魚類卵母細胞玻璃化凍存的研究進展及前景展望

章海敏 姜紅強 虞效益

摘要 玻璃化凍存是指利用一種或多種高濃度冷凍保護劑（即玻璃化液）保護待冷凍的生物材料，直接投入液氮中進行凍存的方法。近年來，魚類卵細胞和胚胎的低溫和超低溫保存研究引起人們重視。本文針對現(xiàn)階段研究進展及存在的主要問題進行綜述，并對魚卵細胞常用活性檢測方法進行匯總。

關鍵詞 魚卵細胞；玻璃化凍存；影響因子；活性檢測

中圖分類號 S917.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）06-0240-03

Research Progress and Prospect of Fish Oocytes Vitrification

ZHANG Hai-min 1 JIANG Hong-qiang 2 YU Xiao-yi 3

（1 Zhejiang Agriculture and Forestry University，Lin′an Zhejiang 311300； 2 Zhejiang Medical Instrument Research Institute；

3 Ningbo Institute of Science and Engineering，Zhejiang University）

Abstract Vitrification means pretecting frozen biological meterials by using one or more of high-concentration cryoprotectants，then crypreserve in liquid nitrogen directly. Cryopreservation of oocyte can provide sources of oocytes for the embryo engineering technology，such as external fertilization，nuclear transfer，transgenosis. It is vital to establish seed bank for breeding stocks，rare animals and endangered species，solve fertility problems for infertile women. So research on oocyte cryopreservation is of great signification.In recent years，researchers attact great importance to the studies on low-temperature of fish oocytes and embryos. This article summarized current research progress and existing main problems，and collected the detection method of fish oocyte.

Key words fish oocyte；vitrification；influential factors；detection methods

生物細胞、組織、器官、胚胎甚至個體在超低溫（-196 ℃）狀態(tài)下代謝完全停止，生命因此得以長期保存。慢速冷卻法作為傳統(tǒng)的低溫保存方式，深受冷卻速率的影響[1-4]，冷卻速率過快或過慢，均會對保存的細胞及組織造成損傷[5]。所謂玻璃化凍存，是生物材料低溫凍存中的一種方式，具體指利用一種或多種高濃度冷凍保護劑（即玻璃化液）保護待冷凍的生物材料，直接投入液氮中進行凍存的方法。在此過程中，細胞內的液體轉變?yōu)榉蔷w的玻璃態(tài)，其內部無晶體或僅少量結晶形成，從而防止冰晶的形成而減小對生物材料的損傷[6]。之后，細胞在一定的復溫條件下重新復活，從而達到種質資源保存和應用的目的[7-8]。

1 研究進展

自1985年小鼠胚胎玻璃化凍存獲得成功之后[9]，哺乳動物的卵母細胞、精子、胰島、胚胎神經細胞以及各階段胚泡等也相繼獲得成功[10]。但卵細胞因體積較大，結構和組分較復雜，抗凍能力較低，其冷凍保存仍不盡人意[11]。目前僅有一些嚙齒類或牛卵細胞，或是卵巢組織冷凍保存成功的報道，但各實驗室間的試驗結果有很大的差異[12-15]。由于魚類卵母細胞的細胞膜滲透性低[16-17]及卵母細胞高度的低溫敏感性[17-19]，大大影響了魚類卵母細胞玻璃化冷凍的研究進展。目前尚沒有魚類卵母細胞成功進行低溫保存的報道[20]。M.Guan等在斑馬魚卵母細胞玻璃化凍存的研究中發(fā)現(xiàn)，斑馬魚卵母細胞使用V3、V4玻璃化液、KCl緩沖液中具有較低的毒性和較好的冷凍效果，然而經臺盼藍染色后發(fā)現(xiàn)，冷凍復溫后的卵母細胞存活率顯著低于冷凍前，因此復溫方式的優(yōu)化還有待進一步解決[21]。目前，魚類卵細胞和胚胎的低溫和超低溫保存研究已經引起人們高度的重視[22]。

2 影響魚卵細胞玻璃化凍存的主要因子

2.1 卵膜的通透性、預平衡時間及玻璃化液的濃度和種類

魚類卵膜的通透性是影響魚類卵細胞玻璃化凍存的一個重要限制因子[7]，由于卵膜的通透性差，且有卵黃的存在，將魚卵細胞置于玻璃化液中預平衡時，如果時間太短，玻璃化液不能完全進入卵細胞內，影響凍存效果，然而如果置于玻璃化液中時間太久，玻璃化液自身毒性可造成魚卵細胞死亡。因此，研究魚卵細胞內水分分布及提高卵膜通透性、使用合適的玻璃化液濃度和種類降低玻璃化液毒性可有力克服障礙，是成功凍存魚卵細胞的前提條件。1988年，Agre等在紅細胞膜上發(fā)現(xiàn)水通道蛋白后[23]，Delgado等將水通道蛋白3的cRNA注射于青鳉卵細胞中并表達，研究結果證明注射后卵膜對水的滲透性提高2倍，甘氨酸達到（2.20±1.29）cm/min、乙二醇達到（2.98±0.36）cm/min、腎上腺素達到（3.93±1.70）cm/min、二甲基亞砜達到（3.11±0.74）×10-3 cm/min，相比正常卵母細胞均顯著提高[24]。此外隨著科學技術的不斷發(fā)展，也有研究者將顯微注射技術[25-27]、飛秒激光脈沖技術[28]、超聲波空化技術[29-31]應用于玻璃化凍存的研究中，也取得一定成效。

2.2 卵細胞冷敏感性

在魚類胚胎的冷凍過程中發(fā)現(xiàn)，卵黃囊是魚類胚胎的冷敏感性關鍵部位，卵黃外由卵黃合胞體層包圍，通透性差，阻礙了抗凍劑進入卵黃，在冷凍過程中產生冰晶對胚胎造成損傷。Liu等利用顯微注射法對斑馬魚6體節(jié)期胚胎進行部分卵黃去除，冷凍后發(fā)現(xiàn)其存活率及低溫耐受性均顯著高于正常胚胎[25]。武鵬飛等研究了顯微注射抗凍劑種類、抗凍劑的注射劑量、注射濃度、以及抗凍劑注射后牙鲆胚胎的冷敏感性影響，發(fā)現(xiàn)顯微注射后胚胎的冷敏感性有一定的降低[32]。同樣，魚卵細胞也具有高度的冷敏感性，如果將顯微注射技術應用于魚卵細胞中，是否可以降低卵細胞冷敏感性，這一問題亟待解決。

2.3 冷凍后復溫及玻璃化液洗脫

復溫是指在魚卵細胞置于液氮中凍存后，采用特定方式使其恢復至正常溫度的過程，該過程是降溫的逆步驟，在冷凍降溫中可能出現(xiàn)的一些損傷效應，在復溫過程中同樣存在（如細胞內冰晶的形成），目前報道的主要有快速復溫（40～150 ℃/min）和慢速復溫（2～8 ℃/min）[7]，但是這2種復溫方式在不同的細胞凍存中表現(xiàn)出不同的效果[33-35]。另外，胡軍祥等在大鼠胚腦細胞玻璃化凍存的研究中，采用微波復溫和水浴復溫相比，其結果表明采用微波復溫可有效提高細胞復溫速率，且對細胞的損傷明顯小于水浴復溫[36]。

此外，魚卵細胞在冷凍前預平衡期，吸收大量的玻璃化液，其細胞內滲透壓極大升高，如果直接將凍存后卵細胞置于水中，細胞可能吸水過多而破裂。因此，采用合適的洗脫液種類和濃度梯度也是影響凍存后細胞活性的重要影響因子。

3 常用的酶活性測定判斷冷凍效果

3.1 比色法測定卵母細胞ATP酶活性

ATP酶可催化ATP水解生成ADP及無機磷的反應，常通過測定反應釋放的無機磷量或ATP的減少量以及pH值變化等來測定ATP酶的活力。酶活力單位定義為每小時每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產生1 μmol無機磷的量為1個ATP酶活力單位（U）。

3.2 鉬酸銨法測定卵母細胞肌酸激酶（creatine kinase，CK）

CK催化肌酸和ATP之間高能磷酸鍵轉換生成磷酸肌酸和ADP的可逆反應。磷酸肌酸生成后很快全部水解為磷酸，此時三磷酸腺苷和二磷酸腺苷仍穩(wěn)定，加入鉬酸銨形成磷鉬酸，可進一步還原成鉬藍，根據(jù)生成無機磷的量可計算出酶的活力。根據(jù)標準曲線計算得出CK活力。

3.3 MTT法測定琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）

活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠還原MTT，生成甲臜（藍色或藍紫色，不溶于水），經異丙醇作用顆粒溶解顯色。甲臜生成量與活細胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度570 nm處OD值推測出活細胞的數(shù)目。酶活力單位定義為1 mg蛋白1 min使反應體系的吸光度降低0.01為1個比活性單位（U）。

3.4 紫外分光光度法測定乳酸脫氫酶（llactate dehydroge-nase，LDH）

LDH可催化乳酸與丙酮酸之間的氧化還原反應，通過測定NADH的吸光值可以反應出LDH酶活力。酶活力單位定義為每克組織蛋白37 ℃與基質作用15 min，在反應體系中產生1 μmol丙酮酸為1個單位（U）。

3.5 氮藍四唑（NBT）顯色法測定超氧化物歧化酶（supero-xided，SOD）

NBT顯色法，通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產生O2-，將氮藍四唑還原為藍色的甲臜，甲臜在560 nm處有強吸收。而SOD可清除O2-，從而抑制甲臜形成。反應液藍色的深淺可以反映超氧化物岐化酶活性的高低。酶活力單位定義為1 mg組織蛋白在1mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為1個SOD活力單位（U）。

3.6 過氧化氫酶（catalase，CAT）

CAT屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑?？筛鶕?jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。在反應系統(tǒng)中加入一定量（反應過量）的過氧化氫溶液，經酶促反應后，用標準高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過氧化氫，即可求出消耗的H2O2的量。活力單位定義為1 mg組織蛋白1 s分解1 μmol的過氧化氫的量為1個酶活力單位（U）。

3.7 比色法測定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）

GSH-Px的活力以催化GSH氧化的反應速度，及單位時間內GSH減少的量來表示，GSH和5，5-二硫對硝基苯甲酸（DTNB）反應在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子，于423 nm波長有最大吸收峰，測定該離子濃度，即可算出GSH減少的量，由于GSH能進行非酶反應氧化，所以最后計算酶活力時，必須扣除非酶反應所引起的GSH減少。規(guī)定每1 mg蛋白質，1 min扣除非酶反應的作用，使反應體系GSH濃度降低1 μmol/L為1個酶活力單位。

3.8 硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量

在較高溫度及酸性環(huán)境中，MDA可與TBA反應，形成紅色的MDA-TBA加合物，通過比色法可對動植物組織或細胞裂解液中MDA進行定量檢測。計算公式如下：

組織中MDA含量（nmol/mg prot）=（管吸光度-測定空白管吸光度）/（標準管吸光度-標準空白管吸光）×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數(shù)

4 前景展望

中國是一個水生生物資源十分豐富的國家，然而近年來由于魚類棲息環(huán)境的變化、過度捕撈、不合理引種、外來生物等因素影響[37]，我國魚類生物多樣性處于衰退形勢。雖然在魚卵細胞的玻璃化凍存的研究中，還存在諸多的困難有待解決，但其在防止魚類近親交配、保存魚類種質資源、維持生物遺傳多樣性等方面具有重要的應用價值[7]，隨著我國科技的不斷發(fā)展，相關研究的不斷深入，不斷優(yōu)化魚卵細胞玻璃化凍存途徑和技術路線，解決魚卵細胞自身存在的問題，降低各因子的影響作用，成功使用玻璃化方法凍存魚卵細胞指日可待。

5 參考文獻

[1] LI A P.Overview. hepatocytes and cryopreservation a personal historical perspective[J].Chemico-Biological Interactions，1999，121（1）：1-5.

[2] WHITTINGHAM D G.Survival of mouse embryos after freezing and thawing[J].Nature，1971，233：125-126.

[3] WHITTINGHAM D G，LEIBO S P，MAZUR P.Survival of mouse embryos frozen to -196 ℃ and -296 ℃[J].Science，1972，178：411-414.

[4] WILMUT I.The effect of cooling rate，warming rate，cryoprotective agent and stage of development of survival of mouse embryos during freezing and thawing[J].Life Sciences，1972，11：1071-1079.

[5] CHU Chao，HOU Li-min，LIU Ming-hui.Research Progress of Profound Hypothermia [J].Progress in Modern Biomedicine，2012，12（19）：3766.

[6] 李廣武，鄭從義，唐兵，等.低溫生物學[M].長沙：湖南科學技術出版社，1997：69-71，101-105.

[7] 陳松林.魚類配子和胚胎冷凍保存研究進展及前景展望[J].水產學報，2002，26（2）：161-168.

[8] 包華瓊，李躍民，王新莊，等.3種因素對牛卵母細胞玻璃毛細管玻璃化冷凍效果的影響研究[J].動物醫(yī)學進展，2004，25（6）：90-93.

[9] RALL W F，F(xiàn)AHY G M.Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196℃ by vitrification[J].Nature，1985，313：573-575.

[10] 楊瓊霞，張紹志，俞雅芳，等.動物組織細胞玻璃化凍存方法的研究進展[J].科技通報，2007，23（2）：202-206.

[11] 李喜龍，季維智.動物種質細胞的超低溫冷凍保存[J].動物學研究，2000，21（5）：407-411.

[12] NIEMANN H.Cryopreservation of ova and embryos from livestock：Current status and research needs[J].Theriogenology，1991，37：59.

[13] ARAV A，SHEHU D，MATTIOLI M.Osmotic and cytotoxic study of vitr-ification of immature bovine oocytes[J].Reprod Fertil，1993，99：353.

[14] OTOL T，YAMAMOTO K，KOYAMA N，et al.Cryopreservation of mature bovine oocytes following centrifugation treatment[J].Cryobiology，1997，34：36.

[15] CARROLL J，WHITTINGHAM D G，WOOD M J，et al.Extra 2 ovarian production of mature viable mouse oocytes from frozen primary follicles[J].J Reprod Fertil，1990，90：321.

[16] SELMAN K，WALLACE R A，SARKA A，et al.Stages of oocyte develo-pment in the zebrafish，Brachydanio rerio[J].Journal of Morphology，1993，218：203-224.

[17] ZHANG T，ISAYEVA A，ADAMS S L，et al.Studies on membrane perm-eability of zebrafish（Danio rerio）oocytes in the presence of different cryoprotectants.[J].Cryobiology，2005，50：285-293.

[18] EL-DANASOURI I，SELMAN H.Successful pregnancies and deliveries after a simple vitrification protocol for day 3 human embryos.[J].Cryobiology，2005，49：114-122.

[19] LUBZENS E，PEKARSKY I，BLAIS I，et al.Cryopreservation of oocytes from a marine fish：achievements and obstacles[R].Minneapolis，Minne-sota，USA，2005.

[20] WALLACE R A，SELMAN K.Cellular and dynamic aspects of oocyte growth in teleosts[J].American Zoology，1981，21：325-343.

[21] GUAN M，RAWSON D M，ZHANG T.Cryopreservation of Zebrafish（Danio Rerio）Oocytes by Vitrification.CryoLetters，2010，31（3）：230.

[22] 陳松林，劉憲亭.魚卵和胚胎冷凍保存研究進展[J].淡水漁業(yè)，1991（1）：44-46.

[23] PU Chun-xia.Research progress on aquaporin[J].Journal of Chengdu University（Natural Science Edition），2010，28（2）：104-106.

[24] DELGADO M，VALDEZ JR，HARA T，et al.Expression of aquaporin-3 improves the permeability to water and cryoprotectants of immature oocytes in the medaka（Oryziaslatipes）[J].Cryobiology，2006，53（2）：160-168.

[25] LIU X-H，ZHANG T，RAWSON D M.Effect of cooling rate and partial removal of yolk on the chilling injury in zebrafish（Daio rerio）embryos [J].Theriogenology，2001，55（8）：1719-1731.

[26] JANIK M，KLEINHANS F W，HAGEDORN M.Overcoming a permeability barrier by microinjecting cryoprotectants into zebrafish embryos（Brach-ydanio rerio）[J].Cryobiology，2000，41：25-34.

[27] BEIR？魨O J，ROBLES V，HERR？魣EZ M P，et al.Cryoprotectant microinj-ection toxicity and chilling sensitivity in gilthead seabream（Sparus aurata）embryo[J].Aquaculture，2006，261：897-903.

[28] KOHLI V，ROBLES V，CANCELA M L，et al.An alternative method for deliveringexogenous material into developing zebrafish embryos[J].Biotechnology and Bioengineering，2007，98（6）：1230-1241.

[29] BART A N，KYAW H A.Survival of zebrafish，（Brachydanio rerio）embryo after immersion in methanol and exposure to ultrasound with implications to cryopreservation[J].Aquaculture Research，2003，34：609-615.

[30] SILAKES S，AMRIT N.Bart.Ultrasound enhanced permeation of metha-nol into zebrafish，Danio rerio，embryos[J].Aquaculture，2010，303（1-4）：71-76.

[31] LIU X H，ZHANG T，RAWSON D M.Feasibility of vitrification of zebrafish（Danio rerio）embryos using methanol[J].Cryoletters，1998，19：309-318.

[32] WU Peng-fei，DING Hao，TIAN Yong-sheng，et al.Study on toxicity and chilling sensitivity of Flounder Paralichthys Olivaceus embryos microin-jected cryoprotectants[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2009， 25（16）：301-308.

[33] ZHANG X S，ZHAO L，HUA T C，et al.A study on the cryopreservation of common carp Cyprinus carpio embryos[J].Cryo Letters，1989，10：271-278.

[34] ZHANG K J，LOU Y D，ZHANG Y J，et al.Studies on cryopreservation of three freshwater fishes embryos[J].J Fish China，1997，21：366-372.

[35] HARVEY B.Cooling of embryonic cells，isolated blastoderms and intact embryos of the zebrafish to -196℃[J].Cryobiology，1983，20（4）：440-447.

[36] 胡軍祥，應華波，周國英，等.微波復溫對玻璃化大鼠胚胎腦細胞活性的影響[J].浙江大學學報，2005（2）：75-79.

[37] 康超，雒敏義.淺析中國淡水瀕危魚類瀕危原因及保護措施[J].中國水產，2010（12）：28-30.