朱　坤，胡　明,，楊蓬勃，張建水，陳新林,，劉建新

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院：1. 神經(jīng)生物學(xué)研究所；2. 人體解剖與組織胚胎學(xué)系，陜西西安　710061)

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◇基礎(chǔ)研究◇

阿司匹林通過促進海馬功能性神經(jīng)再生改善顳葉癲癇慢性期小鼠的空間記憶能力

朱坤1，胡明1,2，楊蓬勃2，張建水2，陳新林1,2，劉建新1

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院：1. 神經(jīng)生物學(xué)研究所；2. 人體解剖與組織胚胎學(xué)系，陜西西安710061)

目的評估阿司匹林(aspirin)通過抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)對顳葉癲癇(TLE)慢性期小鼠空間學(xué)習記憶能力的影響，并從海馬神經(jīng)再生角度初探其機制。方法匹魯卡品(pilocarpine)制作小鼠TLE模型，在慢性期分別腹腔注射不同劑量阿司匹林(20、60、80 mg/kg)或同體積生理鹽水，用Western blot和ELISA檢測海馬環(huán)氧化物酶-2(COX-2)和前列腺素E2(PGE2)變化，Morris水迷宮實驗評估動物的空間學(xué)習記憶能力并觀察海馬神經(jīng)元C-fos表達變化，BrdU+C-fos免疫熒光雙標染色觀察齒狀回新生細胞的功能整合。重復(fù)測量(repeated measures)ANOVA比較各組水迷宮潛伏期，One-way ANOVA方法分析各組染色陽性細胞計數(shù)結(jié)果。結(jié)果腹腔注射60、80 mg/kg阿司匹林可以明顯降低海馬COX-2和PGE2的表達(P<0.01)。與正常同齡對照組比較，TLE慢性期動物在Morris水迷宮任務(wù)中的表現(xiàn)明顯下降，而與生理鹽水注射模型組比較，阿司匹林治療組明顯縮短了定位航行實驗第3～5天的潛伏期并提高了空間探索實驗中穿越目的象限的時間比例 (P<0.01)。BrdU+C-fos免疫熒光染色結(jié)果顯示阿司匹林組動物齒狀回雙標細胞數(shù)量較生理鹽水注射組明顯增多(P<0.01)。結(jié)論阿司匹林可以改善TLE慢性期小鼠空間記憶能力。通過抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)、改善齒狀回微環(huán)境，促進海馬功能性神經(jīng)再生可能是阿司匹林的治療作用機制之一。

阿司匹林；顳葉癲癇；海馬；神經(jīng)再生；學(xué)習記憶；環(huán)氧化物酶-2(COX-2)；前列腺素E2(PGE2)

腦內(nèi)炎癥反應(yīng)參與癲癇相關(guān)腦區(qū)(如海馬)的高興奮性和自發(fā)性反復(fù)性癲癇發(fā)作(spontaneous recurrent seizures, SRSs)[1]，抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)已漸成為癲癇治療的新策略。環(huán)氧化物酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是介導(dǎo)癲癇后腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要信號路徑，將花生四烯酸轉(zhuǎn)變成前列腺素，而后者作為炎癥介質(zhì)介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)[2]。已有研究證明COX-2抑制劑可以減輕癲癇慢性期海馬細胞丟失、膠質(zhì)化和苔蘚纖維芽發(fā)等病理變化，并有效改善SRSs[3]?？臻g認知障礙是顳葉癲癇(TLE)慢性期另一個較為嚴重的癥狀[4]，尚無研究報道TLE慢性期阻斷COX-2對認知障礙的影響。阿司匹林是COX-2的阻斷劑，長期應(yīng)用較為安全。由于許多癲癇患者同時伴有心血管或其他系統(tǒng)疾病，也在長期使用阿司匹林，因此，研究這一藥物對TLE慢性期海馬等相關(guān)腦區(qū)的病理發(fā)展和疾病轉(zhuǎn)歸的影響具有實際的臨床意義。本研究應(yīng)用匹魯卡品(pilocarpine)誘導(dǎo)小鼠TLE模型，應(yīng)用行為學(xué)和形態(tài)學(xué)方法研究在疾病慢性期應(yīng)用阿司匹林對癲癇動物空間記憶障礙的影響，并從海馬神經(jīng)再生角度初步探究其可能的機制。

1　材料與方法

1.1動物雌性昆明小鼠購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)實驗動物中心，所有實驗經(jīng)過西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。在滿足研究要求的條件下，盡量減輕動物痛苦和減少實驗動物數(shù)量。

1.2模型制作與視頻監(jiān)測25～30 g雌性昆明小鼠，在安靜、較暗的動物實驗室進行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)前30 min皮下注射硝酸甲基東莨菪堿基1 mg/kg(0.025 mg/mL)(Catalog No.S2250, Sigma, USA)以減輕匹魯卡品對周圍神經(jīng)的損害；匹魯卡品 300 mg/kg(75 mg/mL)(Catalog No. P6503, Sigma, USA)腹腔注射，5 min后給予聲音、提尾等輕微刺激，絕大多數(shù)動物進入癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)。為觀察慢性期癲癇發(fā)作，鼠籠上架設(shè)高清存儲式攝像頭，實驗動物(3只/籠)在癲癇持續(xù)狀態(tài)后2月接受為期2周、每天24 h的視頻監(jiān)測。分析視頻資料，剔除無自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作的動物。

1.3動物分組及給藥方法動物分為正常同齡對照組、癲癇+生理鹽水組(TLE生理鹽水組)、癲癇+阿司匹林組(TLE阿司匹林組，共設(shè)3個質(zhì)量濃度，即20、60、80 mg/kg)。阿司匹林(Catalog No.A2093, Sigma, USA)溶于生理鹽水(室溫下攪拌2 h)，配制成質(zhì)量濃度為3.3 g/L。SE后3月開始分別腹腔注射阿司匹林或等量生理鹽水，每日1次。每組每個處死時間點為6只動物。

1.4Western blot分析COX-2蛋白水平各組注射10周后，水合氯醛(0.4 g/kg)麻醉動物，冰上取出兩側(cè)完整海馬組織。RIPA裂解液裂解、超聲破碎提取蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并電轉(zhuǎn)到PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉4 h，加入兔抗COX-2(1∶1 000, Catalog No.12282, Cell Signal Technology, USA)一抗孵育液4 ℃過夜孵育。洗滌后用辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG(1∶2 000, Catalog No.31460, Pirece Biotechnology, USA)孵育液室溫孵育2 h。洗滌后加入化學(xué)發(fā)光底物(Catalog No.JPC001, Genshare Biological, China)。將PVDF膜在暗室中曝光，顯影。將膠片上的條帶在凝膠成像儀中(Syngene, Cambridge, UK)進行圖像分析。內(nèi)參選用β-actin。

1.5ELISA分析PGE2蛋白水平按照小鼠前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Catalog No.ml028719，上海酶聯(lián)生物科技公司)進行操作。將5倍稀釋的海馬組織懸液50 μL和標準樣加入固相包被有兔抗小鼠PGE2抗體的48孔板，37 ℃孵育30 min。洗滌5次后加入辣根過氧化物酶標記的IgG，洗滌后加入100 μL顯色液進行顯色。分光光度儀測量吸光度A值，繪制標準曲線并計算樣本的PGE2含量。

1.6Morris水迷宮實驗Morris水迷宮系統(tǒng)由1個圓柱形金屬泳池(直徑120 cm，深度60 cm)和其上方的高清攝像頭及連接的圖像分析系統(tǒng)構(gòu)成。泳池外表涂以黑色無毒漆。水深40 cm，水溫(20±2)℃。在定向航行學(xué)習訓(xùn)練中，將泳池平分為4個象限，將直徑10 cm的透明平臺隱匿在其中1個象限水面下5 cm。動物隨機由4個不同象限入水。從入水到找到隱匿平臺的時間記錄為潛伏期。如動物在60 s內(nèi)未能找到，則將動物沿水面緩慢拖到平臺并允許站立10 s，潛伏期記錄為60 s。定向航行訓(xùn)練共進行5 d，每天上下午各1次，每次每只動物隨機從4個象限分別入水。圖像記錄分析系統(tǒng)記錄動物的潛伏期、游泳速度和游泳軌跡。在第6天的空間探索實驗中，將隱匿平臺去掉，動物隨機從4個象限分別入水，記錄分析動物60 s內(nèi)在目標象限(定向航行訓(xùn)練中隱匿平臺象限)停留時間的比例。

1.75-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxy uridine, BrdU)標記及BrdU+C-fos免疫熒光雙標染色阿司匹林注射4周后進行BrdU標記。一次性腹腔注射BrdU(Catalog No.B5002, Sigma, USA)，劑量為150 mg/kg。BrdU標記后6周，水合氯醛(0.4 g/kg)麻醉動物。分別用0.1 mol/L PBS緩沖液和40 g/L多聚甲醛(0.1 mol/L PB緩沖液溶解)固定液灌注動物，取腦，后固定3 h， 300 g/L蔗糖溶液中4 ℃過夜。恒溫冰凍切片機(Slee Technik, Mainz, Germany)切取40 μm厚含全長背側(cè)海馬的冠狀腦片(前囟后2.80～4.52 mm)，每次連續(xù)切取5張，依次放入裝有0.1 mol/L PBS的10個板孔內(nèi)，反復(fù)上述操作，最終每個板孔內(nèi)包含6～8片間隔200 μm的背側(cè)海馬腦片。

每只動物取出1個板孔內(nèi)的腦片，0.1 mol/L PBS洗滌3次，浸入2 mol/L HCl 在37 ℃水浴箱內(nèi)變性30 min；洗滌后用小鼠抗BrdU(1∶300, Catalog No. VP-B209, Vector, USA)和兔抗C-fos(1∶1 500, Catalog No.2250, Sigma, USA)混合一抗溶液(用加入3 mL/L的Triton和10 mL/L的山羊血清的0.1 mol/L PBS配制)孵育，4 ℃過夜；0.1 mol/L PBS洗滌3次，用Cy3標記的山羊抗小鼠IgG(1∶200, Catalog No.0311, ZSGB-Bio, China)和FITC標記的山羊抗兔IgG(1∶200, Catalog No.0313, ZSGB-Bio, China)二抗混合液室溫孵育2 h，0.1 mol/L PBS洗滌3次，錨定、封片，激光共聚焦顯微鏡(TCS, Sp2, Leica, Germany)觀察并計數(shù)免疫熒光染色細胞。每組6只動物，每只計數(shù)6～8張腦片(連續(xù)切片，每間隔5張取1張)SGZ-GCL區(qū)域全部BrdU+C-fos或BrdU免疫陽性細胞數(shù)量。所得細胞數(shù)量×5計算得出各區(qū)域所含免疫陽性細胞數(shù)量絕對值。

1.8統(tǒng)計分析計量資料以均數(shù)±標準差表示，用GraphPad Prism 4軟件進行數(shù)據(jù)分析。細胞計數(shù)、Western blot和ELISA結(jié)果采用One-way ANOVA進行多組間比較，其后再采用Newman-keuls方法進行兩兩比較。Morris水迷宮定向航行實驗潛伏期采用Repeated Measures ANOVA進行分析，空間探索實驗穿越目的象限時間比采用One-way ANOVA進行多組間比較，其后再采用Newman-keuls方法進行兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1匹魯卡品誘導(dǎo)SE的行為學(xué)表現(xiàn)匹魯卡品誘導(dǎo)的行為學(xué)變化包括起始的肌肉緊張，尾部翹起，發(fā)展到四肢肌肉痙攣，劇烈跳動、摔倒，最后維持在頭頸部肌肉抽動，持續(xù)快速點頭的狀態(tài)。自腹腔注射匹魯卡品到動物出現(xiàn)連續(xù)無中斷發(fā)作的時間為(15.6±6.4)min，持續(xù)時間為(7.4±1.4)h。32只動物接受視頻監(jiān)測，其中29只動物出現(xiàn)自發(fā)性反復(fù)性癲癇發(fā)作，發(fā)作頻率為(1.78±0.9)次/24 h，單次持續(xù)時間為(9.0±6.4)s。生理鹽水注射動物無異常行為學(xué)改變。

2.2Western blot檢測各組海馬COX-2的表達變化正常對照和阿司匹林不同劑量組之間海馬COX-2表達有差異(F(5,26)=11.20，P=0.000)；TLE慢性期注射生理鹽水組較正常同齡對照組增高(P<0.01)；60、80 mg/kg的阿司匹林注射組較生理鹽水組降低(P<0.01)；20 mg/kg阿司匹林組COX-2水平和生理鹽水注射組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05。圖1A、1B、1C)。

2.3ELISA檢測海馬PGE2的水平變化各實驗組間海馬PGE2蛋白水平有差異(F(5,26)=34.20，P=0.001)。TLE慢性期注射生理鹽水組海馬PGE2水平較正常同齡對照組明顯增高；60、80 mg/kg的阿司匹林組較生理鹽水組明顯降低(P<0.01)；20 mg/kg阿司匹林組與生理鹽水注射組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05。圖1D)。根據(jù)阿司匹林對COX-2和PGE2的抑制效果，后續(xù)實驗選用阿司匹林的劑量為60 mg/kg。

2.4Morris水迷宮實驗結(jié)果在定向航行實驗中，訓(xùn)練的前2 d正常對照組、生理鹽水組和阿司匹林組潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在后3 d的實驗中，生理鹽水組潛伏期較正常同齡對照組明顯延長(P<0.05)，而60 mg/kg阿司匹林組潛伏期較生理鹽水組縮短(P<0.05)；在第5天的空間探索實驗中，生理鹽水組在60 s內(nèi)穿越目的象限的時間比例較正常同齡對照組降低(P<0.01)，而60 mg/kg阿司匹林組動物穿越目的象限的時間比例較生理鹽水組提高(P<0.01)；Morris水迷宮實驗中各組動物的平均游泳速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05。圖2)。

圖1顳葉癲癇慢性期應(yīng)用阿司匹林對海馬COX-2和PGE2的影響

Fig.1 The effects of treatment of aspirin during the chronic stage of TLE on the levels of COX-2 and PGE2 in the hippocampus

A：實驗設(shè)計路線；B：Western blot檢測COX-2的蛋白條帶；C：Western blot檢測海馬COX-2的統(tǒng)計柱形圖；D：ELISA檢測海馬PGE2的統(tǒng)計柱形圖。各泳道及統(tǒng)計圖的1～5分別為正常對照組、癲癇+生理鹽水組及癲癇+阿司匹林組(20、60、80 mg/kg)。*P<0.01vs. Epilepsy+saline(n=6)。

2.5BrdU+C-fos免疫熒光雙標染色結(jié)果Morris水迷宮實驗后90 min，齒狀回顆粒細胞層可見部分C-fos免疫陽性細胞；與正常同齡對照組動物比較，TLE慢性期生理鹽水組齒狀回SGZ-GCL區(qū)域BrdU+C-fos免疫雙標細胞數(shù)量減少(P<0.01)；60 mg/kg阿司匹林組SGZ-GCL區(qū)域BrdU+C-fos免疫雙標細胞數(shù)量較生理鹽水注射組增多(P<0.01)；正常組、TLE生理鹽水組和TLE阿司匹林組之間，SGZ-GCL區(qū)域BrdU+C-fos免疫雙標細胞數(shù)量占各自BrdU免疫陽性細胞數(shù)量的比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

3　討　　論

癲癇慢性期海馬膠質(zhì)化、苔蘚纖維芽發(fā)和CA區(qū)細胞丟失等病理變化已基本形成，但腦內(nèi)炎癥反應(yīng)持續(xù)存在[5]。本研究關(guān)注針對這一時期的炎癥治療時對空間認知能力障礙和海馬神經(jīng)再生的影響，因此，阿司匹林治療和海馬新生細胞標記選擇在SE后3月(匹魯卡品誘導(dǎo)小鼠SE后2月已經(jīng)進入慢性期[6])進行；TLE慢性期腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的控制是一個較為長期的過程，故選擇持續(xù)10周的阿司匹林治療，本研究Western blot 和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，阿司匹林治療10周可以有效抑制海馬COX-2和PGE2水平；由于6周齡海馬新生細胞已經(jīng)可以功能性整合到海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)并支持學(xué)習記憶功能[7]，故選擇BrdU標記6周后進行新生細胞的功能整合的觀察。

圖2阿司匹林對TLE慢性期小鼠水迷宮實驗潛伏期和穿越目的象限時間比例的影響

Fig.1 The effects of treatment of aspirin during the chronic stage of TLE on the performances of mice in Morris water maze

A：實驗設(shè)計路線；B：定向航行訓(xùn)練潛伏期統(tǒng)計折線圖；C：游泳速度統(tǒng)計折線圖；D：空間探索實驗穿越目的象限的時間比例統(tǒng)計柱形圖。*P<0.01vs. Epilepsy+saline(n=6)。

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑可以減輕Alzheimer’s病和外傷性腦損傷后的學(xué)習記憶障礙[8-9]。本研究證實60 mg/kg阿司匹林腹腔注射可以明顯改善匹魯卡品誘導(dǎo)的TLE慢性期小鼠在Morris水迷宮中的表現(xiàn)。海馬齒狀回新生細胞參與支持海馬學(xué)習記憶功能，因此，進一步分析了阿司匹林是否可以改善TLE慢性期小鼠海馬功能性神經(jīng)再生。經(jīng)過定向航行訓(xùn)練、空間探索實驗可以有效激活參與空間記憶的海馬神經(jīng)元，這些神經(jīng)

圖3阿司匹林對小鼠TLE慢性期功能性海馬神經(jīng)再生的影響

Fig.3 The effects of treatment of aspirin during the chronic stage of TLE on functional neurogenesis in the hippocampus

A：實驗設(shè)計路線；B、C：分別為生理鹽水對照組、阿司匹林組BrdU+C-fos免疫熒光染色，B1～B3、C1～C3分別為B、C圖中大箭頭所示c細胞的分色圖；D：BrdU+C-fos雙標細胞計數(shù)統(tǒng)計柱形圖；E：BrdU+C-fos雙標細胞比例統(tǒng)計柱形圖。

*P<0.01vs. Epilepsy+saline(n=6)。B、C標尺=100 μm；B1～B3、C1～C3標尺=50 μm。

元表達即早基因C-fos[9]。因此，在Morris水迷宮實驗后，利用BrdU+C-fos免疫熒光染色評估了海馬功能性神經(jīng)再生，發(fā)現(xiàn)60 mg/kg阿司匹林腹腔注射明顯增加匹魯卡品誘導(dǎo)的TLE慢性期功能性整合的新生神經(jīng)元的數(shù)量。

TLE慢性期海馬神經(jīng)再生活動嚴重下降[10]，其機制尚不完全清楚。腦內(nèi)持續(xù)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致齒狀回神經(jīng)再生微環(huán)境的破壞可能是其中的重要原因[11]，炎癥反應(yīng)中小膠質(zhì)細胞的激活和一些炎癥因子，如腫瘤壞死因子和白細胞介素等可能介導(dǎo)了上述神經(jīng)再生微環(huán)境的破壞[12]。COX-2-PGE2是癲癇慢性期腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要路徑，本研究也證實60、80 mg/kg阿司匹林腹腔注射10周明顯抑制了海馬COX-2和PGE2表達水平。因此，阿司匹林可能通過抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)和改善齒狀回局部微環(huán)境而促進TLE慢性期小鼠海馬功能性神經(jīng)再生，并改善其空間記憶能力。

本研究還發(fā)現(xiàn)，阿司匹林治療并沒有改變齒狀回BrdU+C-fos熒光雙標細胞占BrdU細胞總數(shù)的比例，提示阿司匹林對海馬功能性神經(jīng)再生的促進作用可能并不是通過提高新生神經(jīng)元的整合能力實現(xiàn)的。而促進新生細胞的存活，使得更多的新生神經(jīng)元能夠參與功能整合可能是阿司匹林促進TLE慢性期小鼠海馬神經(jīng)再生的途徑。

本研究為阿司匹林改善TLE慢性期空間記憶能力的治療作用提供了初步證據(jù)。下一步研究還需要系統(tǒng)評估阿司匹林對癲癇慢性發(fā)作、癲癇慢性期海馬新生細胞的異常整合以及顆粒細胞興奮性的影響。

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(編輯國榮)

Aspirin attenuates cognitive deficits of chronically epileptic mice by promoting the functional integration of newly generated neurons

ZHU Kun1, HU Ming1,2, YANG Peng-bo2, ZHANG Jian-shui2, CHEN Xin-lin1,2, LIU Jian-xin1

(1. Institute of Neurobiology, 2. Department of Human Anatomy,Histology and Embryology, School of Basic Medical Sciences of Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, China)

ObjectiveTo assess the effects of chronic administration of aspirin on the cognitive deficits and functional integration of newly generated neurons from the dentate gyrus. MethodsPilocarpine was used to induce status epilepticus (SE) in mice (TLE). At 3 months after SE, the mice were injected i.p. with either aspirin (20, 60 and 80 mg/kg) in experimental groups or saline of the same volume in the control group for 10 weeks. The protein levels of COX-2 and PGE2 in the hippocampus were detected by Western blot or enzyme linked immunosorbent assay, respectively. Morris water maze (MWM) task was employed to assess the spatial cognitive ability of the mice. The newly generated neurons that were integrated into memory circuits were visualized by detecting activation of BrdU+cells, following a recall of spatial memory test at the chronic stage of TLE. Repeated measures ANOVA or One-way ANOVA methods were used to analyze the escape latencies in MWM task or other data respectively. ResultsTen-week treatment with 60 mg/kg or 80 mg/kg of aspirin decreased significantly the levels of COX-2 and PGE2 in the hippocampus when compared with saline treatment (P<0.01). On the last three days of the place navigation test, saline-treated epileptic mice took a much longer latency than normal mice or aspirin-treated mice with the dose of 60 mg. In the spatial probe test, the mice in the saline group spent significantly less time in the target quadrant than the mice in apirin groups (P<0.01). When compared with the saline-treated mice, more double labeling cells of BrdU+C-fos in the subgranular zone-granule cell layer (SGZ-GCL) were found in the mice with 10-week aspirin treatment (P<0.01). ConclusionChronic treatment of aspirin attenuates cognitive deficits of epileptic mice. Inhibiting brain inflammation and consequently restoring functional integration in the hippocampus may partially contribute to the therapeutic effect of aspirin.

aspirin; temporal lobe epilepsy; hippocampus; neurogenesis; learning and memory; COX-2; PGE2

2016-03-15

2016-04-14

國家自然科學(xué)基金面上項目資助(No.81171232，81371427)

劉建新. E-mail: liujianxin@mail.xjtu.edu.cn

R322.8

A

10.7652/jdyxb201605002

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81171232 and 81371427)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160802.1146.008.html(2016-08-02)