人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法驗證及應用

劉曉薇謝一舟盧奎林陳品全黃潔朱席德慧

（1.四川大學生命科學學院 四川成都 610064；2.成都蓉生藥業(yè)有限責任公司 四川成都 610065）

人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法驗證及應用

劉曉薇1，2謝一舟2盧奎林2陳品全2黃潔2朱2席德慧1*

（1.四川大學生命科學學院 四川成都 610064；2.成都蓉生藥業(yè)有限責任公司 四川成都 610065）

本文參照藥品質量標準分析方法驗證指導原則， 在驗證中對專屬性、線性、準確度、中間精密度、重復性和范圍6個參數進行確認，以考察成都蓉生藥業(yè)有限公司新建立的人抗凝血酶Ⅲ（Antithrombin III， ATIII）效價檢測方法是否符合要求。通過驗證，人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法在專屬性、線性、準確度、中間精密度、重復性和范圍6個方面均符合要求，因此此方法可用于成都蓉生藥業(yè)有限公司人抗凝血酶Ⅲ效價檢測。通過驗證確認人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法的檢測范圍是0.0057-0.0130IU/ml。

人抗凝血酶Ⅲ 效價

人抗凝血酶III屬于血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serine Protase Inhibitors， Serpins）。是血漿生理性抑制物中最重要的抗凝物，其抗凝作用大約占體內總抗凝作用的70%。在血漿中，ATIII通過與FXa、FIIa等活化凝血因子（酶形式）形成共價復合物，導致其酶活性失活，起到抑制凝血因子酶活性的作用，防止血栓的形成，從而起到調節(jié)血凝平衡的作用。ATIII自上世紀80年代應用于臨床以來已成為臨床急救用藥，可用于ATIII遺傳性缺陷患者在懷孕、分娩及大手術前以預防血栓發(fā)生，也可用于重癥感染患者、彌撒性血管內凝血患者等獲得性ATIII缺乏患者的緊急治療。

根據藥品質量標準分析方法驗證指導原則，在對藥品分析方法展開的驗證內容一般包括：專屬性、準確度、精密度（涵蓋三類：重復性、中間精密度以及重現(xiàn)性）、耐用性、線性、檢測限、定量線以及范圍［1］。在驗證實施時可依據實際情況對驗證的內容進行設定［2］。

本文介紹了對成都蓉生藥業(yè)有限公司新建立的人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法的驗證及其應用。所驗證的方法是：將供試品中加入過量凝血酶，使抗凝血酶與凝血酶形成1：1復合物，剩余的凝血酶作用于發(fā)色底物S-2238，釋出顯色基團對硝基苯胺（PNA）。顯色的深淺與剩余凝血酶呈正相關，而與人抗凝血酶Ⅲ呈負相關，根據樣品吸光度值，從標準曲線中計算出人抗凝血酶Ⅲ的活性。

1 材料與設備

蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ復溶血漿、S-2238試劑、肝素鈉試劑、人抗凝血酶試劑、牛血清蛋白試劑、純化水、人抗凝血酶成品、甘氨酸、枸櫞酸。50-200ul單通道移液器（芬蘭雷柏）、100-1000ul單通道移液器（芬蘭雷柏）、萬分之一分析天平（梅特勒-托利多）、恒溫水浴箱（精宏）、Power Wave TM XS2酶標儀（Bio-Tek）。

2 實驗方法

人抗凝血酶Ⅲ效價檢測驗證方案。

2.1.1 專屬性確認

測定次數 　預估值（I U / m l） 　檢測值（I U / m l） 　回收率（%） 　可接受標準1 　1 . 1 0 　1 . 0 3 　9 3 . 9 2 　1 . 1 0 　1 . 0 3 　9 3 . 9 3 　1 . 1 0 　1 . 0 5 　9 5 . 4 4 　1 . 1 0 　1 . 0 4 　9 4 . 6 5 　1 . 1 0 　1 . 0 5 　9 5 . 6 6 　1 . 1 0 　1 . 0 5 　9 5 . 6 7 　1 . 1 0 　1 . 0 7 　9 7 . 2回收率為8 5 % -1 1 5 % 8 　1 . 1 0 　1 . 0 3 　9 3 . 5 9 　1 . 1 0 　1 . 0 5 　9 5 . 6 1 0 　1 . 1 0 　1 . 0 1 　9 1 . 6 1 1 　1 . 1 0 　0 . 9 9 　8 9 . 8 1 2 　1 . 1 0 　0 . 9 9 　8 9 . 8

配制濃度（I U / m l） 　0 . 0 0 5 7（I U / m l） 　0 . 0 0 6 7（I U / m l） 　0 . 0 0 8 0（I U / m l） 　0 . 0 1 0 0（I U / m l） 　0 . 0 1 3 0（I U / m l）標準溶液相關系數r2　可接受標準試驗次數 　O D值1 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 3 　0 . 0 0 7 8 　0 . 0 0 9 9 　0 . 0 1 2 3 　0 . 9 9 7 2 　0 . 0 0 5 5 　0 . 0 0 6 2 　0 . 0 0 8 1 　0 . 0 0 9 5 　0 . 0 1 1 9 　0 . 9 8 7 r2≥0 . 9 8 0 0 3 　0 . 0 0 5 3 　0 . 0 0 6 8 　0 . 0 0 8 0 　0 . 0 1 0 0 　0 . 0 1 3 3 　0 . 9 9 7配制濃度（I U / m l） 　0 . 0 0 5 7（I U / m l） 　0 . 0 0 6 7（I U / m l） 　0 . 0 0 8 0（I U / m l） 　0 . 0 1 0 0（I U / m l） 　0 . 0 1 3 0（I U / m l）樣品實測相關系數r2　可接受標準試驗次數 　O D值1 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 3 　0 . 0 0 7 8 　0 . 0 0 9 9 　0 . 0 1 2 3 　0 . 9 9 0 2 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 8 　0 . 0 0 7 9 　0 . 0 1 0 0 　0 . 0 1 2 8 　0 . 9 9 0 r2≥0 . 9 8 0 0 3 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 0 　0 . 0 0 7 2 　0 . 0 0 9 2 　0 . 0 1 1 0 　0 . 9 8 7試驗次數 　0 . 0 0 5 7（I U / m l） 　0 . 0 0 6 7（I U / m l） 　0 . 0 0 8 0（I U / m l） 　0 . 0 1 0 0（I U / m l） 　0 . 0 1 3 0（I U / m l） 　　相關系數r 　　可接受標準樣品實測效價相關系數r 1 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 3 　0 . 0 0 7 8 　0 . 0 0 9 9 　0 . 0 1 2 3 　0 . 9 9 0 2 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 8 　0 . 0 0 7 9 　0 . 0 1 0 0 　0 . 0 1 2 8 　0 . 9 9 5 r≥0 . 9 8 0 0 3 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 0 　0 . 0 0 7 2 　0 . 0 0 9 2 　0 . 0 1 1 8 　0 . 9 8 9測定次數 　0 . 0 0 5 5 I U / m l 　0 . 0 0 6 7 I U / m l 　0 . 0 1 7 0 I U / m l 　　可接受標準樣品實測回收率（%）1 　1 0 5 . 3 　9 6 . 4 　1 0 4 . 3 2 　1 1 1 . 8 　1 0 5 . 7 　9 9 . 4回收率為8 5 % -1 1 5 % 3 　1 1 0 . 8 　1 0 3 . 7 　1 0 1 . 8

樣品濃度（I U / m l） 　0 . 0 0 5 5 　0 . 0 0 6 7 　0 . 0 1 7 0檢測結果（I U / m l） 　0 . 0 0 5 8 　0 . 0 0 6 1 　0 . 0 0 6 1 　0 . 0 0 6 4 　0 . 0 0 7 1 　0 . 0 0 6 9 　0 . 0 1 7 7 　0 . 0 1 6 9 　0 . 0 1 7 3平均值 　0 . 0 0 6 0 　0 . 0 0 6 8 　0 . 0 1 7 0 S D 　0 . 0 0 0 1 9 　0 . 0 0 0 3 3 　0 . 0 0 0 4 1 R S D（%） 　3 . 2 　4 . 8 　2 . 4試驗日期 　2 0 1 4 -0 9 -1 4 　2 0 1 4 -0 9 -1 5 　2 0 1 4 -0 9 -1 6 　2 0 1 4 -0 9 -1 7 　2 0 1 4 -0 9 -1 8 　2 0 1 4 -0 9 -1 9試驗結果（I U / m l） 　　檢測員B 　5 7 . 8 　5 5 . 0 　5 7 . 8 　5 7 . 8 　5 7 . 7 　5 6 . 3檢測員A 　5 6 . 7 　5 6 . 3 　5 9 . 6 　5 7 . 0 　5 7 . 5 　5 6 . 4 1 2次數據R S D 　2 . 0 %方差分析（F檢驗） 　　日期因素 　F值 　0 . 1 2 2 7 0 3 　P值 　0 . 7 4人員因素 　F值 　3 . 1 7 3 8 4 6 　P值 　0 . 1 2可接受標準 　　人員和日期兩因素在α = 0 . 0 5水平上均對方法精密度無顯著性影響（P＞0 . 0 5）R S D≤1 0 . 0 %線性確認結果樣品實測效價（I U / m l） 　0 . 0 0 5 7 　0 . 0 0 6 7 　0 . 0 0 8 0 　0 . 0 1 0 0 　0 . 0 1 3 0線性相關系數r2　0 . 9 9 1準確度確認結果樣品實測效價（I U / m l） 　0 . 0 0 5 5 　0 . 0 0 6 7 　0 . 0 1 7 0準確度/回收率（%） 　1 0 4 . 2重復性確認結果樣品實測效價（I U / m l） 　0 . 0 0 5 5 　0 . 0 0 6 7 　0 . 0 1 7 0 R S D值（%） 　3 . 5

將人抗凝血酶Ⅲ成品效價配制為1.1IU/ml，與理論效價值為1.1IU/ml的蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ復溶血漿配制成1：1溶液，得到混合樣品。檢測混合樣品的人抗凝血酶Ⅲ效價并計算回收率。確認用酶標儀測定人抗凝血酶Ⅲ效價是否受到配制原液的基質干擾?；旌蠘悠返娜丝鼓涪笮r回收率范圍應在85%～115%。

2.1.2 線性確認

用純化水將蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ復溶血漿配制成效價為0. 005、0.0057、0.0067、0.008、0.01IU/ml的溶液；另用純化水將人抗凝血酶Ⅲ樣品配制成各因子效價為0.005、0.0057、0.0067、0.008、0. 01IU/ml的溶液。對上述樣品進行3次檢測。確認蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ復溶血漿和人抗凝血酶Ⅲ樣品配制濃度與檢測OD值是否成線性關系。蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ復溶血漿和人抗凝血酶Ⅲ樣品線性回歸系數r2≥0.9800。

2.1.3 準確性確認

將人抗凝血酶Ⅲ樣品配制成效價為0.005、0.0067、0.01IU/ml的溶液，對樣品進行3次檢測。計算回收率。確認人抗凝血酶Ⅲ樣品的準確度是否符合要求?；厥章蕬獮?5%～1115%。

2.1.4 重復性確認

將人抗凝血酶Ⅲ樣品配制成效價為0.005、0.0067、0.01IU/ml的溶液，對樣品進行3次檢測。計算每個濃度三個結果的RSD。確認由同一分析人員在同樣的操作條件下，在較短時間間隔內所得測定結果之間的精密度是否達到可接受標準要求?？山邮軜藴蕿镽SD≤15.0%。

2.1.5 中間精密度確認

取人抗凝血酶Ⅲ樣品，由不同的人員對人抗凝血酶Ⅲ的效價進行檢測。共檢測6次，每天一次。取2人總共12次測定結果計算其相對標準偏差（RSD）。對測定結果進行方差分析，對人員和日期兩因素進行F檢驗。確認在不同分析人員和不同日期兩種因素影響下測定同一樣品時，兩分析人員在不同日期測定結果的精密度是否達到可接受標準。兩位分析人員的測定結果相互符合的程度是否達到可接受標準要求，不同日期的檢測結果相互符合程度是否達到可接受標準。 可接受標準為（1）RSD≤15.0%；（2）經F檢驗后，人員和日期兩因素在α=0.05水平上均對方法精密度無顯著性影響（P＞0.05）。

2.1.6 范圍確認

根據以上線性，重復性和準確性的試驗結果，就可推論出該檢測方法能夠測定的人抗凝血酶Ⅲ效價的區(qū)間。滿足線性r≥0.98，回收率應為85%～115%，重復性RSD≤15.0%的人抗凝血酶Ⅲ效價的最高值和最低值之間的區(qū)間即為該檢測方法的范圍。

3 實驗結果

3.1.1專屬性確認

3.1.2 線性確認

2.1.3 準確性確認

2.1.4 重復性確認

2.1.5 中間精密度確認

人員和日期兩因素在α=0.05水平上均對方法精密度無顯著性影響（P＞0.05）

2.1.6 范圍確認

驗證結果：該方法的檢測范圍為：0.0057-0.0130IU/ml。

4 討論

本文的總體思路是對成都蓉生藥業(yè)有限公司新建立的人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法展開驗證，確定是否適用于本實驗室新產品活性檢測。由于在人抗凝血酶Ⅲ成品中添加甘氨酸作為穩(wěn)定劑，在專屬性檢測中考察了它是否會干擾該方法的測定。通過驗證結果得知該方法的檢測范圍是0.0057-0.0130IU/ml，可給予其他實驗室的方法驗證和設計提供一個參考，同時獲得了產品驗證過程中涉及的一系列參數，從而保證結果的穩(wěn)定和有效，對人抗凝血酶Ⅲ成品的工藝研究提供可靠的數據支撐，讓更多人抗凝血酶Ⅲ缺乏病患能夠得到一定治療。

驗證開始需要對使用的計量器具的校驗有效日期進行驗證，這直接關系到整個實驗結構是否具備有效性。今后還需要進一步探討各種人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法的優(yōu)缺點，建立新的實驗方案和設計，選擇于本實驗室條件下效果最優(yōu)的。參考文獻

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R917

A

1674-2060（2016）02-0169-02

劉曉薇（1987—），女，漢族，四川成都人，?，F(xiàn)從事于血液制品行業(yè)，就職于成都蓉生藥業(yè)有限責任公司，具有7年的生產工作經驗，同時為四川大學生命科學學院2012級在職研究生。