高　蓉,楊鑫磊,駱軍容,李穩(wěn)宏

(1.中國人民解放軍第451醫(yī)院, 陜西 西安　710054;2.西北大學(xué) 化工學(xué)院,陜西 西安　710069;3.第四軍醫(yī)大學(xué) 校務(wù)部， 陜西 西安　710032)

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·化學(xué)與化學(xué)工程·

黃姜色素的抗氧化活性研究

高蓉1,楊鑫磊2,駱軍容3,李穩(wěn)宏2

(1.中國人民解放軍第451醫(yī)院, 陜西 西安710054;2.西北大學(xué) 化工學(xué)院,陜西 西安710069;3.第四軍醫(yī)大學(xué) 校務(wù)部， 陜西 西安710032)

以黃姜為原料,提取其中色素成分,以2,6-二叔丁基對苯酚(BHT)為對照,考察了黃姜色素成分對超氧物陰離子自由基(O2·-)、DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力、抗脂質(zhì)過氧化能力及還原能力。結(jié)果顯示,黃姜色素對超氧物陰離子自由基(O2·-)的清除活性略低于BHT(IC50值為0.392mg/mL);對DPPH的清除活性(IC50值為0.334mg/mL)和對ABTS的清除活性(IC50值為0.123mg/mL)均高于BHT;在實驗濃度內(nèi),黃姜色素表現(xiàn)出了較好的抑制脂質(zhì)過氧化能力(IC50值為0.258mg/mL);此外,通過普魯士藍(lán)法測得色素的還原能力與BHT相當(dāng)。由此可知,黃姜色素具有一定的抗氧化活性,是良好的天然抗氧化劑,可望被發(fā)展成為一種功能性食品添加劑及生物藥品基料。

黃姜色素;抗氧化活性;抗氧化劑

機體內(nèi)因為活性氧而引發(fā)、生成的自由基,能夠同細(xì)胞內(nèi)包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類、DNA等多數(shù)生物分子發(fā)生氧化反應(yīng),損傷機體內(nèi)各組織器官,導(dǎo)致機體加速衰老并引發(fā)諸如動脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥等相關(guān)疾病,近年來,天然抗氧化活性物質(zhì)的研究與開發(fā),已經(jīng)成為了國內(nèi)外研究的一個熱點[1-2]。黃姜是薯蕷科多年生草質(zhì)纏繞性藤本植物盾葉薯蕷的根莖,主要含有薯蕷皂苷類、淀粉、單寧及色素等化學(xué)成分[3-5]。目前對黃姜的研究主要集中在甾體皂素、淀粉及下游相關(guān)激素類藥物合成開發(fā)等[6-8]方面,對黃姜色素的相關(guān)研究報道較少。

黃姜色素的主要成分為類胡蘿卜素類物質(zhì),屬天然色素之列[9]。類胡蘿卜素具有較高的抗氧化能力,在預(yù)防癌癥、強化免疫系統(tǒng)等方面起到重要作用[10-11]。基于此,本研究以黃姜中的色素成分為研究對象,測定和分析其抗氧化活性,以期為開發(fā)利用黃姜資源提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黃姜(采自漢中市城固縣),使用前切片、烘干并粉碎,0.2mm篩分,低溫避光保存。

DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基)、ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽),美國Sigma公司;Trolox(水溶性維生素E),MP Biomedicals公司;BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚),天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;SD大鼠3只,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心提供,動物許可證號:SCXK 2012-003;無水硫酸鈉、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、鄰苯三酚,丙酮、乙醇、環(huán)己烷、甲醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外-可見分光光度計,日本島津公司;AB204-S型分析天平,梅特勒-托利多國際股份有限公司;SC-3610低速離心機,科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;Neofuge型冷凍離心機,上海申力科學(xué)儀器有限公司。

2　實驗方法

2.1黃姜色素的提取

準(zhǔn)確稱取30.0g黃姜粉末,放入500mL的燒杯,加入70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙醇溶液300mL,70℃恒溫水浴2h,浸提2次。提取液抽濾,減壓濃縮,無水硫酸鈉干燥,揮干溶劑得到色素粗提取物。取0.5g色素粗提取物,溶于2mL環(huán)己烷中,加入1.0g活化后硅膠,攪拌均勻,揮干溶劑,干法上樣。裝柱方法:取120℃活化2h的氧化鎂與硅藻土各10g,減壓干法裝柱,用2BV環(huán)已烷淋洗,以丙酮為洗脫劑,將不經(jīng)硫酸顯色即有顏色的洗出液收集在一起,干燥后即為色素提取物。分別精確稱取一定量的色素提取物及BHT溶液,用甲醇定容到質(zhì)量濃度為0.1～0.5mg/mL,作為測試溶液與對照溶液。

經(jīng)本實驗前期研究[9],使用上述方法黃姜色素的一次提取率在10%以上,其中β-胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.1604‰。

2.2自由基清除率的測定

2.2.1對超氧物陰離子自由基(O2·)的清除采用鄰苯三酚自氧化法[12],分別準(zhǔn)確移取50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.2)4.5mL于試管中,依次加入3.2mL甲醇、1.0mL不同濃度的色素溶液與BHT溶液,混勻后置于25℃水浴中,避光靜置20min。之后立即加入25℃預(yù)熱200mmol/L的鄰苯三酚溶液0.3mL,混勻后于320nm波長處測定吸光度,每30s記錄1次,得8組吸光度值。計算混合溶液的吸光度值隨時間的變化率,記為ΔAi。空白對照以甲醇代替色素溶液,測定ΔA0。根據(jù)公式(1)計算O2·-的清除率:

(1)

2.2.2對DPPH的清除

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取5.0 mg DPPH置于100 mL棕色容量瓶,甲醇定容,配置成50 mg/L的DPPH母液;分別精密量取DPPH母液1～6 mL置于10 mL棕色容量瓶中,甲醇定容,配置成濃度為5～30 mg/L的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液,在515 nm波長處[13]測定吸光度。以DPPH溶液的質(zhì)量濃度Ci為橫坐標(biāo),吸光度值A(chǔ)i為縱坐標(biāo),繪制DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合方程為:A=-0.026 1+0.024 5C,R2=0.999 8。

2)黃姜色素對DPPH自由基的清除作用

取25 mg/L DPPH甲醇溶液3 mL于棕色樣品瓶中,加入1mL不同濃度的色素溶液與BHT溶液,混勻后立即在515 nm波長處測定吸光度,并記錄2，3，5，7，10 min時的吸光度值,之后每隔5 min記錄一次,直到吸光度變化相差小于0.001時結(jié)束。最終測得的吸光度Ai在DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對應(yīng)的DPPH的殘留含量Ci,根據(jù)公式(2)計算DPPH被抑制后的殘留率:

殘留率/%=(1-Ci/Co)×100%。

(2)

2.2.3對ABTS的清除

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確量取3.9 mL ABTS待測液(0.096 0gABTS標(biāo)準(zhǔn)品、2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液25 mL,用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)將混合溶液稀釋至734 nm波長處[14]的吸光度為0.700±0.020)置于棕色樣品瓶中,依次向其中加入濃度為5～25 mg/L Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL,充分振蕩后,靜置10 min,在 734 nm波長處[15]測定吸光度。以Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度Ci為橫坐標(biāo),以Trolox 溶液的清除率Yi為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在質(zhì)量濃度為5～45 mg/L范圍內(nèi),Trolox對ABTS·+清除率的線性方程為:Y=2.301 1+1.638 8C,R2=0.999 2。

2)黃姜色素對ABTS自由基的清除作用

用不同濃度的色素溶液與BHT溶液代替Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液,重復(fù)上述(1)中的實驗方法測得溶液的吸光度。計算TC40=0.384 mg/mL,說明Trolox對ABTS·+的清除作用強于色素。并根據(jù)公式(3)計算ABTS·+的清除率:

清除率/%=(1-Ai/0.701)×100%。

(3)

2.3黃姜色素抗脂質(zhì)過氧化作用

2.3.1大鼠肝微粒體懸液的制備將SD 大鼠處死后立即拿出肝臟,清洗干凈后稱重,用含蔗糖0.01 mol/L 的Tris-HCl緩沖液(0.15 mol/L,pH=7.4)在冰浴條件下,制備肝勻漿液,勻漿液在4 ℃下,2 000 r/min離心10 min,共離心2次,吸去上清液,得到的沉淀就是大鼠的肝臟微粒體。將其置于-20℃下保存。大鼠肝臟微粒體的蛋白濃度按照Lowry 法來測定[14]。

2.3.2大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化抑制作用參照文獻(xiàn)[15],移取0.5 mL大鼠肝微粒體于一定量的pH為7.5 的磷酸鉀緩沖液中,使其蛋白的終濃度大約是0.3～0.5 g/L,在37℃的條件下,振蕩孵育完成后,加入0.5 mL,0.1 mmol/L 的Fe2+/VC啟動反應(yīng)。樣品組分別加入0.2 mL不同濃度的色素溶液,1h 后,加入1 mL 的10%三氯醋酸溶液終止反應(yīng),再加入1.5 mL的 0.67%硫代巴比妥酸溶液在沸水浴下加熱30 min后,自然冷卻至室溫,離心后取上清液在532 nm 處測其吸光度值。

以不加啟動劑的試樣作為空白組,以不加色素溶液的試樣作為陽性對照組。分別測定各濃度下待測試劑組的吸光度值,按照公式(1-4)計算黃姜色素對大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化體的抑制率。

抑制率/%=[1-(A樣品-A空白)/(A對照-A空白)]×100%。

(4)

2.4黃姜色素的還原力

分別量取不同濃度的黃姜色素溶液、BHT溶液各2 mL,依次加入0.2 mol/L(pH=6.6)磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL,混勻后置于50℃水浴中反應(yīng)20 min,取出自然冷卻至室溫。之后,向試管中加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL,混勻后4 000 r/min離心10 min,取2.5 mL上清液于另一組試管中,向其中依次加入蒸餾水2.5 mL與0.1%三氯化鐵溶液1 mL,混勻后靜置10 min,于700 nm波長處測其吸光度。

3　結(jié)果與分析

3.1清除超氧物陰離子自由基(O2·)

O2·-由鄰苯三酚在弱堿性條件下自氧化產(chǎn)生,抗氧化劑通過抑制自氧化的速率起到對O2·-的清除作用,O2·-清除率的高低與溶液中抗氧化物質(zhì)與之結(jié)合并生成有色中間產(chǎn)物的速率快慢有關(guān)。圖1是不同濃度下黃姜色素對O2·-的清除率柱狀圖。

圖1　黃姜色素對O2·的清除Fig.1　Scavenging rates of pigment extracts from yellow ginger on O2·

由圖1可知,在實驗濃度范圍內(nèi),黃姜色素與BHT對O2·-的清除率隨濃度的增加而增大,之后清除速率增加緩慢,這可能是因為反應(yīng)體系中產(chǎn)生的O2·-濃度越來越小。色素溶液在最大濃度時對O2·-的清除率為48.394%,未到半數(shù)清除率;根據(jù)清除率隨濃度變化的多項式規(guī)律,可得到BHT的IC50=0.392 mg/mL。結(jié)果表明,黃姜色素對O2·-的清除能力不及BHT。

3.2清除DPPH

DPPH·由DPPH溶解于有機溶劑中自動生成,其溶液為紫色?？寡趸瘎┩ㄟ^與DPPH·的單電子結(jié)合,使其自由基減少,通過溶液顏色變化顯示對DPPH·的清除效果。由圖2可知,在實驗濃度范圍內(nèi),色素與BHT對DPPH·的清除率均隨濃度的增加而增大,特別是當(dāng)濃度大于0.3 mg/mL時,色素清除率迅速增大。根據(jù)清除率隨濃度變化的多項式規(guī)律,色素的IC50=0.279 mg/mL,而BHT的IC50=0.334 mg/mL,說明清除半數(shù)DPPH·所需的色素濃度低于BHT。由此可知,色素對DPPH·的清除作用強于BHT。

圖2　黃姜色素對DPPH·的清除Fig.2　Scavenging rates of pigment extracts from yellow ginger on DPPH·

3.3清除ABTS

ABTS·+是由過硫酸鉀氧化ABTS產(chǎn)生的陽離子自由基,其溶液為藍(lán)綠色?？寡趸瘎┩ㄟ^與ABTS·+的單電子結(jié)合,使自由基減少,顏色變淺程度反映對ABTS·+的清除效果。圖3是不同濃度下黃姜色素對ABTS·+的清除率柱狀圖。

圖3　黃姜色素對ABTS·+的清除Fig.3　Scavenging rates of pigment extracts from yellow ginger on ABTS·+

由圖3可知,在實驗濃度范圍內(nèi),色素與BHT對ABTS·+清除率隨濃度增加而增大,但色素的清除率明顯高于BHT。根據(jù)清除率隨濃度變化的多項式規(guī)律,得到色素的IC50=0.123 mg/mL,BHT的IC50=0.449 mg/mL,說明色素對ABTS·+的清除作用明顯強于BHT。實驗中還發(fā)現(xiàn),改變?nèi)芤杭尤腠樞?即將ABTS·+待測液加入到測試溶液中,溶液立即無色,這可能與兩者單電子結(jié)合時在溶液中的接觸空間及反應(yīng)時間有關(guān)。

3.4黃姜色素抑制脂質(zhì)體過氧化的能力

氧自由基損傷組織的一個重要方式就是體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化,抑制脂質(zhì)過氧化物的生成速度或者加速清除生成的過氧化物,均可有效地保護(hù)組織細(xì)胞,從而延緩機體的衰老過程和對一些疾病的預(yù)防與治療。丙二醛是常用的衡量脂質(zhì)過氧化損傷程度的一個指標(biāo),它是一種脂質(zhì)過氧化物,能夠和機體內(nèi)的磷脂、蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)合生成穩(wěn)定的不溶性代謝終產(chǎn)物,丙二醛的異常增高會引起細(xì)胞損傷,破壞細(xì)胞的功能。黃姜色素抑制脂質(zhì)體過氧化能力的實驗結(jié)果如圖4 所示。

圖4　黃姜色素對Fe2+/VC體系誘導(dǎo)大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化的抑制作用Fig.4　 Inhibition effects of pigment extracts from yellow ginger on rat liver microsomal lipid peroxidation induced by Fe2+/VC

由圖4可知,在實驗濃度范圍內(nèi),黃姜色素表現(xiàn)出了比較好的抑制脂質(zhì)過氧化的能力,其抑制率為31.52% ～73.61%,且呈較好的量效關(guān)系, IC50=0.258 mg/mL。

3.5黃姜色素的還原力

普魯士藍(lán)法通過抗氧化劑將紅色的鐵氰化鉀還原成黃色的亞鐵氰化鉀,亞鐵氰化鉀與游離的Fe3+反應(yīng)生成普魯士藍(lán),根據(jù)普魯士藍(lán)的生成量與吸光值的關(guān)系可以判斷抗氧化劑的還原能力。

圖5　普魯士藍(lán)法測得黃姜色素的還原能力Fig.5　The antioxidant activity of pigment extracts from yellow ginger by the Prussian blue method

由圖5可知,在實驗濃度范圍內(nèi),隨濃度的增加,色素與BHT組的吸光值均增大,且色素的吸光值同與之濃度相同的BHT相差不多。由此可知,該法測得色素的還原能力與BHT相當(dāng)。

4　結(jié)　論

1)色素濃度在0.1～0.5 mg/mL范圍時,黃姜色素對超氧物陰離子自由基(O2·-)的清除活性略低于BHT;對DPPH·和ABTS的清除活性均高于BHT;且黃姜色素的清除能力隨著色素濃度的增加而增大。此外,普魯士藍(lán)法測得黃姜色素的還原能力與BHT相當(dāng)。

2)通過研究黃姜色素的抗脂質(zhì)過氧化能力,結(jié)果顯示,在實驗濃度范圍內(nèi),黃姜色素對Fe2+/VC體系誘導(dǎo)大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化的抑制作用明顯,其抑制率為31.52% ～73.61%。

3)本研究通過多種方法全面考察了黃姜色素的抗氧化活性,研究發(fā)現(xiàn),黃姜色素具有較好的抗氧化活性,可作為一種新型的天然抗氧化劑和自由基清除劑,這對進(jìn)一步開發(fā)利用黃姜資源有著重要的意義。

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(編輯陳鐿文)

The antioxidant activity of pigment from Dioscorea zingiberensis

GAO Rong1, YANG Xin-lei2, LUO Jun-rong3, LI Wen-hong2

(1.The 451st Hospital of People′s Liberation Army, Xi′an 710054, China; 2.School of Chemical Engineering, Northwest University, Xi′an 710069, China; 3.General Affairs Department，F(xiàn)ourth Military Medical University, Xi′an 710032， China)

The extraction of pigment from Dioscorea zingiberensis.The antioxidant activity of pigment from Dioscorea zingiberensis was investigated by measuring its scavenging ability on superoxide radicals (O2·-)， radicals DPPH·， radicals ABTS and its total Anti-lipid peroxidation and reducing power and reducing power with control for BHT. The results showed that the scavenging ability of pigment on superoxide radicals (O2·-) less than BHT(IC50=0.392mg/mL), the ability to scavenge radicals DPPH and radicals ABTS better than BHT(IC50=0.334mg/mL，IC50=0.123mg/mL), in the range of test concentration, pigment presents a good anti-lipid peroxidation(IC50=0.258mg/mL), moreover, the antioxidant capability of pigment with Prussian blue method is familiar with BHT. Accordingly, the pigment from Dioscorea zingiberensis has a certain antioxidant activity and is a natural antioxidants which can be exploited as a functional food additive and biomedicinals.

pigment extracts from yellow ginger; antioxidant activity; antioxidant activity

2015-03-16

陜西省科技廳自然科學(xué)基金資助項目(2014JQ2069)

高蓉，女，陜西西安人，西北大學(xué)博士，從事天然藥用活性成分分離純化研究。

李穩(wěn)宏，男，陜西西安人，西北大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，從事制藥工程、天然活性成分的分離純化研究。

R284.2

ADOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-01-011