李 敏 袁桂平

（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

·證治探討·

內熱針聯(lián)合臭氧穴位注射介入治療家兔膝骨關節(jié)炎的實驗研究*

李 敏 袁桂平△

（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

目的 觀察內熱針聯(lián)合臭氧注射“內外膝眼、梁丘”介入治療對家兔膝骨關節(jié)炎（KOA）的影響。方法32只家兔隨機分為模型組、內熱針組、臭氧組和內熱針+臭氧組4組，每組8只。采用弗氏完全佐劑注射家兔前右肢膝關節(jié)腔制備KOA模型；成模后內熱針組取“內外膝眼、梁丘、陽陵泉、鶴頂、足三里、血?！钡戎T穴內熱針治療，臭氧組膝取 “內外膝眼、梁丘”小劑量注射臭氧；內熱針+臭氧組為內熱針組和臭氧組的治療方法；用表面肌電圖儀錄股內側?。╲M）和股外側?。╲L）肌電信號并計算vM/vL達峰值時限差值（ΔTBP），記錄家兔坐骨神經(jīng)閾刺激、最大刺激和傳導速度；檢測家兔關節(jié)積液中透明質酸（HA）、白細胞介素-1β（IL-1β）及基質金屬蛋白酶（MMPs）表達。結果 治療后模型組家兔坐骨神經(jīng)閾刺激、最大刺激閾值和傳導速度與治療前比較未見升高（P＞0.05）。內熱針組、臭氧組和內熱針+臭氧組閾刺激與治療前比較均升高（均P＜0.05）。內熱針組閾刺激和臭氧組比較差別不大（P＞0.05）。內熱針+臭氧組閾刺激與同組治療前比較升高（P＜0.05），且與模型組、內熱針組和臭氧組比較升高明顯（均P＜0.05）。4組坐骨神經(jīng)傳導速度和最大刺激閾值與治療前比較差別不大，且治療后各組比較差別不大（均P＞0.05）。模型組vM、vL和ΔTBP與治療前比較無明顯變化（均P＞0.05）。內熱針組、臭氧組和內熱針+臭氧組vM、vL與治療前比較均升高，而ΔTBP降低（均P＜0.05）。內熱針組M、vL和ΔTBP與臭氧組比較差別不大 （均P＞0.05）。內熱針+臭氧組vM、vL與治療前比較升高，而ΔTBP降低（均P＜0.05），且優(yōu)于模型組、內熱針組和臭氧組（均P＜0.05）。模型組IL-1β和HA與治療前比較無明顯變化（P＞0.05）。內熱針組、臭氧組和內熱針+臭氧組與治療前比較，IL-1β含量均下降，HA含量均增加（均P＜0.05）。臭氧組IL-1β降低和HA升高幅度均大于內熱針組（P＜0.05）。內熱針+臭氧組IL-1β和HA與同組治療前比較IL-1β含量下降，HA含量增加（P＜0.05），且優(yōu)于模型組、內熱針組和臭氧組（P＜0.05）。模型組和內熱針組家兔血清MMPs與同組治療前比較無明顯變化（均P＞0.05）。臭氧組MMP-2和MMP-10與治療前比較低表達（P＜0.05），且優(yōu)于模型組（P＜0.05）。內熱針+臭氧組MMP-2和MMP-10與治療前比較均降低（P＜0.05），且優(yōu)于模型組和內熱針組（均P＜0.05），但與臭氧組、模型組比較差別不大（P＞0.05）。結論內熱針刺激可祛寒除濕、降低IL-1β造成的局部炎癥反應，并糾正患肢肌電以降低痛閾，臭氧穴位注射介入治療可抑制MMPs對關節(jié)組織細胞外基質降解、提高HA分泌，兩者具有明顯協(xié)同治療作用。

KOA模型 家兔 內熱針 臭氧 ΔTBP 肌電信號

膝骨性關節(jié)炎（KOA）是導致生活質量下降的常見病和多發(fā)病，屬中醫(yī)學“筋痹”“骨痹”范疇［1］。KOA按病因可分為原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性KOA的病因可能與機械性和生物性等因素的相互作用造成關節(jié)軟骨細胞、基質和軟骨合成和降解失衡，骨贅形成有關。繼發(fā)性KOA則多與關節(jié)外傷、代謝病、類風濕病等內分泌失衡等有關［2］。兩類KOA多隨膝骨關節(jié)面滑膜毛細血管擴張和通透性增大，最終因關節(jié)腔內組織液大量滲出而形成關節(jié)積液［3］。本研究采取內熱針配合臭氧注射穴位介入治療家兔KOA，研究治療KOA的鎮(zhèn)痛消炎的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 家兔32只，體質量1.8～2.2 kg，雌雄各半，由十堰太和醫(yī)院實驗中心提供［SCXK（鄂）2014-0008］。

1.2 儀器與試劑 表面肌電圖儀 （美國Noraxon生產）；BL-420生物信號記錄系統(tǒng)（成都泰盟生產）。臭氧（太和醫(yī)院制劑室提供）；弗氏完全佐劑（上海實生細胞生物技術有限公司提供）；MMPs測試盒 （上海森雄科技實業(yè)有限公司提供）。

1.3 造模 將弗氏完全佐劑1周內分3次注人家兔右膝關節(jié)腔，每次注射0.1 mL。注射后根據(jù)超疲勞可導致KOA發(fā)病的臨床特點，每日強迫動物活動60 min［4］。成模標準:2周后家兔出現(xiàn)右膝局部軟組織紅腫、關節(jié)僵硬跛行，關節(jié)腔可抽出積液，且積液檢查出現(xiàn)HA降低和IL-1β明顯高于正常值［5］。出現(xiàn)以上體癥即可確定KOA造模成功。

1.4 治療方法 家兔隨機均分為模型組、內熱針組、臭氧組和內熱針+臭氧組4組，每組8只。模型組動物每日僅做消毒處理。內熱針組，將家兔固定于家兔固定器，取“內外膝眼、梁丘、陽陵泉、鶴頂、足三里、血?！钡戎T穴由內向外斜刺2 cm，刺入骨膜后，接NRZ-16R-E型內熱針治療儀，參數(shù):針體溫度40～60℃，留針加熱28 min，每日1次，14 d為1個療程。臭氧組于“內外膝眼、梁丘”各注射臭氧0.1 mL，每隔日1次，注射7次為1個療程。內熱針+臭氧組治療方法同內熱針組和臭氧組，療程同前。

1.5 觀察指標 從家兔耳緣靜脈取血，采用PCR法測定治療前后MMP-2、MMP-10表達［5］；治抽取各組動物關節(jié)腔積液，HA采用放免試劑盒檢測，IL-1β采用ELISA法檢測［6］。用表面肌電圖儀錄股內側?。╲M）和股外側?。╲L）肌電信號并計算vM/vL達峰值時限差值（ΔTBP）［7］。BL-420生物信號記錄系統(tǒng)記錄治療前后記錄家兔坐骨神經(jīng)閾刺激、最大刺激閾值和傳導速度。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析對和組指標進行比較，組間差異采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組治療前后家兔坐骨神經(jīng)閾刺激、最大刺激閾值和傳導速度比較 見表1。治療后模型組家兔坐骨神經(jīng)閾刺激、最大刺激閾值和傳導速度與治療前比較未見升高（P＞0.05）。內熱針組、臭氧組和內熱針+臭氧組閾刺激與治療前比較均升高（均P＜0.05）。內熱針組閾刺激和臭氧組比較差別不大（P＞0.05）。內熱針+臭氧組閾刺激與同組治療前比較升高（P＜0.05），且與模型組、內熱針組和臭氧組比較升高明顯（均P＜0.05）。各組坐骨神經(jīng)傳導速度和最大刺激閾值與治療前比較差別不大，且治療后各組比較差別不大（均P＞0.05）。

表1 各組家兔治療前后閾刺激、最大刺激閾值和傳導速度比較（±s）

表1 各組家兔治療前后閾刺激、最大刺激閾值和傳導速度比較（±s）

與本組治療前比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與內熱針組比較，#P＜0.05；與臭氧組比較，▲P＜0.05。下同。

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2.2 各組家兔治療前后vM、vL肌電信號及ΔTBP比較 見表2。治療后，模型組vM、vL和ΔTBP與治療前比較無明顯變化（均P＞0.05）。內熱針組、臭氧組和內熱針+臭氧組vM、vL與治療前比較均升高，而ΔTBP降低（均P＜0.05）。內熱針組M、vL和ΔTBP與臭氧組比較差別不大（均P＞0.05）。內熱針+臭氧組vM、vL與治療前比較升高，而ΔTBP降低（均P＜0.05），且優(yōu)于模型組、內熱針組和臭氧組（均P＜0.05）。

表2 各組家兔治療前后vM、vL和ΔTBP比較（±s）

表2 各組家兔治療前后vM、vL和ΔTBP比較（±s）

組別 時間 ΔTBP模型組 治療前 7.71±0.25（n＝8） 治療后 6.79±0.12內熱針組 治療前 7.35±0.26 vM（μV） vL（μV）215.15±21.78 152.93±7.66 210.35±23.12 147.58±9.21 213.74±25.07 150.41±9.62（n＝8） 治療后 3.71±0.24*△286.31±31.70*△175.23±11.01*△臭氧組 治療前 210.93±23.53 151.44±7.97 7.29±0.23（n＝8） 治療后 279.45±27.19*△177.50±12.21*△3.08±0.12*△內熱針+臭氧組 治療前 215.27±26.40 153.02±8.75 7.60±0.25（n＝8） 治療后 312.71±35.68*△#▲191.76±21.52*△#▲1.96±0.10*△#▲

2.3 各組家兔治療前后HA和IL-1β水平比較 見表3。治療后，模型組IL-1β和HA與治療前比較無明顯變化（P＞0.05）。內熱針組、臭氧組和內熱針+臭氧組與治療前比較，IL-1β含量均下降，HA含量均增加（均P＜0.05）。臭氧組IL-1β降低和HA升高幅度均大于內熱針組（P＜0.05）。內熱針+臭氧組IL-1β和HA與同組治療前比較IL-1β含量下降，HA含量增加 （P＜0.05），且優(yōu)于模型組、內熱針組和臭氧組（P＜0.05）。

表3 各組家兔治療前后IL-1β和HA水平比較（±s）

表3 各組家兔治療前后IL-1β和HA水平比較（±s）

IL-1β（pg/mL） HA（μg/L）72.33±9.24 4.71±0.27 79.51±10.12 4.01±0.25 70.45±7.46 4.79±0.24（n＝8） 治療后 54.04±7.13*△6.72±0.35*△臭氧組 治療前 71.72±7.52 4.53±0.29（n＝8） 治療后 41.52±6.73*△#8.03±0.40*△#內熱針+臭氧組 治療前 70.58±8.73 4.64±0.22（n＝8） 治療后 32.43±5.28*△#▲10.73±0.57*△#▲組別 時間模型組 治療前（n＝8） 治療后內熱針組 治療前

2.4 各組家兔血清基質金屬蛋白酶水平比較 見表4。模型組和內熱針組家兔血清MMPs與同組治療前比較無明顯變化（均P＞0.05）。臭氧組MMP-2和MMP-10與治療前比較低表達（P＜0.05），且優(yōu)于模型組（P＜0.05）。內熱針+臭氧組MMP-2和MMP-10與治療前比較均降低（P＜0.05），且優(yōu)于模型組和內熱針組（均P＜0.05），但與臭氧組模型組比較差別不大（P＞0.05）。

表4 各組家兔血清基質金屬蛋白酶比較（ng/L，±s）

表4 各組家兔血清基質金屬蛋白酶比較（ng/L，±s）

MMP-1 MMP-2 90.21±7.72 85.26±9.14 92.12±8.32 87.21±9.27 89.72±8.13 86.27±7.02（n＝8） 治療后 90.23±7.24 88.93±9.35臭氧組 治療前 91.71±9.22 86.03±7.65（n＝8） 治療后 90.80±6.81 70.25±7.96*△內熱針+臭氧組 治療前 90.22±8.53 85.55±7.81（n＝8） 治療后 89.87±9.85 67.29±7.92*△#組別 時間模型組 治療前（n＝8） 治療后內熱針組 治療前MMP-9 MMP-10 70.22±7.24 75.02±5.93 73.72±7.21 78.38±8.04 73.17±6.99 73.95±8.30 71.70±7.65 69.26±6.14 72.19±7.11 75.48±8.04 69.05±8.25 55.70±5.32*△71.22±6.53 73.59±6.90 68.37±9.02 51.12±6.27*△#

3 討 論

KOA病理改變以IL-1β對關節(jié)腔和滑膜的炎性浸潤并伴隨軟骨細胞外MMPs的病理性降解為主，常造成關節(jié)面軟骨破壞和關節(jié)腔內組織液大量滲出而成關節(jié)腔積液［8］。中醫(yī)學認為，KOA是膝關節(jié)局部血瘀氣滯，濕濁之氣痹阻于膝而致，故治宜“除痹利濕、舒筋通絡、行氣止痛、活血化瘀”［9］。

IL-1β在正常關節(jié)腔積液僅有少量分秘，當有KOA病理改變時，IL-1β會異常分秘。而HA可抑制KOA關節(jié)內IL-1β等造成的炎癥反應，潤滑關節(jié)并降低滑膜的通透性，從而減少關節(jié)內滲液造成的成關節(jié)腔積液［10］。本實驗內熱針+臭氧組在對“內外膝眼、梁丘、陽陵泉、鶴頂、足三里、血?！钡戎T穴進行內熱針后，利用內熱針對熱的傳導，將熱量導入病變組織深部來改善組織局部微循環(huán)、促進炎性因子的吸收，加速組織修復，故IL-1β降低［11］。而且內熱針可降低骨骼肌張力，使緊張的肌肉松弛，同時還可提高閾刺激，提高對疼痛刺激的敏感性［12］。內熱針+臭氧組在“內外膝眼、梁丘”注射臭氧后，臭氧作為強氧化劑，可直接作用于關節(jié)鄰近韌帶和周圍組織分布的神經(jīng)末梢，臭氧的強氧化作用造成IL-1β等致痛炎性因子失活，減少對神經(jīng)末梢的刺激，起到“化學針灸”的止痛效果。還可通過拮抗炎癥反應中的免疫因子釋放擴張血管、改善靜脈回流、減輕神經(jīng)根水腫及粘連達到抗炎作用［13］。由于IL-1β等致痛炎性因子失活，機體致痛炎性因子減少，故監(jiān)測到的vM、vL等肌電話活動均升高，ΔTBP降低。研究表明，基質降解的主要蛋白是MMP-2和MMP-10，其增高表達與KOA發(fā)生密切相關［14］。在通過臭氧穴位注射后，筆者觀察到內熱針+臭氧組關節(jié)積液中MMP-2和MMP-10的表達明顯降低，說明臭氧的強氧化作用在一定程度可以抑制MMP-2和MMP-10分泌。MMP-2和MMP-10減少可減輕其對關節(jié)組織細胞外基質的降解［15］，不可促使滑膜內襯B型滑膜細胞分泌HA，而HA可起到潤滑關節(jié)和保護關節(jié)作用［16］。總之，通過內熱針和臭氧治療后，內熱針+臭氧組vM、vL和閾刺激明顯提高，ΔTBP降低，關節(jié)液中IL-1β明顯降低、HA明顯提高，關節(jié)積液中MMP-2和MMP-10的表達明顯降低。

綜上，內熱針治療可改善組織局部微循環(huán)、促進炎性因子的吸收，提高機體對疼痛刺激的敏感性。臭氧的強氧化作用可起到抗炎止痛、抑制MMP-2和MMP-10分泌，提高HA分泌的作用。兩者相輔相成，可明顯提高治療效果，這對于臨床治療KOA有一定的指導意義。

［1］ 楊利，魏蓉，魏云，等.中藥外敷治療膝關節(jié)骨關節(jié)炎臨床觀察［J］.中國中醫(yī)急癥，2016，25（1）:120-121.

［2］ 宓軼群，陳一．溫針灸配合鹽酸氨基葡萄糖治療膝骨關節(jié)炎臨床研究［J］．上海針灸雜志，2013，32（11）:938-941．

［3］ 唐瑭，陳德森，李莉，等．通痹外敷膏聯(lián)合關節(jié)腔沖洗治療膝骨性關節(jié)炎合并積液的臨床研究［J］．國際中醫(yī)中藥雜志，2014，3（11）:213-216．

［4］ 顏梅，郭俐宏.激光針刀配合穴位注射威靈仙總皂苷對膝骨關節(jié)炎模型大鼠RF及PGE2的影響［J］.針灸臨床雜志，2015，31（12）:71-73.

［5］ 王國金，衛(wèi)小春，張志強，等．血清和關節(jié)液中基質金屬蛋白酶-3及其抑制因子-的檢測及臨床意義［J］．中華風濕病學雜志，2006，10（5）:311-315．

［6］ 鐘琴，劉正奇，安陽，等．苗藥痛風停湯對急性痛風性關節(jié)炎模型日本大耳白兔血清IL-8的影響［J］.風濕病與關節(jié)炎，2014，21（1）:16-18.

［7］ 薛靜，薛燕萍，梁英，等.髕股疼痛綜合征患者神經(jīng)肌電活動比率與Merchant匹配角的相關性［J］．中國康復醫(yī)學雜志，2015，30（3）:265-268.

［8］ 李特，李運曼，劉麗芳，等.威靈仙總皂苷抗類風濕性關節(jié)炎的作用機制［J］.中國醫(yī)科大學學報，2009，40（2）:157-160.

［9］ 陳才興，孫成長.中藥內外兼治合透明質酸鈉治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎［J］.浙江中西醫(yī)結合雜志，2006，16（7）:427-428.

［10］李敏，丁武華，李莉，等.電針后外敷威靈仙浸膏治療日本大耳白兔實驗性膝骨關節(jié)炎的研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2015，24（13）:1394-1396.

［11］吳群，沈玉杰，周曉霞，等.內熱針聯(lián)合氨基葡萄糖膠囊對膝骨性關節(jié)炎外周血中IL-1、IL-6表達的影響研究［J］．湖北中醫(yī)藥大學學報，2015，12（6）:33-35.

［12］溫莎，高謙，王剛，等.0．5 mm針徑內熱針密集針刺對家兔骨骼肌慢性損傷后肌張力的影響［J］．中國康復醫(yī)學雜志，2015，30（1）:31-34.

［13］張艷，陳鋒，吳松，等.臭氧穴位注射治療下腰痛臨床觀察［J］．中國針灸，2007，27（2）:115-116.

［14］麻圣達，盧雄，羅利飛，等．玻璃酸鈉對膝骨性關節(jié)炎患者關節(jié)液中基質金屬蛋白酶-3、-9水平的影響及療效觀察［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2014，52（1）:42-44.

［15］劉敏娟，穆敬平，王魁，等.熱敏灸配合功能訓練治療膝骨關節(jié)炎療效觀察［J］．上海針灸雜志，2013，12（9）:750-752.

［16］馮艷琴，姚忠紅，秦雪琴，等.穴位注射骨瓜提取物注射液聯(lián)合電針夾脊穴對兔骨質疏松性椎體壓縮骨折二聚糖的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2015，24（l1）:1911-1914.

Experimental Study on the Treatment of Rabbit Knee Osteoarthritis with Acupoint Injection of Ozoneand Heat-type Acupuncture Needles

LI Min，YUAN Guiping.Department of Pain Management，Taihe Hospital，Hubei，Shiyan 442000，China.

Objective:To observe the curative effect of the heat-type acupuncture needles combined with ozone injection on Inner and Outer Xiyan acupoints and Liangqiu acupoint in treating the rabbit knee osteoarthritis（KOA）.Methods:32 rabbits were randomly divided into model group，acupuncture group and ozone group and acupuncture plus ozone group，8 rabbits in each group.Freund′s complete adjuvant was injected into the front right limb knee joint cavity of the rabbits to establish KOA models.In the acupuncture group，we used the heattype acupuncture needles on the following acupoints:Inner and Outer Xiyan，Liangqiu，Yanglingquan，Heding，Zusanli，Xuehai，etc.In the ozone group，we injected small dose of ozone on Inner and Outer Xiyan acupoints and Liangqiu acupoint.In the acupuncture plus ozone group，we used the two therapies together.We recorded theEMG signals of the vastus medialis（vM）and the vastus lateralis（vL）using the surface electromyography（sEMG）system and calculated the vM/vL peak time difference（ΔTBP）.Moreover，we recorded the rabbit sciatic nerve threshold stimulation，maximum threshold of sciatic nerve stimulation and sciatic nerve conduction velocity，detected the hyaluronic acid of rabbit articular effusion（hyaluronic acid HA），interleukin-1 beta（interleukin-1 beta，beta IL-1）and joint cartilage expression of matrix metalloproteinases（matrixmetalloproteinases，MMPs）.Results:After the treatment，the rabbit sciatic nerve threshold stimulation，maximum threshold of sciatic nerve stimulation and sciatic nerve conduction velocity in the model group did not increase（P＞0.05）.The sciatic nerve threshold stimulation in the acupuncture group，ozone group and acupuncture plus ozone group increased after the treatment（all P＜0.05）.There was little difference on the sciatic nerve threshold stimulation between the acupuncture group and the ozone group（P＞0.05）.The sciatic nerve threshold stimulation in the acupuncture plus ozone group increased after the treatment compared with the same group before the treatment（P＜0.05）and increased significantly than that of the model group，the acupuncture group and the ozone group（all P＜0.05）.The maximum threshold of sciatic nerve stimulation in all the groups did not change a lot after the treatment and there was little difference on the value among the four groups（all P＞0.05）.The vM，vL and ΔTBP in the model group did not change a lot after the treatment（all P＞0.05）.The vM and vL increased but ΔTBP decreased（all P＜0.05）in the acupuncture group，ozone group and acupuncture plus ozone group after the treatment.There was little difference on the vM，vL and ΔTBP between the acupuncture group and the ozone group（all P＞0.05）.The vM and vL increased but ΔTBP decreased（all P＜0.05）in the acupuncture plus ozone group after the treatment whose result was better than that of the model group，the acupuncture group and the ozone group（all P＜0.05）. The content of IL-1β and HA in synovial fluid in the model group did not change much after the treatment（P＞0.05）.The content of IL-1β in synovial fluid decreased and the content of HA increased（all P＜0.05）in the acupuncture group，ozone group and acupuncture plus ozone group after the treatment.The decreased extent of IL-1β and increased extent of HA in the ozone group was higher than that of the acupuncture group（P＜0.05）. The content of IL-1β in synovial fluid decreased and the content of HA increased（P＜0.05）in the acupuncture plus ozone group after the treatment whose result was better than that of the model group，the acupuncture group and the ozone group（P＜0.05）.The expression of MMPs in the model group and the acupuncture group did not change much after the treatment（all P＞0.05）.The expression of MMP-2 and MMP-10 in the ozone group was lower after the treatment（P＜0.05）and was better than that of the model group（P＜0.05）.The expression of MMP-2 and MMP-10 in the acupuncture plus ozone group was lower after the treatment（P＜0.05）whose result was better than that of the model group and the acupuncture group（all P＜0.05），but was almost the same with that of the ozone group（P＞0.05）.Conclusion:The heat-type acupuncture needles stimulation helps with dispelling coldness and dehumidification，reducing local inflammation response caused by IL-1β，correcting limb EMG to reduce the pain threshold.The ozone acupoint injection treatment can inhibit the expression of MMPs to help with the degradation of joint tissue extracellular matrix and improving the secretion of HA.These two ways have obvious synergistic effects.

KOA model；Rabbit；Heat-type acupuncture needles；Ozone；ΔTBP；EMG signal

R246

A

1004-745X（2016）10-1866-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.010

湖北省科技廳項目（2013cfc037）

△（電子郵箱：limingllmmmm@163.com）

（2016-06-24）