邵考珍 何淑瑩

紫背天葵的高效液相色譜法指紋圖譜分析

邵考珍 何淑瑩

目的 探討紫背天葵的高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜。方法 采用色譜柱Shim-pack VP-ODS（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；以0.5%H3pO4（V/V）為流動(dòng)相A，以50 %乙腈為流動(dòng)相B（V/V），進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.8 ml/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；進(jìn)樣量10 μl；運(yùn)行時(shí)間為80 min。理論板數(shù)按矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)算，不得低于3000。結(jié)果 建立了紫背天葵的HPLC指紋圖譜。討論 采用HPLC構(gòu)建“紫背天葵”指紋圖譜，探討指紋圖譜的技術(shù)要點(diǎn)及檢測(cè)條件，以能反映該品種整體特征的HPLC指紋圖譜作為質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，對(duì)現(xiàn)有質(zhì)量控制方法作出積極而又必要的補(bǔ)充和提高，為建立統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，從而建立新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

紫背天葵；高效液相色譜法；指紋圖譜

紫背天葵是秋海棠科秋海棠屬的多年生無(wú)莖草本植物，別名為紅天葵、紅葉、紅水葵、散血子等，分布于中國(guó)的廣東、福建、江西、海南、香港、湖南、廣西、浙江等地，生長(zhǎng)于海拔700m至1120m的地區(qū)，一般生長(zhǎng)于懸崖石縫中、山地山頂疏林下石上、山頂林下潮濕巖石上及山坡林下。其可做清涼飲料，具有清熱解毒、涼血活血及潤(rùn)肺止咳的功效，主治暑熱高熱、肺熱咳嗽咯血、跌打扭傷、血瘀疼痛、瘡毒疥癬、水火燙傷等[1-3]。近年來(lái)，隨著研究的逐步開展，紫背天葵的新作用和用途不斷被發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)代研究表明，紫背天葵主要含有大量花色苷、黃酮苷、氨基酸、活性多糖化合物、生物堿和微量元素等有效活性成分，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊-3-O-蕓香糖苷等花色苷為主要活性化學(xué)成分[4-8]。目前，相關(guān)研究報(bào)道除少量藥理研究外，主要集中于不同成分的提取及穩(wěn)定性研究上，而對(duì)質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究極其罕見[9]，對(duì)高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜的研究則未見報(bào)道。由于市面上紫背天葵的質(zhì)量良莠不齊，不同產(chǎn)地的紫背天葵療效差距較大，本研究擬采用HPLC構(gòu)建紫背天葵的指紋圖譜，以便建立能反映該品種整體特征的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，從而保證中藥質(zhì)量穩(wěn)定、保證臨床療效和使用安全，同時(shí)更有利于開發(fā)新的臨床應(yīng)用，促進(jìn)資源有效的規(guī)范化和規(guī)模化開發(fā)利用。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀，包括四元

泵、脫氣機(jī)、二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱；Chemstation工作站；HN-1006型超聲波清洗機(jī)（廣州市華南超聲設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品（Hyphytochem公司，批號(hào)：20160201，純度：≥98%）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為高純水。廣東、廣西、湖南、福建等不同產(chǎn)地的紫背天葵經(jīng)廣州市皮膚病防治所副主任中藥師龍惠鑒定，均為秋海棠科秋海棠屬干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取紫背天葵藥材粉碎并過(guò)40目篩。精密稱取粉末1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min。取出，冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減少重量。搖勻，濾紙濾過(guò)，再以0.45 μm濾膜濾至進(jìn)樣瓶，即為供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品適量，加甲醇制成0.1 mg/ml溶液，避光保存，作為對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；以0.5% H3pO4（V/V）為流動(dòng)相A，50%乙腈為流動(dòng)相B（V/V），按表1程序進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.8 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μl；運(yùn)行時(shí)間：80 min。理論板數(shù)按矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)算，不低于3000。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批紫背天葵供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為參照峰，計(jì)算主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD%≤0.1%，相對(duì)峰面積的RSD%＜1%。另以第1次測(cè)定的色譜圖為參照，使用相似度計(jì)算軟件計(jì)算相似度，相似度平均值為0.999。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的精密度良好（表2）。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(相對(duì)峰面積)

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份紫背天葵供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為參照峰，計(jì)算主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果顯示，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD%＜1%，相對(duì)峰面積的RSD%＜3%。另以第1次測(cè)定的色譜圖為參照，使用相似度計(jì)算軟件計(jì)算相似度，相似度平均值為0.910。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好（表3）。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品6份分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為參照峰，計(jì)算主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果顯示，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD%＜1%，相對(duì)峰面積的RSD%＜3%。另以第1份測(cè)定的色譜圖為參照，使用相似度計(jì)算軟件計(jì)算相似度，相似度平均值為0.900。結(jié)果見表4。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(相對(duì)峰面積)

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(相對(duì)峰面積)

2.5 指紋圖譜及解析

2.5.1 共有峰標(biāo)記 通過(guò)對(duì)10批紫背天葵進(jìn)行了指紋圖譜的分析，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為參考峰，標(biāo)定了25個(gè)共有峰。分別為1號(hào)（5.230 min）、2號(hào)（7.750 min）、3號(hào)（8.078 min）、4號(hào)（10.143 min）、5號(hào)（11.204 min）、6號(hào)（12.717 min）、7號(hào)（14.934 min）、8號(hào)（16.201 min）、9號(hào)（16.603 min）、10號(hào)（16.944 min）、11號(hào)（18.091 min）、12號(hào)（18.660 min）、13號(hào)（19.315 min）、14號(hào)（19.671 min）、15號(hào)（22.826 min）、16號(hào)（26.049 min）、17號(hào)（39.656 min）、18號(hào)（39.853 min）、19號(hào)（42.168 min）、20號(hào)（42.451 min）、21號(hào)（43.811 min）、22號(hào)（45.055 min）、23號(hào)（46.220 min）、24號(hào)（47.421 min）、25號(hào)（50.276 min）。見圖2。

2.5.2 相似度計(jì)算 本研究采用中國(guó)藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004年A版），對(duì)10批不同產(chǎn)地的紫背天葵樣品HPLC圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)與系統(tǒng)生成的對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較，得到各種來(lái)源的供試品相似度在0.309～0.968。結(jié)果見表5及圖1～3。

表510 批不同產(chǎn)地的紫背天葵樣品相似度

3 討論

3.1 供試品制備方法的考察 根據(jù)文獻(xiàn)資料，曾試驗(yàn)以體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%、

100%的甲醇為溶劑。從HPLC圖譜看，50%甲醇HPLC圖譜雜質(zhì)最多、基線不平，其他濃度依次改善，100%甲醇最佳。采用超聲30 min的方法進(jìn)行提取，操作簡(jiǎn)單、圖譜特征穩(wěn)定。

圖1 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 紫背天葵樣品的HPLC指紋圖譜

圖310 批不同產(chǎn)地的紫背天葵HPLC色譜圖

3.2 色譜條件的優(yōu)化 曾試驗(yàn)過(guò)的流動(dòng)相系統(tǒng)有以下兩種：①乙腈-（0.1%～0.5%）磷酸溶液；②（0.1%～0.5%）磷酸溶液-50%乙腈，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：0.5%磷酸溶液-50%乙腈按表1的程序進(jìn)行梯度洗脫，所得色譜峰的數(shù)量、分離度、分布均勻程度最高。以每分鐘0.8 ml的流速至80 min時(shí)色譜峰已完全洗脫。

3.3 小結(jié) 采用HPLC構(gòu)建“紫背天葵”指紋圖譜，以能反映該品種整體特征的HPLC指紋圖譜作為質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，對(duì)現(xiàn)有質(zhì)量控制方法作出積極而又必要的補(bǔ)充和提高，為建立統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，從

而可以建立新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)紫背天葵的質(zhì)量控制，保證臨床用藥的安全有效，開發(fā)新的臨床應(yīng)用，促進(jìn)資源有效的規(guī)范化和規(guī)模化開發(fā)。

[1] 中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京∶中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 中華人民共和國(guó)國(guó)家醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].上海∶上?？萍汲霭嫔?2000∶493-495.

[3] 中國(guó)中藥編輯委員會(huì).中國(guó)本草[M].上?！蒙虾？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2000∶495.

[4] 段志芳,章煒中,黃麗華.紫背天葵多糖提取與含量測(cè)定[J].中成藥,2007,29(2)∶274-276.

[5] 許旋,盧忠,羅一帆.對(duì)不同等級(jí)紫背天葵微量元素含量的測(cè)定[J].廣東微量元素科學(xué),2000,7(4)∶55-57.

[6] 劉巍然,周法興.紫背天葵水提液析出物化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,1991,26(8)∶467-468.

[7] 李紅纓,楊海貴,植中強(qiáng).紫背天葵紅色素理化性質(zhì)的研究[J].肇慶學(xué)院學(xué)報(bào),2002,23(2)∶76-79.

[8] 崔蕊靜,申淑琦,郭朔.復(fù)合酶協(xié)同微波處理提取紫背天葵葉片總黃酮工藝[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2014,14(2)∶72-77.

[9] 譚雄斯,王景.紫背天葵研究進(jìn)展[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥,2012, 21(14)∶40-41.

Analysis of high performance liquid chromatography Semiaquilegia fingerprint

Shao Kaozhen He Shuying

Objective To study high performance liquid chromatography of Begonia fimbristipula (HPLC) fingerprint. Methods Uses the chromatographic column Shim-pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm);H3pO4at 0.5%(V/V)as mobile phase A,with 50% acetonitrile as mobile phase B(V/V),with gradient elution;The flow rate of 0.8 ml/min;column temperature 30 ℃;detection wavelength of 280 nm;ample quantity 10 μl;the running time of 80 min.Theoretical plate number according to the knapweed-3-O-glycosidase calculation,is not less than 3000.Result The HPLC fingerprint of Begonia fimbristipulata Hance is established.Conclusion The significance of establish the Begonia fimbristipulata Hance HPLC fingerprint:use the High performance liquid chromatography (HPLC)to construct "Begonia fimbristipulata Hance"fingerprint,discusses the technical key points of fingerprints and testing conditions,to reflect the overall characteristics of the HPLC fingerprint of breed as quality evaluation method,respond positively to the existing quality control method and the necessary supplement and improve,in order to establish the quality standard of unified foundation,so as to set a new standard of quality.

Begonia fimbristipulata Hance;HPLC;Fingerprint

R927.11

A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.11.003

佛山市南海區(qū)第七人民醫(yī)院，廣東 528247

邵考珍（1975-），主管中藥師。研究方向：中藥HPLC指紋圖譜