C反應(yīng)蛋白對大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞參與血管形成的影響

朱智 劉勇 何延政

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院血管甲狀腺外科 四川瀘州 646000）

C反應(yīng)蛋白對大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞參與血管形成的影響

朱智 劉勇 何延政

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院血管甲狀腺外科 四川瀘州 646000）

目的：析CRP對大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞參與血管形成的影響，同時剖析其在動脈粥樣硬化病中的作用機制。方法：密度梯度離心法制作好的大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞，標記、凝聚雙染后在共聚焦顯微鏡下觀察分析。將細胞與不同濃度C反應(yīng)蛋白一起培養(yǎng)，建立體外血管形成模型，觀察C反應(yīng)蛋白對內(nèi)皮祖細胞活性和形成能力的影響，并檢測其他相關(guān)指標。結(jié)果：四組比較，當C反應(yīng)蛋白濃度升高時，10mg/L組的OD490增值數(shù)、管腔數(shù)以及滲入細胞數(shù)，明顯低于其他三組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：CRP在一定程度上可起到減弱內(nèi)祖皮細胞活性與形成能力的雙重作用，并導(dǎo)致動脈粥樣硬化類疾病在短時間內(nèi)實現(xiàn)進一步發(fā)展。

C反應(yīng)蛋白 大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞 影響 密度梯度離心法

1 一般資料與方法

1.1 一般材料

實驗對象 SD大鼠，其體質(zhì)量在100至120克的范圍之內(nèi)，平均（109.4±3.7）克，提供機構(gòu)為：瀘州醫(yī)學院醫(yī)學動物實驗室。

實驗試劑 （1）Cascade Biologics有限責任公司提供：大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞；M200培養(yǎng)液；LSGS。（2）Molecular Probes 有限公司提供：乙?；兔芏戎鞍住＃?）天津灝洋生物制品集團提供：大鼠淋巴細胞分離液。（4）Sigma公司提供：噻唑藍；CRP；DAPI染色液；DMSO；胰蛋白酶。（5）天津生物化學制品廠提供：胎牛血清。（6）Santa Cruz集團提供：Bax；VEGF兔抗大鼠多克隆抗體；Bcal-2；整合素β 2。（7）Gibco集團提供：DMEM培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 分離并培養(yǎng)內(nèi)皮組細胞［1］

借助乙醚，對實驗大鼠進行麻醉，然后于無菌環(huán)境下，取其脛骨以及股骨。把脛骨以及股骨兩端規(guī)范化的剪開，以將髓腔充分暴露出來。選取無菌注射器，同時抽取PBS藥液，20ku/L，對骨髓腔實施沖洗操作。取骨髓細胞懸液，并實施過濾。此后，以1000轉(zhuǎn)/分的速率，對過濾液進行離心。濾去上清液，同時應(yīng)用PBS，制作全新的骨髓細胞懸液。按照2：1的原則，將懸液滴入大鼠淋巴細胞分離液中，然后再以2000轉(zhuǎn)/分的速率，離心25分鐘。于管壁周緣，吸取適量白膜層細胞，并將其置入離心管內(nèi)；向管中加入一定量的PBS，以充分洗滌細胞。取M200培養(yǎng)液，并將其制作成實驗所需的細胞懸液。按照106/ cm2的規(guī)格，向培養(yǎng)瓶中實施接種操作。接種完畢后，將培養(yǎng)瓶放于孵育箱中（溫度：37攝氏度；CO2濃度：5%）。1日后，取出，并將其轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)瓶中。連續(xù)培養(yǎng)3日，以除去成熟的血小板以及內(nèi)皮細胞。此后，換液，并繼續(xù)培養(yǎng)3日。將經(jīng)過7日培養(yǎng)的細胞當作最終的鑒定目標。

1.2.2 鑒定［2］

取乙?；兔芏戎鞍?，2.4毫克/升，并于37攝氏度的恒溫條件下，對鑒定細胞進行為期2小時的孵育。借助多聚甲醛，對細胞進行固定，維持10分鐘。此后，利用PBS，對細胞實施洗滌操作。洗滌完成后，加入一定量的植物凝集素，并將其置于室溫下，進行為期1小時的孵育。待雙重熒光染色成功之后，利用顯微鏡，對其進行全面的觀察。

1.3 分組

實驗開始前，取適量DMEM培養(yǎng)液，對細胞進行連續(xù)2小時的培養(yǎng)。本次研究的分組標準為：（1）CRP組。按照濃度的不同，將其分為3組：1mg/L組；5mg/L組；10mg/L組。（2）對照組。不含DMEM培養(yǎng)液。

1.4 體外模型構(gòu)建［3］

借助DAPI染色液，對經(jīng)過CRP處理的EPC進行標記；取適量胰蛋白酶，對大鼠骨髓CMEC以及EPC進行消化處理，并按照兩者4：1的原則，制作混合細胞懸液。將已經(jīng)制作好的懸液接種于24孔板內(nèi)。利用顯微鏡對培養(yǎng)細胞進行觀察。統(tǒng)計C M E C管腔中含有的EPC數(shù)量。

1.5 活性檢測［4］

按照上述步驟，消化并采集貼壁細胞。取DMEM培養(yǎng)液，并將其制作成細胞懸液，然后再將懸液進行接種。貼壁完成后，更換培養(yǎng)液（未加入胎牛血清），并向其中加入適量不同濃度的CRP。維持1日。CRP組，均設(shè)置3個平行孔。

實施檢測前，加入MTT，5克/升，并置于37攝氏度環(huán)境下孵育4小時。吸除培養(yǎng)液，同時加入DMSO，150微升。充分混合后，利用免疫檢測儀，對其實施OD490檢測。

1.6 內(nèi)祖皮細胞形成能力檢測

采集貼壁細胞，將其接種于24孔板內(nèi)，并加入適量不同濃度的CRP。培養(yǎng)1日后，借助顯微鏡，對其實施管腔計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析

本次調(diào)查的所有數(shù)據(jù)均以SPSS 20.0 軟件，對其進行分析與研究，比較以t作為檢驗標準；計數(shù)資料的比較經(jīng)x2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

表1 四組檢測結(jié)果的對比分析表 ［n，（%）］

2 結(jié)果

2.1 鑒定結(jié)果分析

連續(xù)培養(yǎng)7日后，于顯微鏡下能看到多個貼壁細胞集落，其中心細胞呈圓形，且沿“中心-四周”路徑，細胞主要以梭形狀存在，這一情況和胚胎時期所形成的血島具有一定的相似性。經(jīng)過雙重熒光染色后，在顯微鏡下能觀測到：細胞不僅可以對ac-LDL進行吞噬，同時也能與UEA-l相結(jié)合。此時，細胞可被判定為：正處于分化過程中的EP C。

2.2 活性檢測結(jié)果分析

CRP組與對照組相比：10mg/L組內(nèi)皮祖細胞的活性最弱，對照組活性最強，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示：CRP濃度越高，其減弱大鼠骨髓EPC活性的能力越強。檢測結(jié)果，詳見表1。

2.3 形成能力檢測結(jié)果分析

四組管腔形成數(shù)比較，10mg/L組最少，對照組最多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示：CRP濃度越高，其阻滯大鼠骨髓EPC形成管腔數(shù)的能力越強。

3 討論

現(xiàn)階段，“As炎癥學說［5］”在臨床醫(yī)學界已經(jīng)確立，而C反應(yīng)蛋白也成為了心血管類疾病預(yù)后效果的判定以及預(yù)測因子，其除了具備較強的敏感性與獨立性之外，還能通過對相關(guān)細胞（主要為：平滑肌細胞；內(nèi)皮細胞）進行刺激的方式，來達到促使病變進一步發(fā)展的目的。有資料，顯示：當人體組織中的C反應(yīng)蛋白濃度在1至3毫克/升的范圍之內(nèi)時，可將其判定為：中度危險因素；當C反應(yīng)蛋白濃度超過3毫克/升時，可將其判定為：重度危險因素。

近年來，隨著醫(yī)學專家對CRP的進一步的研究，我們對其有了更多的認識，具體表現(xiàn)為：CRP［6］除了具備加快內(nèi)皮細胞凋亡速度的作用之外，還同時兼具如下幾個特點：1）利于核因子在人體組織中的表達；2）利于血管平滑肌細胞合成ROS；3）可阻滯血管新生；4）能通過刺激反應(yīng)，使平滑肌實現(xiàn)大量增值以及遷移的效果；5）可加快血管新內(nèi)膜形成的速度。

因心血管類疾病的發(fā)生，使得機體組織受損，并打破了內(nèi)皮損傷與修復(fù)這兩者之間的平衡，使得患者病情難以得到較好的控制。對此，諸多醫(yī)學專家作出了這樣的一個推測，即：可否利用C反應(yīng)蛋白，實現(xiàn)降低EPC功能活性的效果，以通過抑制血管再生修復(fù)能力的方式，達到加快缺血性疾病發(fā)展速度的這一目的。有研究，表明：C反應(yīng)蛋白在EPC（前提條件：已經(jīng)通過VEGF誘導(dǎo)）中可表現(xiàn)出較強的抑制能力。由此可見，C反應(yīng)蛋白的合理應(yīng)用，可起到抑制EPC遷移的作用。此外，C反應(yīng)蛋白也可通過另外一種機制（即：下調(diào)eNOS表達），來達到降低EPC形成與存活能力的目的。

本次研究的結(jié)果，充分表明：C反應(yīng)蛋白濃度越高，CRP組的內(nèi)祖皮活性以及形成能力越弱。組間差異明顯，具有統(tǒng)計學意義（P＜0. 05）。

綜上所述，C反應(yīng)蛋白［7］在人體功能組織中發(fā)揮著較強的作用，具體表現(xiàn)在兩方面上：1）可使血管內(nèi)皮細胞功能出現(xiàn)紊亂癥狀；2）能大大降低EPC功能活性，讓血管再生修復(fù)機制受阻，利于缺血性疾病的進一步發(fā)展。故，我們可利用C反應(yīng)蛋白，對動脈粥樣硬化類疾病進行有效的防治。

［1］趙薇，楊向紅.C反應(yīng)蛋白對大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞參與血管形成的影響［J］.中國動脈硬化雜志，2011，19（2）：105-109.

［2］肖暖.血管內(nèi)皮祖細胞的分離培養(yǎng)分化及其高血壓病的相關(guān)性研究［D］.河北醫(yī)科大學，2014.

［3］陳愛華，何非，程婧等.C反應(yīng)蛋白對人外周血來源內(nèi)皮祖細胞Notch信號通路表達影響的實驗研究［J］.南方醫(yī)科大學學報，2012，32（2）：239-242.

［4］程何祥，許旭東，張榮慶等.恒磁場對C-反應(yīng)蛋白作用下大鼠內(nèi)皮祖細胞增殖、凋亡及一氧化氮分泌的影響［J］.中華物理醫(yī)學與康復(fù)雜志，2009，31（2）：88-90.

［5］何晉，陳曉彬，鄭昭芬等.C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)外周血內(nèi)皮祖細胞衰老及非諾貝特的保護作用［J］.中國動脈硬化雜志，2012，20（1）：42-46.

［6］何晉，陳曉彬，鄭昭芬等.非諾貝特對C-反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的外周血內(nèi)皮祖細胞損傷的保護作用［J］.醫(yī)學臨床研究，2011，28（5）：853-856.

［7］哈小琴，他維瑋，彭俊華等.外周血內(nèi)皮祖細胞預(yù)測重癥急性胰腺炎意義的研究［J］.國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，33（20）：2446-2449.

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A

1674-2060（2016）02-0119-02

何延政