超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UFLC -MS/MS）測(cè)定山楂片中展青霉素含量的研究

趙紅磊楊麗蓉趙紅艷

（1.濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 山東濰坊 261201；2.濱州醫(yī)學(xué)院 山東煙臺(tái) 264003）

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UFLC -MS/MS）測(cè)定山楂片中展青霉素含量的研究

趙紅磊1楊麗蓉1趙紅艷2

（1.濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 山東濰坊 261201；2.濱州醫(yī)學(xué)院 山東煙臺(tái) 264003）

建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（UFLC-MS/MS）測(cè)定山楂片中展青霉素含量的方法。山楂片樣品經(jīng)粉碎后酶解，以乙酸乙酯提取展青霉素，用HLB固相萃取小柱凈化并濃縮，以UFLC-MS/MS電噴霧離子源負(fù)離子（ESI-）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢驗(yàn)。方法線性相關(guān)系數(shù)0.9996，檢出限5μ g/kg，加標(biāo)回收率81.34～96.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.7%～4.6%。結(jié)果表明，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，能應(yīng)用于山楂片中展青霉素含量的測(cè)定。

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 展青霉素 山楂片

展青霉素（Patulin），化學(xué)名稱為4-羥基-4氫-呋喃-［3，2c］-吡喃-2（6）-酮［1］，化學(xué)式C7H6O4，分子量154，屬雜環(huán)內(nèi)酮結(jié)構(gòu)。展青霉素首先在霉?fàn)€蘋果和蘋果汁中發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于各種霉變水果中。展青霉素是由曲霉和青霉等真菌產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物， 具有影響生育、致癌和免疫等毒理作用，同時(shí)也是一種神經(jīng)毒素。使人神經(jīng)麻痹、肺水腫、腎功能衰竭［2］［3］。在食品檢驗(yàn)中，常在蘋果和山楂制品中發(fā)現(xiàn)，是判斷該類產(chǎn)品是否安全的一個(gè)重要指標(biāo)［4］。

鑒于展青霉素潛在的毒性及危害性，大多數(shù)國(guó)家和組織已建立了展青霉素的限量標(biāo)準(zhǔn)，如歐盟規(guī)定蘋果汁及含蘋果汁的飲料中展青霉素最大限量為 50μg/kg，WHO 規(guī)定展青霉素在蘋果汁中的最高限量標(biāo)準(zhǔn)為 50μg/kg［5］；我國(guó)對(duì)展青霉素的限量也作了規(guī)定，GB2761-2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》規(guī)定以蘋果及山楂為原料制成的產(chǎn)品中（果丹皮除外）展青霉素限量為50μg/ kg。目前我國(guó)的展青霉素檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為薄層色譜法（GB/T5009.185-2003《蘋果和山楂制品中展青霉素的測(cè)定》）以及液相色譜法（NY/ T1650-2008《蘋果及山楂制品中展青霉素的測(cè)定高效液相色譜法》）兩種。薄層色譜法在實(shí)際檢驗(yàn)過(guò)程中操作繁瑣，重復(fù)性差，液相色譜法則存在羥甲基糠醛的干擾，影響展青霉素的測(cè)定，存在假陽(yáng)性的可能。目前文獻(xiàn)報(bào)道中采用的檢測(cè)方法還有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、免疫學(xué)檢測(cè)方法等［4，6］。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，研究建立了山楂片及制品中展青霉素的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（液相為Shimadzu UFLCXR，質(zhì)譜為美國(guó)AB公司

API4000+），分析天平 （XS205DU，梅特勒-托利多），食品粉碎機(jī)（屹立QE-100），渦旋混勻器 （IKA MS3 ），氮?dú)獯蹈蓛x（海能HN200），離心機(jī)（Thermo F16），pH計(jì)（梅特勒-托利多）。

1.2 試劑及耗材

乙腈、乙酸乙酯、冰乙酸（均為色譜純 ），果膠酶（Sigma公司），展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品（98.8%，Pribolab公司），Oasis HLB柱（3mL/60mg，美國(guó)Waters公司）、山楂制品樣品來(lái)自市場(chǎng)購(gòu)買。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取適量展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用適量乙酸乙酯溶解后，加乙酸乙腈定容到刻度，配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，避光保存于-20℃冰箱中。準(zhǔn)確移取適量的展青霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于，氮?dú)獯蹈珊笥?.2%乙酸配制成1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，避光保存于4℃冰箱中。使用時(shí)，根據(jù)需要以空白基質(zhì)溶液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，標(biāo)準(zhǔn)使用溶液應(yīng)臨用前配制。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

確稱取5g均勻試樣（精確到0.01g） 于50mL具塞刻度試管中，加入20mL水與100μL果膠酶溶液，40℃避光放置2h酶解。在酶解后溶液中加入20mL乙酸乙酯，渦旋震蕩提取后，于6000rpm離心3min，轉(zhuǎn)移上層乙酸乙酯提取液，再用20mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，收集兩次的乙酸乙酯溶液，40℃氮?dú)獯蹈珊?，用適量1%乙酸溶液溶解殘?jiān)?，并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中并定容，待下一步凈化處理。

1.4.2 凈化

Oasis HLB柱首先用6mL色譜甲醇和6mL水活化，然后準(zhǔn)確移取5.00mL上述樣品溶液（1.4.1）置于活化過(guò)的HLB柱內(nèi)，使之以3mL/min的速度流過(guò)HLB柱，以乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液并用氮?dú)獯蹈桑缓笥?.00mL 0.2%乙酸溶液溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22μm濾膜后上機(jī)。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 液相色譜條件

液相色譜柱1 （Shim-pack XR-ODS， 2.0×75mm，2.2μ m），液相色譜柱2（Shim-pack XR-ODS， 2.0×100mm，2.2μm），液相色譜柱3（BEHC18， 2.1×100mm，1.7μm）。流動(dòng)相：乙腈+水（10+90）；流速：0.20mL/ min，柱溫：35℃。進(jìn)樣量：10μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源ESI；掃描方式：負(fù)離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM，利用保留時(shí)間和離子豐度判斷定性結(jié)果， 利用峰面積定量；噴霧電為-4500V；離子化溫度450℃；碰撞氣5；氣簾氣10；霧化氣13；輔助氣13；定量離子對(duì)m/z 152.8/108.8；定性離子對(duì)m/z 152.8/134.7；去簇電壓DP：-36；射入電壓EP：-6；碰撞電壓CE：-18；碰撞室射出電壓CXP：-15。

圖1 展青霉素二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 MS/MS spectrum of patulin

表1 不同色譜柱對(duì)展青霉素的分離能力比較Table1 separation effects of patulin by different chromatography columns

表2 精密度和準(zhǔn)確度考察結(jié)果Table2 Results of precision and accuracy

圖2 50 μg/L展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品UFLC-MS/MS分離圖左圖為m/z108.8，右圖m/z134.7Fig.2 UFLC-MS/MS spectrum of patulin with concentration of 50 μg/L Left is m/z108.8， right is m/z108.8

圖3 陽(yáng)性樣品中展青霉素UFLC-MS/MS分離圖左圖為m/z108.8，右圖m/z134.7Fig.3 UFLC-MS/MS spectrum of patulin in hawthorn tablets Left is m/z108.8， right is m/z108.8

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)展青霉素的性質(zhì)，其具有較強(qiáng)的電負(fù)性，因此在負(fù)離子模式下，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。采用針泵進(jìn)樣的方式對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。首先用針泵進(jìn)樣1μg/mL展青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，流速10μL/min，找準(zhǔn)其母離子m/z 152.8，調(diào)整CE電壓使母離子峰高約為最大子離子峰高的1/3至1/4，同時(shí)確定其子離子碎片m/z 108.8、m/z 134. 7，以m/z 152.8/108.8為定量離子對(duì)，以m/z 152.8/134.7作為定性離子對(duì)（見(jiàn)圖1）。

2.2 色譜條件的選擇

展青霉素屬于強(qiáng)極性化合物，同時(shí)其分子量較低，因此本試驗(yàn)采用常用的C18柱對(duì)展青霉素進(jìn)行分離，分別考察了不同C18柱Proshell 120 SB-C18、Inertsil ODS-3、BEH C18分離能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同C18柱分離效果都能達(dá)到要求，出峰時(shí)間有所差別，綜合選擇了出峰時(shí)間較晚，峰寬最窄的Inertsil ODS-3色譜柱。

由于展青霉素的強(qiáng)極性，為了保證較好的分離洗脫，因此試驗(yàn)選擇極性較低的乙腈作為流動(dòng)相，同時(shí)將乙腈的比例設(shè)置為較低比例10%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該條件對(duì)展青霉素的分離有較好的效果。同時(shí)由于展青霉素在酸性條件下較為穩(wěn)定，因此本試驗(yàn)選擇0.2%乙酸溶液為溶劑對(duì)樣品進(jìn)行定容。

2.3 靈敏度和檢出限

試驗(yàn)對(duì)該方法的靈敏度和檢出限進(jìn)行了考察，靈敏度以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程考察。用空白樣品處理液稀釋展青霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，得到濃度為10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)系列，以峰面積為Y軸、濃度為X軸進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=151.5x-55.7，r2=0.9996，線性相關(guān)性良好。

取空白樣品處理液添加適當(dāng)濃度展青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)樣，按3倍信噪比S/N計(jì)算得出其最低檢測(cè)限為5μg/kg，而我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的展青霉素的限量為50μg/kg，此方法完全能滿足需要。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度

取不含展青霉素的空白樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，分別添加至10μg/ kg、30μg/kg、50μg/kg三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，以回收率考察方法的準(zhǔn)確度，同時(shí)每個(gè)水平進(jìn)6針作平行測(cè)定，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）考察方法的精密度。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)試

根據(jù)本文確定的試驗(yàn)方法，我們從市場(chǎng)上購(gòu)買了10份山楂片樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中有一份樣品檢出陽(yáng)性，檢出展青霉素含量為13.2 μg/kg。陽(yáng)性樣品色譜圖見(jiàn)圖。

3 結(jié)果和討論

本文通過(guò)開(kāi)展系列試驗(yàn)研究，考察了不同色譜柱對(duì)展青霉素的分離能力，通過(guò)優(yōu)化質(zhì)譜條件，確定了展青霉素的定性和定量離子對(duì)，從而能對(duì)展青霉素進(jìn)行確證性檢測(cè)，考察了方法的靈敏度、檢出限、精密度和準(zhǔn)確度，同時(shí)對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明該方法能夠快捷準(zhǔn)確的對(duì)山楂片中的展青霉素進(jìn)行檢測(cè)，能較好的滿足檢驗(yàn)需求。

［1］徐明悅，李洪軍，王珊等.食品中展青霉素檢測(cè)方法及脫除技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2015，36（01）：375-380.

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Research of content determination of patulin in haw flakes by UFLC-MS/MS

Honglei Zhao1， Lirong Yang1， Hongyan Zhao2
（1 Weifang Center for Food and Drug Control， Weifang 261201， China）（2 Binzhou Medical University， Yantai264003， China）

A method was developed for content determination of patulin in haw flakes by UFLC-MS/MS. Haw flakes samples were enzymed after crushed，then patulin was extracted by ethyl acetate， purified by HLB solid-phase extraction column， and determined by UFLC-MS/MS with electrospray negative ionization （ESI-） in multiple reaction monitoring （MRM）. Good Linear correlation coefficient 0.9996 was observed. Detection limit of the method was 5μ g/kg. The recovery rate of patulin added was 81.34% ～ 96.4% with the relative standard deviation from 1.7% to 4.6%. The results showed that the method is simple，fast and accurate， and could be applied on content determination of patulin in the hawthorn tablets.

UFLC-MS/MS； patulin； haw flakes

R917

A

1674-2060（2016）02-0016-03

趙紅磊（1985-），男，工程師，主要從事食品檢驗(yàn)方面的研究。