及蛋白質(zhì)降解的影響，探討高氧氣調(diào)包裝影響豬肉品質(zhì)的內(nèi)在機(jī)制。【方法】選取12條冷卻（4℃）24 h后的杜洛克×長(zhǎng)白×約克夏三元雜交豬背最長(zhǎng)肌，分別進(jìn)行高氧氣調(diào)包裝和真空包裝（VP），4℃冷庫(kù)貯藏，分別在1、4、6 d測(cè)定羰基含量及分布、巰基含量、肌節(jié)變化、鈣蛋白酶活性、肌聯(lián)蛋白及肌鈣蛋白-T降解變化?！窘Y(jié)果】高氧氣調(diào)包裝組羰基含量高于真空包裝組且貯藏第4和6天差異顯著（P＜0.05）。貯藏第1和4天，高氧氣調(diào)包裝組肌細(xì)胞外圍出現(xiàn)羰基氧化熒光信號(hào)，熒光以靠近細(xì)胞膜處密度更高，并且逐漸向細(xì)胞內(nèi)部擴(kuò)散；貯藏第6天，高氧氣調(diào)包裝組細(xì)胞膜呈高亮熒光圈，胞內(nèi)熒光增強(qiáng)，而真空包裝組熒光信號(hào)較弱。貯藏第6天，高氧氣調(diào)包裝組巰基含量顯著低于真空包裝組（P＜0.05）。真空包裝組宰后肌節(jié)M線弱化、A帶模糊、肌原纖維Z線斷裂；高氧氣調(diào)包裝組肌節(jié)結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。高氧氣調(diào)包裝組在貯藏第1天鈣蛋白酶活性顯著低于真空包裝組（P＜0.05）；高氧氣調(diào)包裝抑制了肌聯(lián)蛋白和肌鈣蛋白-T的降解，且在貯藏第4和6天差異顯著（P＜0.05）?！窘Y(jié)論】高氧氣調(diào)包裝能夠顯著提高宰后豬肉蛋白質(zhì)氧化程度，抑制鈣蛋白酶活性發(fā)揮及其底物蛋白質(zhì)的降解。

豬肉；高氧氣調(diào)包裝；真空包裝；蛋白質(zhì)氧化；鈣蛋白酶活性；蛋白質(zhì)降解

0　引言

【研究意義】隨著人們生活節(jié)奏的加快，包裝銷售因其高度便捷性受到越來(lái)越多消費(fèi)者的歡迎。高氧氣調(diào)包裝、真空包裝以及透氧包裝是目前肉制品行業(yè)3大主要包裝方式。高氧氣調(diào)包裝常以80%O2和20%CO2相混合的方式對(duì)肉品進(jìn)行包裝，一方面高濃度氧氣的存在可以使冷卻肉呈現(xiàn)亮紅色，更能刺激消費(fèi)者的購(gòu)買欲；另一方面，二氧化碳能夠抑制微生物生長(zhǎng)而延長(zhǎng)商品貨架期［1-2］。然而高氧氣調(diào)包裝的富氧環(huán)境不可避免會(huì)帶來(lái)蛋白質(zhì)氧化的問(wèn)題［3］，加強(qiáng)此方面的研究，對(duì)探討高氧氣調(diào)包裝影響豬肉品質(zhì)的內(nèi)在機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前期研究表明氧化會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)羰基化，一些必需氨基酸如精氨酸、蘇氨酸、賴氨酸結(jié)構(gòu)上會(huì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的氧化修飾，使得蛋白質(zhì)功能喪失［4-5］?，F(xiàn)已證實(shí)［6-7］，蛋白質(zhì)氧化能夠?qū)е码逆溂肮δ芑鶊F(tuán)結(jié)構(gòu)改變、蛋白酶活性喪失、影響蛋白水解敏感性，以及促進(jìn)分子間交聯(lián)、聚集產(chǎn)生。動(dòng)物宰后肌肉成熟過(guò)程會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的生理生化變化。其中，肌原纖維蛋白以及一些肌肉骨架蛋白的降解，對(duì)維持肌原纖維結(jié)構(gòu)完整性十分重要。蛋白水解會(huì)破壞肌原纖維結(jié)構(gòu)的完整性，改變肌細(xì)胞的有序結(jié)構(gòu)，影響肌細(xì)胞間收縮與傳導(dǎo)過(guò)程，從而影響肌細(xì)胞內(nèi)水分含量、分布以及肉質(zhì)嫩化［8-9］。而這些蛋白被認(rèn)為是鈣蛋白酶所降解的底物蛋白［10］。宰后早期鈣蛋白酶活性的變化被認(rèn)為是調(diào)控肉品質(zhì)改善的關(guān)鍵原因之一［10-11］。然而，鈣蛋白酶的活性位點(diǎn)上存在組氨酸以及含有巰基的半胱氨酸殘基，這些是極易被氧化的基團(tuán)，從而使鈣蛋白酶因氧化而喪失活性［12］。ROWE等［13］對(duì)牛肉進(jìn)行輻照氧化處理，證實(shí)了蛋白質(zhì)氧化可通過(guò)抑制鈣蛋白酶活性來(lái)降低宰后成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)降解程度，輻照氧化組嫩度顯著低于未輻照組，且肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T降解產(chǎn)物更少，鈣激活酶的自溶程度較低。然而，蛋白質(zhì)氧化調(diào)控宰后肉品品質(zhì)的具體機(jī)制尚不清楚?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，在肉的成熟過(guò)程中，肌原纖維蛋白和與其降解相關(guān)的關(guān)鍵酶被氧化后，底物蛋白的結(jié)構(gòu)、降解情況變化以及關(guān)鍵酶的活性變化尚未被闡明，有關(guān)高氧氣調(diào)包裝下蛋白質(zhì)氧化影響豬肉鈣蛋白酶活性、底物蛋白質(zhì)降解等尚無(wú)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)以高氧氣調(diào)包裝和真空包裝的杜洛克×長(zhǎng)白×約克夏三元雜交豬背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，從蛋白質(zhì)氧化、鈣蛋白酶活性及蛋白質(zhì)降解3方面揭示高氧氣調(diào)包裝影響宰后豬肉成熟品質(zhì)的內(nèi)在機(jī)制，為指導(dǎo)高氧氣調(diào)包裝方式的生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

試驗(yàn)于2015年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院進(jìn)行。

1.1材料與試劑

試驗(yàn)以杜洛克×長(zhǎng)白×約克夏三元雜交商品豬背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象。采樣6頭6月齡、活體重為（100±5）kg健康商品豬，于江蘇淮安蘇食屠宰場(chǎng)宰殺。在4℃冷庫(kù)排酸24 h，取左右背最長(zhǎng)肌共12條。

聚丙烯熱成型托盤、封口膜和真空包裝袋，快衛(wèi)爾（中國(guó)）有限公司；DNPH（2，4-二硝基苯肼，2，4-dinitrophenylhydrazine）和DTNB（5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸，5，5'-Dithiobis-2-nitrobenzoic acid），上海阿拉丁試劑有限公司；鹽酸胍（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；TCA（三氯乙酸，trichloroacetic acid），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；CY3-羊抗兔IgG（BA1032）、山羊及兔血清，武漢博士得公司；DNPH抗體（D9556）和肌鈣蛋白-T抗體（T6277），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（ab6789），英國(guó)Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（NCI4106）和BCA試劑盒（23250），美國(guó)Thermo公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液（161-0732）和聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移液（161-0734），美國(guó)Bio-Rad公司；蛋白預(yù)制凝膠（W002-6），南京建成化學(xué)試劑公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Smart 500氣調(diào)包裝機(jī)，西班牙Ulma包裝公司；真空包裝機(jī)，美國(guó)快衛(wèi)爾包裝公司；H-7650透射電子顯微鏡，日本日立公司；LSM 700 META激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)蔡司公司；CM1950超薄冷凍切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；PowerPac 1000垂直電泳儀和Mini-protein Tetra Cell電泳設(shè)備，美國(guó)Bio-Rad公司；ImageQuant LAS 4000分子成像系統(tǒng)和Imagescanner凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)GE公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Spectral Max M2e酶標(biāo)儀，美國(guó)MDC公司；Ultra Turrax T25 BASIS高速勻漿機(jī)，德國(guó)IKA公司；Avanti J-E落地式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；TW20水浴鍋，德國(guó)Julabo公司；低溫冰柜，日本Hitachi公司。

1.3方法

1.3.1樣品包裝剔除背最長(zhǎng)肌表面筋膜、脂肪及結(jié)締組織，均分為3塊，修剪成厚約2.5 cm、重400 g左右的肉塊，肉樣隨機(jī)分為兩組分別進(jìn)行高氧氣調(diào)包裝和真空包裝。高氧氣調(diào)包裝：首先將樣品放入聚丙烯熱成型托盤（6 cm×23 cm×13 cm）中，采用填充比例為80% O2/20% CO2、充氣壓力為105 kPa的混合氣體，于140℃封口（標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下封口膜透氧率＜1 cm3·m-2·d-1）完成高氧氣調(diào)包裝。真空包裝：采用聚丙烯材質(zhì)的真空包裝袋，標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下透氧率＜30 cm3·m-2·d-1，真空包裝機(jī)抽真空至氣壓＜1 kPa，抽空30 s，100℃熱封5 s。兩種包裝的肉樣在4℃冷庫(kù)中貯藏，在第1、4、6天取樣進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的制備肌原纖維蛋白提取參考XIONG［14］并稍作修改。將包裝成熟1、4、6天肉樣取出，稱取1 g剔除脂肪及筋膜的樣品，加入5倍體積的肌原纖維蛋白提取液（10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液、100 mmol·L-1氯化鈉、2 mmol·L-1氯化鎂、1 mmol·L-1EGTA，pH 7.0）。4℃勻漿30 s，10 s間隔一次，轉(zhuǎn)速為15 000 r/min。勻漿液以1 000×g轉(zhuǎn)速離心10 min，取沉淀。以上步驟重復(fù)3次。離心后沉淀中加入5倍體積的100 mmol·L-1氯化鈉洗脫液。15 000 r/min轉(zhuǎn)速勻漿30 s，10 s間隔一次。勻漿液以1 000×g轉(zhuǎn)速離心10 min，取沉淀，以上步驟重復(fù)3次。離心后所得沉淀即為肌原纖維蛋白。肌原纖維蛋白與電泳上樣緩沖液（125 mmol·L-1Tris-base、4% SDS、20%甘油、0.5% β-巰基乙醇、0.1%溴酚藍(lán)，pH 6.8）充分混合，BCA試劑盒法測(cè)定肌原纖維蛋白濃度后統(tǒng)一蛋白質(zhì)濃度為7 mg·mL-1。蛋白質(zhì)溶液按體積比1∶1與電泳上樣緩沖液混合，50℃水浴20 min。分裝樣品，-80℃存放用于蛋白電泳檢測(cè)。

肌漿蛋白的提取參考VEISETH等［15］的方法并稍作修改。將包裝后成熟1 d的肉樣取出，稱取1 g剔除筋膜和脂肪的肉樣，加入3倍體積4℃預(yù)冷的活性蛋白提取液（100 mmol·L-1Tris-base、0.1% β-巰基乙醇、10 mmol·L-1EDTA，pH 8.3），15 000 r/min勻漿2次，每次15 s，5 s間隔一次。勻漿液以轉(zhuǎn)速15 000 ×g，4℃離心30 min，所得上清通過(guò)濾紙過(guò)濾后，BCA試劑盒法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。去離子水調(diào)節(jié)統(tǒng)一蛋白質(zhì)濃度為8 mg·mL-1，按蛋白體積∶活性電泳上樣緩沖液（150 mmol·L-1Tris-base、20%甘油、0.75% β-巰基乙醇、0.02%溴酚藍(lán)，pH 6.8）=1∶1進(jìn)行稀釋?；旌虾髽悠愤M(jìn)行分裝，-80℃冷凍用于鈣蛋白酶活性檢測(cè)。

1.3.3羰基含量測(cè)定參考ZHANG等［7］的方法并稍作修改。稱取0.5 g剔除脂肪及筋膜的肉樣，加入5 mL焦磷酸鹽緩沖液勻漿3次，每次10 s，轉(zhuǎn)速最高為15 000 r/min。取0.5 mL勻漿液置于2個(gè)2 mL離心管中，加入0.5 mL 20%三氯乙酸（TCA），振蕩混勻后以12 000×g離心5 min。除去上清液，沉淀加入0.5 mL 10% TCA振蕩混勻后再次離心，離心條件同上。對(duì)照組將離心后沉淀加0.5 mL 2 mol·L-1HCl，試驗(yàn)組加0.5 mL 10 mmol·L-12，4-二硝基苯肼（DNPH）。暗處理30 min，每隔10 min迅速取出混勻10 s。待DNPH與羰基充分反應(yīng)，對(duì)照組與試驗(yàn)組加入0.5 mL 20% TCA，振蕩混勻后相同條件離心。沉淀用10 mmol·L-1HCl（溶解于1∶1（vol/vol）乙醇/乙酸乙酯）重復(fù)洗脫3次。所得沉淀加入1 mL 6 mol·L-1鹽酸胍（溶解在20 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液，pH 2.3），4℃震蕩過(guò)夜。未溶解物12 000×g離心5 min，上清液在紫外370 nm處測(cè)定吸光度。消光系數(shù)為22 000 L·mol-1·cm-1，羰基含量用每毫克蛋白里含有羰基的納摩爾數(shù)表示。

1.3.4羰基肌細(xì)胞內(nèi)分布測(cè)定采用免疫熒光法，參考ASTRUC等［16］的方法并做一定修改。將包裝后成熟1、4、6 d的肉樣取出，隨機(jī)選取肉樣區(qū)域沿著平行于肌原纖維方向?qū)⒓∪馇谐扇鈼l并立即浸泡于液氮中30 s，每個(gè)肉樣取6個(gè)平行。冰凍超薄切片機(jī)切取10 μm厚切片，37℃烘干2 h后與0.04% DNPH（溶解在20 mmol·L-1磷酸鹽和0.1 mol·L-1氯化鈉的混合液中，pH 6.0）暗處反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后樣品用含0.1%吐溫的PBS（pH 6.75）重復(fù)沖洗（5 min，6次）。37℃兔血清一次封閉切片1 h。去除封閉液，滴加1∶100稀釋DNPH多克隆抗體孵育，4℃反應(yīng)過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后，切片樣品用含0.1%吐溫的PBS（pH 6.75）重復(fù)沖洗（5 min，6次），37℃山羊血清二次封閉1 h。去除封閉液，滴加CY3標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白溶液（1∶50）避光孵育1 h，PBS漂洗（5 min，6次）。采用激光共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長(zhǎng)555 nm、發(fā)射波長(zhǎng)570 nm下，將樣品放大200倍，統(tǒng)一曝光時(shí)間下觀察羰基在肌細(xì)胞內(nèi)分布。

1.3.5巰基含量測(cè)定巰基測(cè)定參考ELLMAN［17］的方法，并稍作修改。0.5 mL肌原纖維蛋白溶液（4 mg·mL-1）加入4.5 mL緩沖液（50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液、10 mmol·L-1EDTA、0.6 mol·L-1氯化鉀，pH 7.0），與0.5 mL 10 mmol·L-15、5-二硫代-2-硝基苯甲酸（0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液配置，pH 8.0）混合均勻?；旌弦涸?0℃水浴中反應(yīng)25 min，412 nm處測(cè)定吸光度值。摩爾吸光系數(shù)為136 000 L·mol-1·cm-1，活性巰基含量用每毫克蛋白里含有巰基的納摩爾數(shù)表示。

1.3.6電鏡觀察肌節(jié)變化參考徐舶等［18］方法，將成熟1、4、6 d的樣品沿著肌原纖維方向切成約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉條，肉條浸泡在2.5%戊二醛中（20 mmol·L-1磷酸緩沖液溶解，pH 7.2）初步固定7 d，每隔一天更新戊二醛固定液。樣品用2%餓酸二次固定，固定完成后經(jīng)磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，梯度乙醇脫水，100%丙酮置換，最后采用Spurr樹(shù)脂浸透包埋。超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，日立H-7650透射顯微鏡將樣本放大3 000倍觀察肌節(jié)變化。

1.3.7鈣蛋白酶活性測(cè)定參考酪蛋白酶原法［19］，采用4%的濃縮膠（丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=75∶1， 125 mmol·L-1Tris-base（pH 6.8），0.05%過(guò)硫酸銨，0.05%四甲基乙二胺）和12.5%的分離膠（丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=75∶1，375 mmol·L-1Tris-base（pH 8.8），2.1 mmol·L-1酪蛋白，0.05%過(guò)硫酸銨，0.05% 四甲基乙二胺）。緩慢加入4℃預(yù)冷的電泳緩沖液（25 mmol·L-1Tris-base，192 mmol·L-1甘氨酸，1 mmol·L-1EDTA，0.05% β-巰基乙醇），接通電源100 V，預(yù)跑15 min后上樣。蛋白樣品在100 V、4℃環(huán)境電泳6 h至電泳結(jié)束。活性電泳反應(yīng)液（50 mmol·L-1Tris-base、 5 mmol·L-1氯化鈣、0.1% β-巰基乙醇，pH 7.8）室溫孵育膠體前1 h，每20 min更換活性電泳反應(yīng)液。繼續(xù)孵育16 h后膠體進(jìn)行染色和脫色，凝膠成像儀拍照。鈣蛋白酶活性條帶采用Quanity one分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3.8肌聯(lián)蛋白和肌鈣蛋白-T降解測(cè)定肌聯(lián)蛋白采用5%的連續(xù)聚丙烯酰胺連續(xù)電泳（丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=100∶1，1.5 mol·L-1Tris-base（pH 8.0），0.1% SDS，0.05%過(guò)硫酸銨，0.05%四甲基乙二胺）。每塊膠體恒流4.5 mA電泳20 h至電泳結(jié)束［20］。肌聯(lián)蛋白膠體采用改進(jìn)型考馬斯亮藍(lán)染色和脫色［21］。肌鈣蛋白-T的聚丙烯酰胺變性凝膠電泳采用濃縮膠濃度4%、分離膠濃度10%的蛋白預(yù)制膠。恒壓80 V電泳30 min后，調(diào)整電壓為120 V至溴酚藍(lán)標(biāo)記跑至膠體底部，電泳結(jié)束［22］。取出肌鈣蛋白-T的膠體通過(guò)濕法轉(zhuǎn)印技術(shù)將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上［23］。轉(zhuǎn)印條件為恒壓70 V，轉(zhuǎn)印70 min。轉(zhuǎn)印完成后將聚偏氟乙烯膜正面放入含有5%牛血清白蛋白的TBST（20 mmol·L-1Tris-base，137 mmol·L-1氯化鈉，5 mmol·L-1氯化鉀，0.05%吐溫20）溶解液中，室溫封閉2 h。肌鈣蛋白-T抗體（1∶500）4℃繼續(xù)孵育16 h。TBST反復(fù)漂洗（5 min，6次）后將聚偏氟乙烯膜置于HRP標(biāo)記二抗（1∶500）中，室溫反應(yīng)2 h。TBST反復(fù)漂洗（5 min，6次），膜表面滴加化學(xué)顯色劑ECL，暗箱反應(yīng)6 min后終止反應(yīng)，凝膠成像儀掃描并拍照。蛋白免疫印記條帶采用Quanity one分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.4數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，并通過(guò)Duncan's法比較處理組間差異，差異顯著性水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD，n=6）表示。

2　結(jié)果

2.1高氧氣調(diào)包裝對(duì)豬肉羰基含量及肌細(xì)胞內(nèi)分布的影響

圖1結(jié)果顯示，貯藏第1天處理組間羰基含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），貯藏第4天和第6天，高氧氣調(diào)包裝組羰基含量顯著高于真空包裝組（P＜0.05）。

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖2，其中陰性對(duì)照組肌細(xì)胞形態(tài)比較規(guī)則，胞膜完整，細(xì)胞飽滿，細(xì)胞間隙致密，無(wú)熒光著色。圖示紅色熒光信號(hào)部分即特異性結(jié)合的氧化羰基。高氧氣調(diào)包裝組和真空包裝組熒光信號(hào)在貯藏期間均呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。宰后貯藏第1天，高氧氣調(diào)包裝組視野下部分肌細(xì)胞外周近胞膜處出現(xiàn)氧化熒光信號(hào)，熒光分布不均勻。宰后貯藏第4天，高氧氣調(diào)包裝組熒光多分布于細(xì)胞膜邊緣，以細(xì)胞靠膜處密度更高，逐漸向胞內(nèi)擴(kuò)散呈暗紅色。真空包裝組熒光分布于細(xì)胞膜包圍的很小區(qū)域，熒光信號(hào)較弱。宰后貯藏第6天，高氧氣調(diào)包裝組肌細(xì)胞外周呈高亮熒光圈，細(xì)胞內(nèi)部熒光信號(hào)增強(qiáng)。肌細(xì)胞間熒光信號(hào)分布基本均勻。此外，相對(duì)于高氧氣調(diào)包裝組，真空包裝組熒光信號(hào)較弱，分布多集中在細(xì)胞膜周圍，且肌細(xì)胞變形嚴(yán)重，肌細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)脫水、皺縮，骨架結(jié)構(gòu)坍塌，細(xì)胞間裂隙變大。

圖1　高氧氣調(diào)包裝對(duì)宰后貯藏期間豬肉羰基含量的影響Fig. 1　Effects of HiOx on carbonyl content of pork during postmortem refrigerated storage

圖2　高氧氣調(diào)包裝和真空包裝豬肉肌細(xì)胞內(nèi)羰基分布的免疫熒光顯微圖Fig. 2　Fluorescence microscopic images showing protein carbonyl distribution from pork longissimus dorsi muscle in HiOx and VP during postmortem refrigerated storage

2.2高氧氣調(diào)包裝對(duì)豬肉活性巰基含量的影響

由圖3可知，宰后貯藏期間高氧氣調(diào)包裝組的活性巰基含量均低于真空包裝組。在貯藏第6天，高氧氣調(diào)包裝組活性巰基含量與真空包裝組差異顯著（P＜0.05）。

圖3　高氧氣調(diào)包裝對(duì)宰后豬肉活性巰基含量的影響Fig. 3　Effects of HiOx on free sulfhydryl content of pork during postmortem refrigerated storage

2.3高氧氣調(diào)包裝對(duì)豬肉肌節(jié)的影響

由圖4可知，高氧氣調(diào)包裝和真空包裝組肌原纖維超微結(jié)構(gòu)在宰后貯藏期間均發(fā)生顯著變化。宰后貯藏第1天，高氧氣調(diào)包裝組和真空包裝組A帶和I帶清晰可辨，Z線和M線均保持完整，肌原纖維之間連接緊密，處理組間無(wú)明顯差異。宰后貯藏第4天，相對(duì)于高氧氣調(diào)包裝組，真空包裝組Z線附近發(fā)生較為明顯斷裂，Z線周圍的細(xì)絲與Z線的連接開(kāi)始弱化，M線也出現(xiàn)弱化。宰后貯藏第6天，真空包裝相對(duì)于高氧氣調(diào)包裝，大量肌節(jié)出現(xiàn)Z線的裂解，肌節(jié)分裂成細(xì)絲狀，A帶模糊，M線基本消失，肌節(jié)結(jié)構(gòu)遭到破壞。肌節(jié)形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，高氧氣調(diào)包裝抑制了宰后豬肉成熟過(guò)程。

圖4　高氧氣調(diào)包裝和真空包裝宰后豬肉肌節(jié)變化的透射電鏡圖Fig. 4　Transmission electron micrographs showing sarcomere changes of pork longissimus dorsi muscle in HiOx and VP during postmortem refrigerated storage

2.4高氧氣調(diào)包裝對(duì)豬肉鈣蛋白酶活性的影響

從圖5和表1可知，高氧氣調(diào)包裝組在宰后貯藏第1天μ-鈣蛋白酶條帶相對(duì)光密度值顯著高于真空包裝組（P＜0.05），即相對(duì)于真空包裝組，高氧氣調(diào)包裝組μ-鈣蛋白酶活性顯著低于真空包裝組（P＜0.05），高氧氣調(diào)包裝組豬肉在宰后早期μ-鈣蛋白酶活力的發(fā)揮受到抑制。

2.5高氧氣調(diào)包裝對(duì)豬肉蛋白質(zhì)降解的影響

2.5.1高氧氣調(diào)包裝對(duì)豬肉肌聯(lián)蛋白降解的影響由圖6和表2可知，在宰后貯藏1 d，高氧氣調(diào)包裝組和真空包裝組降解條帶含量沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。在宰后貯藏第4和6天，真空包裝組肌聯(lián)蛋白降解條帶含量顯著低于高氧氣調(diào)包裝組（P＜0.05），即高氧氣調(diào)包裝組抑制了宰后豬肉肌聯(lián)蛋白的降解。

圖5　高氧氣調(diào)包裝對(duì)貯藏1天豬肉鈣蛋白酶活性的影響Fig. 5　Effects of HiOx on calpain activity at 1 d of postmortem refrigerated storage

表1　高氧氣調(diào)包裝和真空包裝豬肉宰后貯藏第1天鈣蛋白酶活性Table 1　μ-Calpain activity of pork in HiOx and VP at 1 d of postmortem refrigerated storage

圖6　高氧氣調(diào)包裝對(duì)豬肉肌聯(lián)蛋白降解的影響Fig. 6　Effects of HiOx on degradation of titin at 1， 4 and 6 d of postmortem refrigerated storage

表2　高氧氣調(diào)包裝和真空包裝豬肉肌聯(lián)蛋白蛋白質(zhì)降解的變化Table 2　Changes of degraded titin of pork in HiOx and VP

2.5.2高氧氣調(diào)包裝對(duì)豬肉肌鈣蛋白-T降解的影響由圖7和表3可知，在貯藏第4天和第6天，高氧氣調(diào)包裝組中肌鈣蛋白-T 30 kDa降解產(chǎn)物含量顯著低于真空包裝組（P＜0.05），而貯藏第1天，高氧氣調(diào)包裝對(duì)肌鈣蛋白-T 30 kDa的降解產(chǎn)物含量并無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

圖7　高氧氣調(diào)包裝對(duì)宰后豬肉貯藏期間肌鈣蛋白-T降解的影響Fig. 7　Effects of HiOx on degradation of troponin-T at 1， 4 and 6 d of postmortem refrigerated storage

表3　高氧氣調(diào)包裝和真空包裝豬肉肌鈣蛋白-T的降解變化Table 3　Changes of degraded troponin-T of pork in HiOx and VP

3　討論

蛋白質(zhì)氧化指由氧分壓產(chǎn)生的活性氧（ROS）與蛋白質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致蛋白共價(jià)修飾［24］。肌肉蛋白質(zhì)在ROS作用下，某些特定氧基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，使得蛋白質(zhì)與氧化物親和力加強(qiáng)，易于產(chǎn)生水解、交聯(lián)、聚合，從而損害肌細(xì)胞功能［25］。蛋白質(zhì)氧化損傷反應(yīng)涉及蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生，羰基生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。STADTMAN［26］認(rèn)為羰基生成是由活性氧攻擊氨基酸自由氨基或亞氨基，經(jīng)反應(yīng)最終生成NH3和相應(yīng)羰基衍生物。另外，ROS所致蛋白質(zhì)肽鏈斷裂，在斷裂處也可產(chǎn)生羰基。ZAKTYS-WALIWANDER等［22］發(fā)現(xiàn)高氧氣調(diào)包裝的牛肉在4℃貯藏8 d和14 d的羰基含量均顯著高于真空包裝組，同時(shí)蛋白質(zhì)氧化能夠抑制牛肉的嫩化。DELLES等［27］同樣發(fā)現(xiàn)高氧氣調(diào)包裝相對(duì)于真空包裝和透氧包裝，顯著增加了豬肉蛋白質(zhì)羰基含量，且證實(shí)了蛋白質(zhì)氧化是解釋宰后豬肉較差持水力的原因之一。這與本研究結(jié)果一致，由羰基含量反映的肽鏈、氨基酸結(jié)構(gòu)和功能的改變、蛋白質(zhì)氧化程度增加提示了影響宰后成熟肉品質(zhì)的可能原因。ASTRUC等［16］認(rèn)為，相對(duì)于通過(guò)羰基含量評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)氧化程度，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察羰基在肌細(xì)胞內(nèi)的熒光分布，更能清楚地了解肌細(xì)胞氧化通路的動(dòng)態(tài)變化。本試驗(yàn)中，高氧氣調(diào)包裝組比真空包裝組較先出現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化，且氧化熒光信號(hào)集中于肌細(xì)胞膜邊緣，逐漸向細(xì)胞內(nèi)部擴(kuò)散，肌細(xì)胞間熒光信號(hào)分布相對(duì)均勻。ASTRUC［16］試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)宰后動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)氧化起始于細(xì)胞膜；這主要因?yàn)榧?xì)胞膜是磷脂雙分子層，其富含的多不飽和脂肪酸（可保持細(xì)胞膜的相對(duì)流動(dòng)性以保證細(xì)胞正常生理功能）極易被氧化，膜上蛋白質(zhì)又因接近磷脂雙分子層，由脂肪氧化形成的羥自由基能夠奪取蛋白質(zhì)分子的氫離子，使得細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)開(kāi)始了與脂肪氧化類似的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)［28］。ROS從肌細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)部傳遞的過(guò)程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白逐漸氧化。

巰基是蛋白質(zhì)殘基中最具有反應(yīng)活性的基團(tuán)，極易被氧化為二硫鍵、次磺酸、亞磺酸及磺酸，或被一氧化氮亞硝基化。LUND等［6］通過(guò)對(duì)肌球蛋白的重鏈進(jìn)行一維電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)分子間通過(guò)二硫鍵交聯(lián)、聚集，是巰基含量降低的主要原因之一。此外，目前已鑒定了一大批易受氧化還原調(diào)控的蛋白質(zhì)，其活性部位均含有巰基基團(tuán)，通過(guò)對(duì)巰基的修飾可以顯著改變細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［29-30］。HUFF-LONERGAN等［8］報(bào)道，鈣蛋白酶通過(guò)降解對(duì)細(xì)胞有序性和完整性十分重要的肌原纖維蛋白和細(xì)胞骨架蛋白從而調(diào)控牛肉嫩度和豬肉的保水性。然而鈣蛋白酶活性區(qū)域的巰基極易被氧化形成二硫鍵，導(dǎo)致鈣激活酶失活，底物肌原纖維蛋白降解受到抑制，肌肉細(xì)胞的有序性和完整性遭到破壞。因此，蛋白質(zhì)巰基完全可以作為影響細(xì)胞內(nèi)氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的更直接、更相關(guān)的“探針”。本研究發(fā)現(xiàn)，由活性巰基含量降低反映的高氧氣調(diào)包裝下氧化程度增加，與羰基的結(jié)果相一致。

在宰后成熟過(guò)程中，蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)主要包括肌原纖維蛋白和相關(guān)酶系統(tǒng)氧化，這些氧化都是通過(guò)改變肌原纖維的降解從而影響肉品品質(zhì)。其中，鈣蛋白酶能夠調(diào)控肌原纖維蛋白以及一些肌肉骨架蛋白的降解，例如肌聯(lián)蛋白、伴肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白-T、整聯(lián)蛋白、肌間線蛋白等［31］。目前普遍認(rèn)為肉類在宰后成熟過(guò)程中成熟品質(zhì)的改善主要?dú)w功于這些蛋白質(zhì)的降解。有關(guān)鈣蛋白酶系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，氧化能改變?cè)缀髣?dòng)物體內(nèi)的離子水平，使得鈣蛋白酶活性改變，從而導(dǎo)致底物降解情況發(fā)生改變［10］。此外，鈣蛋白酶活性的發(fā)揮必須保證其活性區(qū)域還原性。LAMETSCH等［12］發(fā)現(xiàn)μ-鈣蛋白酶半胱氨酸活性區(qū)域?qū)ρ趸h(huán)境十分敏感，鈣激活酶肽段殘基92—114間存在二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋，其可伸展性縮短Cys 108與Cys 115空間距離，從而為活性區(qū)域Cys 108和Cys 115之間形成二硫鍵提供可能，導(dǎo)致鈣蛋白酶活性喪失。本研究表明，由羰基含量及分布、巰基含量、肌節(jié)變化反映的蛋白質(zhì)氧化增加，鈣蛋白酶活性區(qū)域極易受到氧化攻擊，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，從而抑制了鈣蛋白酶功能活性發(fā)揮。

μ-鈣蛋白酶活力可以預(yù)測(cè)宰后成熟過(guò)程中肌原纖維蛋白以及肌肉骨架蛋白的降解［9，11，31］。不論是μ-鈣蛋白酶被氧化還是其底物蛋白被氧化，均會(huì)對(duì)肉類宰后成熟品質(zhì)產(chǎn)生影響。肌聯(lián)蛋白（titin）是肌細(xì)胞骨架蛋白中含量最多且分子量最大的蛋白，位于M線和Z線之間，其C末端與M線相接，N末端是Z線的組成部分，幾乎橫跨了半個(gè)肌節(jié)［20，32］。titin將粗絲維持在肌節(jié)的中央，具有保持粗絲穩(wěn)定、調(diào)節(jié)粗絲收縮、保持肌節(jié)及肌細(xì)胞完整性等功能。肌鈣蛋白-T（troponin-T）是肌鈣蛋白和原肌球蛋白相結(jié)合亞基，對(duì)鈣離子具有較高的敏感性，它能與原肌球蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)橫紋肌的收縮。肌肉宰后成熟過(guò)程中，troponin-T由分子量35 kDa產(chǎn)生28—30 kDa的特征降解產(chǎn)物。目前，troponin-T的降解特征產(chǎn)物已作為預(yù)測(cè)肉品成熟品質(zhì)的重要指標(biāo)之一［33］。FU等［34］報(bào)道，高氧氣調(diào)包裝的宰后成熟第4—7天，牛肉的μ-鈣蛋白酶活性顯著低于真空包裝和透氧包裝組，且troponin-T的降解受到抑制。本試驗(yàn)也證實(shí)高氧氣調(diào)包裝能夠通過(guò)抑制宰后豬肉早期μ-鈣蛋白酶活性的發(fā)揮，對(duì)troponin-T和titin在宰后貯藏第4天和第6天的降解具有顯著抑制作用。肌原纖維蛋白降解弱化一定程度上也解釋了高氧氣調(diào)包裝下宰后肌節(jié)超微形態(tài)的改變。肌節(jié)是組成肌原纖維的基本單位，高氧氣調(diào)包裝能夠抑制豬肉肌原纖維蛋白及細(xì)胞骨架蛋白的降解，體現(xiàn)在連接Z線和M線的titin降解產(chǎn)物變少，構(gòu)成骨骼肌完整細(xì)絲的troponin-T降解弱化，進(jìn)而抑制Z線附近斷裂，維持Z線周圍細(xì)絲與Z線間的連接，阻礙肌原纖維經(jīng)宰后成熟過(guò)程中的小片化，保持肌節(jié)結(jié)構(gòu)的相對(duì)完整性。

4　結(jié)論

高氧氣調(diào)包裝能夠增加宰后豬肉羰基含量，擴(kuò)大羰基在肌細(xì)胞內(nèi)分布，降低活性巰基含量，加劇宰后豬肉蛋白質(zhì)氧化。同時(shí)高氧氣調(diào)包裝具有抑制早期μ-鈣蛋白酶活性發(fā)揮，抑制肌聯(lián)蛋白和肌鈣蛋白-T等關(guān)鍵肌原纖維蛋白的降解，阻礙宰后豬肉肌節(jié)成熟的作用。

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（責(zé)任編輯趙伶俐）

Effects of High Oxygen Modified Atmosphere Packaging on Protein Oxidation， Calpain Activity and Protein Proteolysis of Pork During Postmortem Refrigerated Storage

CHEN Lin， ZHOU Guang-hong， XU Xing-lian， ZHANG Wan-gang
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Meat Processing and Food Control，Ministry of Education/Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition， Nanjing 210095）

【Objective】 The objective of this study was to investigate the effect of high oxygen modified atmosphere packaging（HiOx， 80% O2/20% CO2）on protein oxidation， calpain activity and protein proteolysis of pork during refrigerated storage. This could help explaining the mechanism of regulation behind HiOx in pork quality. 【Method】 Twelve Longissimus dorsi muscles of Duroc × Landrace × Yorkshire crossbred pork were precooled at 4℃ for 24 h， and then randomly assigned to either HiOx or vacuum packaging （VP） and stored for 1， 4 and 6 d at 4℃. The carbonyl content and distribution， sulfhydryl content， sarcomere changes，calpain activity， titin and troponin-T degradation were determined， respectively. 【Result】 Carbonyl content of samples from HiOx was significantly higher than the samples from VP at 4 and 6 d of storage （P＜0.05）. HiOx samples showed fluorescence signal in the peripheral area of cell membrane and then the fluorescence signal spread to the internal cellular environment at 1 and 4 d of postmortem refrigerated storage. At 6 d of postmortem refrigerated storage， samples under HiOx presented a strong fluorescencelight， with a glaring fluorescence intensity more pronounced in a peripheral area corresponding to the cell membrane and to a region in close contact with the cell membrane， while VP samples presented weaker fluorescence signal. Sulfhydryl content of HiOx samples was significantly lower compared with VP samples at 6 d of postmortem storage （P＜0.05）. Samples from VP showed weakening M line， blurry A band as well as broken Z line during postmortem refrigerated storage， whereas samples under HiOx remained less affected. μ-Calpain activity was less in samples from HiOx compared with that from VP at 1 d of storage （P＜0.05）. Titin and troponin-T showed less proteolysis in samples from HiOx than that from VP at 4 and 6 d of postmortem refrigerated storage（P＜0.05）. 【Conclusion】 Increased protein oxidation under HiOx could inhibit μ-calpain activity and protein proteolysis of pork during postmortem refrigerated storage.

pork； high oxygen modified atmosphere packaging； vacuum packaging； protein oxidation； calpain activity； protein proteolysis

2016-01-25；接受日期：2016-04-07

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAD28B03）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31271899）

聯(lián)系方式：陳琳，E-mail：njauchenlin@163.com。通信作者張萬(wàn)剛，E-mail：wangang.zhang@njau.edu.cn