李瑞杰，謝玉梅，何思琴，王磊，陳莎，高夢祥，李利*

（長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州430025）

液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性紅曲黃色素的條件優(yōu)化

李瑞杰，謝玉梅，何思琴，王磊，陳莎，高夢祥，李利*

（長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州430025）

以紅色紅曲菌（Monascus ruber）M-7為實驗菌株，以色價和色調(diào)為評價指標(biāo)，對液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性紅色紅曲黃色素的條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，培養(yǎng)基pH值為3～4時，紅色紅曲菌M-7能合成大量的水溶性紅曲黃色素，發(fā)酵液呈鮮艷的黃色色調(diào)；培養(yǎng)基最優(yōu)碳源為2%蔗糖，最優(yōu)氮源為0.2%硫酸銨；水溶性紅色紅曲黃色素的色價和色調(diào)值隨著培養(yǎng)時間的延長先升后降，在第8天時達(dá)到最高，色價為5.56 U/mL，OD400nm/OD510nm為10.29，OD400nm/OD470nm為3.93。

紅色紅曲菌；水溶性紅曲黃色素；液態(tài)發(fā)酵

隨著人們健康意識的提高，天然食用色素越來越受到國內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。紅曲色素（Monascuspigments）是我國近年來增長速度最快的天然食用色素，是紅色紅曲菌（Monascus ruber）發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，包括黃色、橙色和紅色三類色素組分，在我國及東南亞地區(qū)已有超過1000年的應(yīng)用歷史，目前在歐美等國家的肉制品（如火腿腸）中也得到了很好的應(yīng)用[1-2]。

黃色素是重要的食用色素，約占市場需求量的60%以上[3]。目前，市售的食用黃色素產(chǎn)品以植物提取為主（如姜黃素、梔子黃等[4]），因而易受季節(jié)、氣候、產(chǎn)地等因素的影響。相比之下，采用微生物發(fā)酵法進(jìn)行天然食用色素的生產(chǎn)，不受季節(jié)限制、原料轉(zhuǎn)化率高、成本低，是目前世界食品色素添加劑的發(fā)展趨勢。目前，市場上應(yīng)用廣泛的紅曲色素以紅色素為主，而紅曲黃色素的生產(chǎn)起步較晚，目前生產(chǎn)廠家也很少，產(chǎn)品并未大規(guī)模上市，而且存在色價和色調(diào)都不高等問題[3]，因此，紅曲黃色素的開發(fā)研究具有廣闊的前景，可產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益。

有研究表明，紅曲菌所產(chǎn)生的紅曲色素包括醇溶性組分和水溶性組分[1]。目前的紅曲色素產(chǎn)品一般以醇溶性組分為主，水溶性較差，應(yīng)用范圍主要限制于油性食品（如火腿腸、香腸等）中。近年來，通過菌種的選育和發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化來獲得高色價和色調(diào)值的紅曲黃色素已取得一定成果[5-12]，但也均以生產(chǎn)醇溶性紅曲黃色素為主。為豐富紅曲黃色素產(chǎn)品的種類，促進(jìn)其在飲料等非油性食品中的應(yīng)用，本研究以紅曲色素高產(chǎn)菌株—紅色紅曲菌M-7為實驗材料，通過液體發(fā)酵法研究了水溶性紅曲黃色素的生產(chǎn)條件，以探索一種安全、高效、低成本的水溶性紅曲黃色素的生產(chǎn)方法，為其工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)提供基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

紅色紅曲菌（Monascus ruber）M-7：由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳福生教授惠贈，該菌株為紅曲色素高產(chǎn)菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

紅曲菌孢子培養(yǎng)基（查氏酵母瓊脂（Czapek yeast exatract agar，CYA））：NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖30 g，酵母膏5 g，蒸餾水1 L，瓊脂20 g，pH 5.5。

液態(tài)發(fā)酵種子制備培養(yǎng)基：在1 L蒸餾水中加入去皮馬鈴薯200 g，煮沸30 min，用4層紗布過濾，濾液中加葡萄糖20 g，定容至1 L。

水溶性紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：谷氨酸鈉5.04 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 1 g，ZnSO4·7H2O 0.01 g，MnSO4·H2O 0.003 g，葡萄糖20 g，0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 3、4、5、6、7或8）0.5 L，蒸餾水0.5 L。

以上培養(yǎng)基滅菌條件為：121℃，20 min。其中水溶性紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖單獨(dú)滅菌，滅菌條件為115℃，15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

TE124S電子分析天平、PB-10 pH計：德國賽多利斯公司；Mini Spin Plus離心機(jī)：德國Eppendorf公司；HVE-50高溫滅菌鍋：日本Hirayama公司；U-1900雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；疊加式IS-RDS3搖床：美國Crystal公司；GZX-6000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵

（1）孢子懸浮液的制備：將保存在4℃的菌種接種到CYA斜面上，28℃培養(yǎng)10 d，加入5 mL無菌水洗下孢子，用雙層擦鏡紙過濾除去菌絲，玻璃珠將孢子振蕩打散，血球計數(shù)板計數(shù)。

（2）種子的培養(yǎng)：250 mL三角瓶中裝液態(tài)發(fā)酵種子制備培養(yǎng)基50 mL，接種孢子懸浮液，使孢子的終濃度為103個/mL，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)40～44 h，作為種子液。

（3）液態(tài)發(fā)酵：250 mL三角瓶裝水溶性紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，接入上述種子液10 mL，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)2～9 d。

1.3.2 生物量的測定

采取干質(zhì)量法，即發(fā)酵完成后，發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾得到菌絲體，用3倍體積的蒸餾水洗滌菌絲體，于60℃中干燥至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量。

1.3.3 色價的測定

發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾得到濾液，12 000 r/min離心3 min，稀釋一定倍數(shù)，于200～600 nm進(jìn)行全波段掃描，分別取波長400 nm、470 nm和510 nm處吸光度值計算黃色素、橙色素和紅色素的色價。色價計算公式：

1.3.4 色調(diào)的測定

本實驗色調(diào)定義為黃色素/紅色素=OD400nm/OD510nm；黃色素/橙色素=OD400nm/OD470nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對紅色紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

據(jù)報道，pH對紅曲色素的產(chǎn)生有一定影響[13-15]。一般認(rèn)為，酸性條件下主要產(chǎn)物為紅曲黃色素和紅曲橙色素；中性或堿性條件下主要產(chǎn)物為紅曲紅色素。為了實現(xiàn)紅曲黃色素的生產(chǎn)，首先利用檸檬酸-磷酸鹽緩沖液制備不同pH的發(fā)酵培養(yǎng)基，研究pH對紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 pH對水溶性紅曲黃色素色調(diào)的影響Fig.1 Effect of pH on color tone of water soluble yellow Monascuspigment

由圖1可知，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH對色素的種類影響很大，在pH3和pH4時，紅曲菌M-7產(chǎn)生較多的水溶性黃色素，發(fā)酵液呈鮮艷的黃色色調(diào)，OD400nm/OD510nm分別為4.50和3.76，OD400nm/OD470nm分別為2.48和2.40，黃色素的色價分別為1.04U/mL和0.95U/mL；而當(dāng)pH為5、6、7和8時，紅曲菌M-7產(chǎn)生較多的水溶性紅色素，發(fā)酵液呈明顯的紅色色調(diào)，OD400nm/OD510nm依次為1.66、1.07、0.69和0.68，OD400nm/OD470nm依次為1.44、1.00、0.74和0.73。該結(jié)果中pH對紅曲色素影響的規(guī)律與文獻(xiàn)報道基本一致[13-15]。因此，將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值控制在3～4，可實現(xiàn)水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵生產(chǎn)。在后續(xù)實驗中，均將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值控制在3～4。

2.2 碳源種類對紅色紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

分別以2%的可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、蔗糖、馬鈴薯淀粉、葡萄糖為碳源，0.5%谷氨酸鈉為氮源，初始pH值為3.0，發(fā)酵2 d后，考察碳源種類對發(fā)酵液中水溶性紅曲黃色素色價和色調(diào)的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2A可知，以可溶性淀粉、蔗糖和馬鈴薯淀粉為碳源時水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)量較高，色價均＞80U/g菌體干質(zhì)量；由圖2B可知，蔗糖為碳源時的色調(diào)值最高，OD400nm/OD510nm、OD400nm/OD470nm分別是4.75、2.35，表明此時產(chǎn)生的水溶性紅曲黃色素所占比例最大，純度較高。因此，確定蔗糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖2 碳源種類對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.2 Effect of carbon sources on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

2.3 碳源含量對紅色紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

圖3 葡萄糖含量對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.3 Effect of glucose concentration on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

分別以1%、2%、3%、4%、5%的蔗糖為碳源，0.5%的谷氨酸鈉為氮源，初始pH值為3.0，發(fā)酵2 d后，考察碳源濃度對發(fā)酵液的水溶性紅曲黃色素色價和色調(diào)的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)蔗糖含量＞3%時，對水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)生有一定抑制作用，類似結(jié)果在醇溶性紅曲黃色素發(fā)酵過程中也有報道[7]，可能是過高的滲透壓對水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)生有不利影響。綜合色價和色調(diào)值來看，產(chǎn)水溶性紅曲黃色素最佳的葡萄糖含量為2%，此時色價為90.03U/g菌體干質(zhì)量，OD400nm/OD470nm為2.35，OD400nm/ OD510nm為4.59。

2.4 氮源種類對紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

分別以0.5%的酵母膏、蛋白胨、谷氨酸鈉、硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨為氮源，2%的蔗糖為碳源，初始pH值為3.0，發(fā)酵時間2 d后，考察氮源種類對發(fā)酵液中水溶性黃色素色價和色調(diào)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 氮源種類對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

由圖4可知，6種氮源中，酵母膏實驗組2 d后未觀察到明顯的水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)生，而其他氮源實驗組均有大量水溶性紅曲黃色素產(chǎn)生。與有機(jī)氮源酵母膏、蛋白胨、谷氨酸鈉相比，無機(jī)氮源硝酸鉀、硫酸銨、硝酸鉀更有利于水溶性黃色素的產(chǎn)生，其中以硫酸銨為氮源時，黃色素的色價（110.69 U/g）和色調(diào)（OD400nm/OD470nm為2.69，OD400nm/OD510nm為4.54）均較高，故選擇硫酸銨為較優(yōu)氮源。

2.5 氮源含量對紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

分別以0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%的硫酸銨為氮源，2%的蔗糖為碳源，初始pH值為3.0，發(fā)酵時間2 d后，考察氮源濃度對發(fā)酵液中水溶性紅曲黃色素色價和色調(diào)的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 硫酸銨含量對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.5 Effect of ammonium sulphate concentration on color value(A)and tone(B)of water soluble yellow Monascuspigment

由圖5可知，在所考察的濃度范圍內(nèi)，硫酸銨對水溶性紅曲黃色素的色價和色調(diào)影響不明顯，從經(jīng)濟(jì)節(jié)約的角度考慮，較優(yōu)硫酸銨含量為0.2%。

2.6 發(fā)酵時間對紅曲菌產(chǎn)水溶性黃色素的影響

由于黃色素是紅曲菌的次級代謝產(chǎn)物，主要在生長后期大量產(chǎn)生，因此，在上述最佳碳、氮源種類和濃度的條件下，以培養(yǎng)時間為單因素，從發(fā)酵培養(yǎng)的第2天開始，每隔24 h測定發(fā)酵液的pH、色價和色調(diào)值，實驗結(jié)果見圖6。

由圖6可知，發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的pH是動態(tài)變化的，第2天到第5天緩慢下降，之后又呈上升趨勢，pH變化范圍在2.85～3.10范圍內(nèi)，滿足紅色紅曲菌M-7產(chǎn)水溶性黃色素的基本要求。在水溶性紅曲黃色素的產(chǎn)量方面，前4天色價較低，從第5天開始，色價開始大幅提升，第8天達(dá)到最高值，為5.56 U/mL，第9天開始下降，可能是黃色素開始向紅色素轉(zhuǎn)化。

圖6 發(fā)酵時間對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(diào)(B)的影響Fig.6 Effect of fermentation time on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

在水溶性紅曲黃色素的純度方面，其變化趨勢基本與黃色素產(chǎn)量相似，從OD400nm/OD470nm和OD400nm/OD510nm的大小來看，5 d后黃色素的比例顯著提高，其中OD400nm/OD510nm在第8天達(dá)最大，為10.29，之后呈下降趨勢，第9天為9.74；而OD400nm/OD470nm一直保持緩慢上升趨勢，第8天為3.93，第9天為4.08。綜合考慮紅曲黃素的產(chǎn)量和純度，最佳發(fā)酵時間為8 d。

3 結(jié)論

本實驗以紅色紅曲菌M-7為實驗菌株，以色價和色調(diào)為評價指標(biāo)，對液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性紅曲黃色素的條件進(jìn)行了研究。

結(jié)果表明，將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH控制在3～4，可實現(xiàn)高純度的水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵產(chǎn)物呈鮮艷的黃色色調(diào)。

碳源對水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵有顯著影響，以2%的蔗糖最佳，此時水溶性紅曲黃色素的色價和色調(diào)值在所考察的碳源中均最高。氮源對水溶性紅曲黃色素的發(fā)酵有顯著影響，以0.2%的硫酸銨最佳，此時水溶性紅曲黃色素的色價和色調(diào)值在所考察的氮源中均最高。

水溶性紅曲黃色素的色價和色調(diào)值隨著培養(yǎng)時間的延長先升后降，在第8天時達(dá)到最高，色價為5.56 U/mL，OD400nm/OD510nm為10.29，OD400nm/OD470nm為3.93。

[1]FENG Y,SHAO Y,CHEN F.Monascuspigments[J].Appl MicrobiolBiotechnol,2012,96:1421-1440.

[2]梁彬霞，白衛(wèi)東，楊曉暾，等.紅曲色素的功能特性研究進(jìn)展[J].中國釀造，2012，31（3）：21-24.

[3]周波，吳吉林，朱明軍，等.基于代謝途徑提高紅曲黃色素生成及控制橘霉素產(chǎn)生的研究[J].食品科技，2011，36（2）：242-248.

[4]周波，吳吉林，朱明軍，等.微生物黃色素的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報，2010，37（9）：1362-1368.

[5]周波，楊玲，崔思穎，等.響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基提高紅曲黃色素的色調(diào)[J].華南理工大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，36（11）：91-95.

[6]周波，王菊芳，吳振強(qiáng)，等.高產(chǎn)紅曲黃色素菌株的選育[J].微生物學(xué)通報，2008，35（12）：1909-1914.

[7]毛鵬.紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵技術(shù)研究[D].無錫：江南大學(xué)，2015.

[8]周波，浦躍武，朱明軍，等.氮源對紅曲霉突變株產(chǎn)黃色素的影響[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（2）：123-127.

[9]XIONG X,ZHANG X,WU Z,et al.Accumulation of yellowMonascus pigments by extractive fermentation in nonionic surfactant micelle aqueous solution[J].Appl Microbiol Biotechnol,2015,99(3):1173-1180.

[10]JIRASATID S,NOPHARATANA M,KITSUBUN P,et al.Statistical optimization for Monacolin K and yellow pigment production and citrinin reduction byMonascus purpureusin solid-state fermentation[J].J Microbiol Biotechn,2013,23(3):364-374.

[11]YONGSMITH B,THONGPRADIS P,KLINSUPA W,et al.Fermentation and quality of yellow pigments from golden brown rice solid culture byaselectedMonascusmutant[J].Appl Microbiol Biotechn,2013, 97(20):8895-8902.

[12]KLINAUPA W,PHANSIRI S,THONGPRADIS P,et al.Enhancement of yellow pigment production by intraspecific protoplast fusion of Monascusspp.yellow mutant(ade(-))and white mutant(prototroph)[J]. J Biotechnol,2016,217:62-71.

[13]KANG B,ZHANG X,WU Z,et al.Production of citrinin-freeMonascus pigments bysubmerged culture at low pH[J].Enzyme Microb Technol, 2014,55:50-57.

[14]OROZCO S F B,KILIKIAN B V.Effect of pH on citrinin and red pigments production byMonascus purpureusCCT3802[J].World J Microbiol Biotechnol,2008,24:263-268.

[15]CHEN M H,JOHNS M R.Effect of pH and nitrogen source on pigment production byMonascus purpureus[J].Appl Microbiol Biot,1993,40 (1):132-138.

Optimization of liquid-state fermentation conditions for the production of water soluble yellowMonascuspigment

LI Ruijie,XIE Yumei,HE Siqin,WANG Lei,CHEN Suo,GAO Mengxiang,LI Li*
(College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 430025,China)

UsingMonascus ruberM-7 as experimental strain,color value and color tone as evaluation index,the production of water soluble yellow Monascuspigment by liquid state fermentation was investigated.The results showed that when the fermentation medium pH was 3-4,a large portion of water soluble yellowMonascuspigment was synthesized byM.ruberM-7,and the fermentation broths was bright yellow.The optimal carbon source of the medium was sucrose 2%,and the optimal nitrogen source was ammonium sulfate 0.2%,respectively.The color value and the color tone of water soluble yellowMonascuspigment increased in the early stage,decreased in the late stage,and the maximum points were on the 8thday.After 8 d cultivation,the production of water soluble yellowMonascuspigment was 5.56 U/ml,OD400nm/OD510nmwas 10.29 and OD400nm/OD470nmwas 3.93.

Monascus ruber;water soluble yellowMonascuspigment;liquid-state fermentation

TS264.4

0254-5071（2016）11-0073-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.015

2016-04-19

國家自然科學(xué)基金資助項目（31501453；31371829）；長江大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（20150089）

李瑞杰（1994-），女，本科生，研究方向為食品質(zhì)量與安全。

*通訊作者：李利（1983-），女，講師，博士，研究方向為食品微生物學(xué)。