敖雁　王安　崔小芬

摘要：研究水稻地方品種基因多樣性可為優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的保護(hù)和選育新的品種提供理論依據(jù)。以太湖地區(qū)511份水稻地方品種為供試材料，選用19個(gè)與淀粉合成相關(guān)的基因內(nèi)分子標(biāo)記對(duì)其淀粉品質(zhì)基因進(jìn)行檢測(cè)，并與86份育成品種作比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：地方品種粳稻的平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.172 6，稍高于育成品種粳稻的平均PIC值0.110 1?；诟鞑牧祥g的Nei氏遺傳距離，按照UPGMA方法進(jìn)行聚類(lèi)，所有研究材料被分為6個(gè)類(lèi)群。第Ⅰ類(lèi)群主要是秈稻，育成品種粳稻主要集中在第Ⅱ類(lèi)群和第Ⅲ類(lèi)群的上半段，地方品種粳稻主要集中在第Ⅲ類(lèi)群下半段、第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ類(lèi)群，二者分布在不同的區(qū)域，已出現(xiàn)遺傳分化。分別依據(jù)國(guó)家優(yōu)質(zhì)米的標(biāo)準(zhǔn)，有眾多太湖地區(qū)水稻地方品種屬于品質(zhì)性狀比較優(yōu)良的優(yōu)質(zhì)稻谷，這些品種可用于今后的品質(zhì)育種。

關(guān)鍵詞：太湖稻區(qū)；基因內(nèi)分子標(biāo)記；淀粉合成相關(guān)基因；多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)： S511.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0098-06

我國(guó)水稻選育品種的遺傳基礎(chǔ)狹窄問(wèn)題已經(jīng)比較嚴(yán)重，育成品種遺傳多樣性逐漸降低，育成親本之間遺傳差異非常接近[1-5]。大量推廣遺傳基礎(chǔ)狹窄的品種，會(huì)對(duì)作物生產(chǎn)帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)。隨著育種水平的不斷提高，農(nóng)作物品種推廣的單一化趨勢(shì)日益明顯，造成大量基因的遺失和遺傳多樣性的降低[6-8]。金偉棟等利用60對(duì)SSR引物研究了太湖地區(qū)目前推廣品種的遺傳差異，品種間平均相似系數(shù)達(dá)0.902，其中武運(yùn)粳7號(hào)和武運(yùn)粳8號(hào)都無(wú)法分辨[9]。太湖流域早在 8 000年前就已開(kāi)始稻作生產(chǎn)[10]，主要栽培粳稻。長(zhǎng)期的自然演化和人工選擇，形成該地區(qū)類(lèi)型豐富的稻種資源[11-12]，它們?cè)诒硇?、抗（耐）特性及品質(zhì)等方面各具特色，但是迄今在育種上利用的僅限于黃殼早廿日、矮寧黃和老虎稻等幾個(gè)地方品種，絕大部分資源的利用潛力沒(méi)有得到挖掘。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已定位了一些與淀粉形成或與稻米品質(zhì)形成有關(guān)的基因，這些基因主要包括顆粒淀粉合成酶基因（Wx）、分支酶基因（Sbe1、Sbe3）、可溶性淀粉合成酶基因（Sss1）、異淀粉酶基因（Isa）和極限糊精酶或R酶基因（Pull）等。吳洪愷等利用Wx基因?qū)VA譜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)RVA的8個(gè)特征值的表現(xiàn)均起主要作用，對(duì)支鏈淀粉合成相關(guān)基因Sbe1、Sss1均表現(xiàn)明顯的上位效應(yīng)[13]。嚴(yán)長(zhǎng)杰等以53個(gè)秈粳品種和近年育成的高產(chǎn)水稻品種為材料，設(shè)計(jì)Wx、Sbe1、Sbe3基因的分子標(biāo)記，分析3個(gè)基因位點(diǎn)的遺傳學(xué)效應(yīng)。3個(gè)基因位點(diǎn)不同的等位基因?qū)Φ久椎矸鄣暮铣删哂胁煌倪z傳效應(yīng)，其中Wx基因的影響最重要[14]。陳峰等利用Wx、Sbe1、Sbe3標(biāo)記分析3個(gè)基因?qū)Φ久桌砘焚|(zhì)和RVA譜特征的效應(yīng)，不同基因型品種間淀粉的理化特性（AC、GC、RVA）存在顯著或極顯著差異，而3個(gè)基因的聯(lián)合效應(yīng)在不同基因型組合間也存在顯著的差異[15]。

金偉棟等利用微衛(wèi)星標(biāo)記（simple sequence repeat，SSR），對(duì)129個(gè)太湖流域粳稻地方品種資源核心種質(zhì)進(jìn)行了DNA分子水平的多態(tài)性分析，結(jié)果表明，太湖流域粳稻地方品種種質(zhì)不僅具有豐富的遺傳變異，同時(shí)保留了大量的稀有等位變異[9]。于萍等采用45對(duì)SSR引物對(duì)224份太湖流域粳稻地方品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，得出太湖流域粳稻地方品種SSR多樣性較低、稀有類(lèi)型等位基因較多的結(jié)論[16]。羅兵等利用SSR引物對(duì)太湖地區(qū)的42份粳稻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，42份粳稻品種間的遺傳相似系數(shù)平均為0.610 0，供試材料相似度高，每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的PIC值平均為0.496 6[17]。Debjani等利用36對(duì)SNP標(biāo)記12條水稻染色體，對(duì)印度東北部地區(qū)的6 984份水稻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)多態(tài)信息含量（PIC）的變幅為0.004～0.375，基因多樣性的變幅為0.006～0.500[18]。Mehrzad等利用地方品種、純系品種、育成品種和適應(yīng)于Giulan省氣候環(huán)境的外國(guó)品種為供試材料，采用分布在12對(duì)染色體上的52個(gè)引物來(lái)檢測(cè)94份水稻基因型的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)最高的和最低的PIC值分別為0892和0.423[19]。然而這些研究工作，所選的分子標(biāo)記都是隨機(jī)的，與性狀的表現(xiàn)或相應(yīng)的基因沒(méi)有發(fā)生聯(lián)系。因此，本研究選用與水稻品質(zhì)關(guān)系密切的淀粉合成基因的內(nèi)部標(biāo)記，檢測(cè)太湖流域水稻地方品種的標(biāo)記基因型，并結(jié)合品質(zhì)性狀的表型，進(jìn)行遺傳多樣性分析和評(píng)價(jià)。其次，基于各材料間的Nei氏遺傳距離，按照UPGMA方法對(duì)511份水稻材料和86份水稻育成品種進(jìn)行聚類(lèi)，揭示太湖流域水稻地方品種資源的品質(zhì)基因的遺傳差異。研究結(jié)果可為保護(hù)稻種基因資源的多樣性，充分利用優(yōu)質(zhì)基因，培育品質(zhì)更為優(yōu)良的水稻品種提供參考。

1 材料與方法

在江蘇省蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院種植511個(gè)太湖地區(qū)水稻地方品種，其中粳稻423個(gè)、糯稻15個(gè)、粳糯39個(gè)、秈稻29個(gè)、秈糯5個(gè)以及86個(gè)來(lái)源廣泛的育成品種（來(lái)自日本、美國(guó)和中國(guó)各地）。其中有個(gè)別品種名字相同但來(lái)源或者材料本身有差異，所以仍以相同的名字表示，但在相同的名字后面加了1，2……，以示區(qū)分。在幼苗期進(jìn)行了取樣和DNA提取，并在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行基因內(nèi)部標(biāo)記（表1）的檢測(cè)，這些標(biāo)記位點(diǎn)共與19個(gè)淀粉合成基因有關(guān)。秋季，將這些材料分批收獲，開(kāi)展表觀直鏈淀粉含量、膠稠度和糊化溫度等品質(zhì)性狀的測(cè)定工作[20-21]。

1.1 標(biāo)記基因型的檢測(cè)

采用SDS方法提取DNA，再利用各標(biāo)記相應(yīng)的引物在各樣本內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果是CAPS分子標(biāo)記，還需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行相應(yīng)的酶切。PCR產(chǎn)物或酶切后產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠或6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離不同大小的DNA片段。電泳條件選擇的依據(jù)是多態(tài)性條帶的差異大小，如大于50 bp，則選用瓊脂糖凝膠，電泳后EB染色顯帶；小于 10 bp，則選用聚丙烯酰胺凝膠。電泳結(jié)束后用銀染方法來(lái)顯示DNA條帶，結(jié)果用ScanMaker 3830掃描儀（Microtek，上海，中國(guó)）掃描。

1.2 統(tǒng)計(jì)分析

每1對(duì)引物檢測(cè)1個(gè)位點(diǎn)，每1條多態(tài)性帶為1個(gè)等位基因，對(duì)所有供試材料的等位基因進(jìn)行記錄。應(yīng)用PowerMarker 3.25統(tǒng)計(jì)軟件[22]進(jìn)行一般統(tǒng)計(jì)量分析，獲得等位變異數(shù)目、主效等位變異頻率、基因多樣性以及多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）[23]等參數(shù)值。進(jìn)一步計(jì)算得到個(gè)體以及亞群間的Nei氏遺傳距離矩陣，通過(guò) UPGMA（unweighted pair group method with average）算法進(jìn)行遺傳聚類(lèi)分析，并使用MEGA 4.0觀察聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 與淀粉合成相關(guān)基因多樣性分析

對(duì)地方品種粳稻和育成品種粳稻進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果（表2）表明，地方品種粳稻的基因多樣性平均為0.198 8，變幅為0.009 4～0.652 0，多態(tài)信息含量平均為0.172 6，變幅為0.009 4～0.588 7，其中（CT）n基因位點(diǎn)的多態(tài)性最高，Pull基因位點(diǎn)的多態(tài)性最低；而育成品種粳稻基因的多樣性平均為0.128 2，變幅為0.000 0～0.511 6，多態(tài)信息含量平均為0.110 1，變幅為0.000 0～0.392 9，其中SSSⅢ-2基因位點(diǎn)的多態(tài)性最高，Wx、AATT、SSSⅥ-2基因位點(diǎn)的多態(tài)性最低。通過(guò)綜合比較，地方品種粳稻比育成品種粳稻有較高的基因多樣性和多態(tài)信息含量。

2.2 基于遺傳距離聚類(lèi)

基于各材料間的Nei氏遺傳距離，按照UPGMA方法對(duì)511份水稻材料和86份水稻育成品種同時(shí)進(jìn)行聚類(lèi)分析，整個(gè)群體可以被分為6類(lèi)（圖1）。從聚類(lèi)圖來(lái)看，育成品種粳稻主要集中在第Ⅱ類(lèi)群和第Ⅲ類(lèi)群右上半段，地方品種粳稻主要集中在第Ⅲ類(lèi)群下半段、第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ類(lèi)群，二者位于不同的區(qū)域，已發(fā)生明顯的遺傳分化。第Ⅰ類(lèi)群主要是秈稻地方品種。從聚類(lèi)圖中也發(fā)現(xiàn)，少數(shù)育成品種仍然夾雜在地方品種中，在等位基因組合上表現(xiàn)一致。如在樹(shù)形圖中，育成品種揚(yáng)稻6號(hào)、水晶3號(hào)與地方品種水晶白稻、西石黃等在遺傳距離上靠近；同樣，育成品種武粳15與地方品種麻金糯、落霜青、田雞青等在遺傳距離上靠近。相反，少數(shù)地方品種也夾雜在育成品種中。如在樹(shù)形圖中，地方品種蘆粳青、蘇粳5號(hào)與育成品種淮稻11號(hào)、南粳44在遺傳距離上靠近。這些結(jié)果表明，太湖地區(qū)的水稻種質(zhì)資源中，少數(shù)地方品種與少數(shù)育成品種的相似系數(shù)較大，遺傳差異較小，而大多地方品種資源與育成品種相似系數(shù)較小，位于不同的分支或群，遺傳差異大。

2.3 品質(zhì)性狀的分類(lèi)

表3、表4和表5是根據(jù)優(yōu)質(zhì)稻谷的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[24]對(duì)地方品種進(jìn)行的等級(jí)劃分，對(duì)膠稠度性狀，秈稻谷≥70 mm、粳稻谷≥80 mm、秈糯稻谷≥100 mm、粳糯稻谷≥100 mm為一級(jí)，從表4可以看出：從秈稻谷在膠稠度水平達(dá)到一級(jí)的有5個(gè)地方品種（桂圓黃、無(wú)錫稻等），占太湖地區(qū)地方品種總數(shù)的0.978%；粳稻谷達(dá)到一級(jí)的有109個(gè)地方品種（上海青、蘇州青等），占地方品種總數(shù)的21.33%；粳糯稻谷達(dá)到一級(jí)的有21個(gè)地方品種（五石糯、葡萄糯等），占地方品種總數(shù)的 4.11%；秈糯稻谷達(dá)到一級(jí)的只有麻金糯1個(gè)地方品種。

依據(jù)直鏈淀粉含量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，秈稻谷干基含量在17%～22%、粳稻谷干基含量在15%～18%、秈糯稻谷干基含量≤2.0%、粳糯稻谷干基含量≤2.0%為一級(jí)。表4中秈稻谷在直鏈淀粉水平達(dá)到一級(jí)的有18個(gè)地方品種（大稻頭、晚秈等），占太湖地區(qū)地方品種總數(shù)的3.52%；粳稻谷達(dá)到一級(jí)的有156個(gè)地方品種（太湖青、上海青等），占地方品種總數(shù)的 30.53%；粳糯稻谷達(dá)到一級(jí)的有10個(gè)地方品種，占地方品種總數(shù)的1.96%。

依據(jù)糊化溫度（堿消值）的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[25]，秈稻谷>4、粳稻谷>6、糯稻谷>6為一級(jí)。表3中秈稻谷在糊化溫度水平達(dá)到一級(jí)的有6個(gè)地方品種（八十日早、晚杜子秈等），占太湖地區(qū)地方品種總數(shù)的1.17%；粳稻谷達(dá)到一級(jí)的有137個(gè)地方品種（抱芯太湖青、矮腳太湖青等），占太湖地區(qū)地方品種總數(shù)的26.81%；糯稻谷一級(jí)的有3個(gè)地方品種[雪里青糯稻、慣殺糯（煞）、勿糯稻]，占太湖地區(qū)地方品種總數(shù)的 0.59%。綜上所述，太湖地區(qū)水稻地方品種中絕大多數(shù)粳稻谷在膠稠度、糊化溫度或直鏈淀粉含量水平上能達(dá)到一級(jí)水平。

3 討論

針對(duì)水稻群體的遺傳多樣性研究較多，然而這些研究工作所選的分子標(biāo)記都是隨機(jī)的，與性狀的表現(xiàn)或相應(yīng)的基因沒(méi)有發(fā)生聯(lián)系。鑒于此，本研究選用與水稻品質(zhì)關(guān)系密切的淀粉合成基因的內(nèi)部標(biāo)記，檢測(cè)太湖流域水稻地方品種的標(biāo)記基因型，并結(jié)合品質(zhì)性狀的表型，進(jìn)行遺傳多樣性分析和評(píng)價(jià)。選擇內(nèi)部標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)，一是標(biāo)記即代表基因；二是標(biāo)記可與性狀對(duì)應(yīng)，增加研究結(jié)果的實(shí)用性。

遺傳多樣性的研究對(duì)于作物新品種的選育具有重要意義，提高品種的遺傳多樣性能夠提高品種對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性[26-27]。太湖流域水稻地方品種基因多樣性雖然在6個(gè)基因位點(diǎn)上（AGPsma、AGPiso、Pull、SSSⅢ-2、SSSⅡ-3、Sbe3）略低于育成品種，但地方品種的平均基因多樣性和PIC值均略高于育成品種。其中育成品種是選擇了來(lái)源廣泛的一些品種，比如美國(guó)稻、日本稻還有一些國(guó)內(nèi)從南到北的一些品種，而地方品種均是太湖流域的水稻品種。從聚類(lèi)分析的結(jié)果看，整個(gè)群體可以被分為6類(lèi)，其中第Ⅰ類(lèi)群為目前生產(chǎn)上常用的秈稻地方品種，育成品種粳稻和地方品種粳稻分別集中在不同的區(qū)域，已經(jīng)出現(xiàn)了遺傳分化。因此，有必要研究和利用地方品種群體中豐富的品質(zhì)基因多樣性，以拓寬未來(lái)選育優(yōu)質(zhì)水稻新品種的遺傳基礎(chǔ)。

本研究所選材料是從近千份太湖地區(qū)的地方品種中根據(jù)品質(zhì)性狀的差異選擇的。這些地方品種在直鏈淀粉含量、糊化溫度和膠稠度等性狀上，有67個(gè)品種在一個(gè)性狀上達(dá)到一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；95個(gè)品種在2個(gè)性狀上達(dá)到了一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，有4個(gè)品種在3個(gè)性狀上都達(dá)到了一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。盡管這些老的地方品種資源植株較高、易倒伏，但在淀粉品質(zhì)性狀上仍然具有很好的表現(xiàn)，這些品種可用于今后拓寬淀粉合成基因的遺傳基礎(chǔ)和品質(zhì)育種等方面的研究。

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