任振波，候毅銳，鄭 偉，張 雷，虞 微，黃 琳

(解放軍第208醫(yī)院，吉林 長春130062)

表達(dá)CD20的正常B細(xì)胞對CD20特異cTCR+T細(xì)胞抗白血病活性的影響

任振波*，候毅銳，鄭 偉，張 雷，虞 微，黃 琳

(解放軍第208醫(yī)院，吉林 長春130062)

急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)為預(yù)后極差的一種類型急性白血病。既往治療以化療為主，生存期極短。造血干細(xì)胞移植(HSCT)為唯一能治愈本病的方法，但由于缺乏配型相合供體及資金等，HSCT也只能挽回少部分ALL患者的生命。近20年來國外研究的用嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)[1]治療ALL已有成功的報道，且沒有移植物抗宿主病副作用，具有廣泛的應(yīng)用前景，有取代HSCT成為治療B-ALL、CLL、NHL的一種新的方法的趨勢。

經(jīng)過20多年的發(fā)展，CAR-T的設(shè)計已經(jīng)越來越完善，但仍存在許多問題。如on-target效應(yīng)(靶效應(yīng))(腫瘤溶解綜合征、細(xì)胞因子風(fēng)暴、巨細(xì)胞綜合征、神經(jīng)毒性、B細(xì)胞缺如及低丙種球蛋白血癥)；off-target(脫靶效應(yīng))等。輸注細(xì)胞前是否需要進(jìn)行預(yù)處理及用什么方法進(jìn)行預(yù)處理能否解決on-target效應(yīng)還未確定。國內(nèi)開展的中心很少。據(jù)Anupama Ahuja[2]報道鼠B細(xì)胞減少可以抑制系統(tǒng)性免疫反應(yīng)，并研制了表達(dá)CD20的B細(xì)胞轉(zhuǎn)基因鼠，應(yīng)用大劑量鼠抗人CD20單抗導(dǎo)致B細(xì)胞明顯減少，取得了明顯的臨床療效。我們設(shè)想在輸注CAR-T細(xì)胞前給予抗CD20抗體進(jìn)行預(yù)處理減少B淋巴細(xì)胞，觀察CAR-T細(xì)胞的活性及抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 動物、細(xì)胞系

Thy1.2+野生型(WT)鼠，人CD20(hCD20)轉(zhuǎn)基因鼠、Leu16+T細(xì)胞、CL4細(xì)胞TCR轉(zhuǎn)基因鼠和Thy1.1+和Thy1.2+Bbalb/c鼠購自美國The Jackson Laboratory。hCD20特異cTCR+T細(xì)胞；MB185- hCD20/Thy1.1-ffLuc-Neo腫瘤細(xì)胞，Thy1.1+Leu16+CD8+T細(xì)胞，Leu16+CD8+T細(xì)胞，Thy1.1+Leu16+T細(xì)胞。

1.2 試劑和儀器

熒光偶聯(lián)抗體：mCD4，mCD8，hCD20，Thy1.1，CD3，CD28購自BD Bioscience。

抗hCD20由ATCC(American type culture collection)。雜交瘤HB-9645用FRCRC(Fred Hutchinson cancer Reserch center)生物設(shè)備進(jìn)行。流式細(xì)胞儀使用BD Bioscience的FACS(熒光激活細(xì)胞分離儀)；抗mCD20和抗hCD20單抗購自美國eBioscience。ELISA試劑盒為美國eBioscience公司產(chǎn)品。CD20- CAR-T細(xì)胞購自美國ATCC。

1.3 鼠骨髓和脾細(xì)胞的制備

用CO2將鼠窒息后摘取鼠淋巴結(jié)和脾臟，用40 μm濾網(wǎng)過濾產(chǎn)生單細(xì)胞懸液；骨髓(BM)骨髓通過RPMI1640沖洗股骨骨髓腔取得；血、淋巴結(jié)、BM和脾細(xì)胞用低滲液體溶解后用流式細(xì)胞儀分析。

1.4 過繼轉(zhuǎn)導(dǎo)及B細(xì)胞去除

白血病細(xì)胞在指數(shù)生長期時用PBS洗滌后置Hank’s平衡鹽液中通過尾靜脈注入鼠中。T細(xì)胞在刺激后的第4-5天通過尾靜脈注入。靜脈注射抗hCD20單抗200μg后測定CD20特異T細(xì)胞數(shù)量。

1.5 體外T細(xì)胞分析

用流式細(xì)胞儀通過測定DDAO+的百分?jǐn)?shù)將TB細(xì)胞結(jié)合的CFSE+DDAO+的百分?jǐn)?shù)分開以測定T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

1.6 生物發(fā)光成像

給鼠腹膜內(nèi)注射熒光素鉀，然后用X線攝像，用生物成像軟件分析發(fā)光成像資料，單位為光子/s/cm2/sr，并可對確定部位進(jìn)行測定。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗，多個樣本均數(shù)的比較用方差分析。生存分析用Kaplan-Meie log-rank檢測。以P<0．05為差異有顯著性。

1.8 方法

1.8.1 將107Thy1.1+Leu16+T細(xì)胞通過靜脈注入Thy1.2+WT鼠和hCD20鼠，7天后取鼠的脾細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析Thy1.1+CD4和CD8供者細(xì)胞及鼠自身B細(xì)胞。

1.8.2 給WT鼠注射107Thy1.1+Leu16+CD8+T細(xì)胞，于24小時后注射2×107WT或hCD20脾細(xì)胞做對比。注射3天后檢測血中(供者)Thy1.1+CD8+細(xì)胞。注射1周后取鼠脾細(xì)胞再測一次Thy1.1+CD8+細(xì)胞。

1.8.3 給WT鼠和hCD20鼠靜脈注射2×107MB185- hCD20/Thy1.1-ffLuc-Neo白血病細(xì)胞。3天后注射Leu16+cTCR(治療)及空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的Thy1.1+CD8+T細(xì)胞，然后進(jìn)行生物發(fā)光成像。

1.8.4 注射T細(xì)胞2天后抽取WT鼠和hCD20鼠的外周血檢測Thy1.1+CD8+T細(xì)胞。實驗重復(fù)2次，每組用鼠3-4只)。

1.8.5 注射T細(xì)胞2天后，對照白血病生物發(fā)光信號和外周血供者CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。實驗重復(fù)2次，每只WT鼠分別注射0.1、0.3、107 個Leu16+T細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 將107Thy1.1+Leu16+效應(yīng)T細(xì)胞注入WT鼠和hCD20鼠中1周后，Thy1.1+供者細(xì)胞在WT鼠脾中CD4細(xì)胞占3.5%；CD8細(xì)胞占4.8%，但在hCD20鼠中分別僅占0.02%(P<0.01)和0.008%(P<0.01)，提示在hCD20鼠中抗原特異性T細(xì)胞減少。

2.2 鼠自身B細(xì)胞的數(shù)量在hCD20鼠中和WT鼠的脾中是相似的(P<0.05)，說明T細(xì)胞減少限制了轉(zhuǎn)入細(xì)胞的抗B細(xì)胞活性。

2.3 給WT鼠注射Leu16+T細(xì)胞，于24 h后注射2×107WT或hCD20脾細(xì)胞做對比。注射3天后，在注入hCD20脾細(xì)胞的WT鼠的血中與注入WT脾細(xì)胞的WT鼠相比，Thy1.1+供者細(xì)胞明顯減少(1.32%:4.1%CD8+Thy1.1+；P<0.01)。

2.4 注射1周后，Thy1.1+供者細(xì)胞也減少(0.4%:2.4%CD8+Thy1.1+；P<0.01)。2.5 先給野生型(WT)鼠及hCD20鼠注射2×107白血病細(xì)胞，3天后再靜脈注射107Leu16+CD8+T細(xì)胞，在WT鼠內(nèi)3天白血病生物發(fā)光信號減弱，但在hCD20鼠中的白血病的生長極小受到影響(抑制)。

2.6 在Thy1.1+供者細(xì)胞中，在注入后2天的hCD20宿主中的血CD8T細(xì)胞僅占1.3%，而在WT宿主中為12.2%(P<0.001)。

2.7 用滴定法測量進(jìn)入具有白血病的WT宿主中的Leu16+T細(xì)胞表明0.1-0.3×107Leu16+T細(xì)胞在WT宿主中與在hCD20宿主中的107Leu16+T細(xì)胞的效果一致。這些結(jié)果表明CD20特異T細(xì)胞在與正常B細(xì)胞反應(yīng)時減少，而在與白血病B細(xì)胞反應(yīng)時不減少。

3 討論

嵌合型抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)是從腫瘤患者的血液或腫瘤組織中提取的T淋巴細(xì)胞，通過基因工程技術(shù)，采用特異性CAR轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行體外培養(yǎng)增值，進(jìn)而產(chǎn)生一定數(shù)量的、對某種腫瘤細(xì)胞抗原有特異識別功能的CAR-T細(xì)胞，再將CAR-T細(xì)胞回輸?shù)侥[瘤患者體內(nèi)，從而誘發(fā)抗腫瘤細(xì)胞作用，建立預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的持久免疫力[3]。CAR-T通過抗原抗體結(jié)合的原理特異性識別腫瘤細(xì)胞表面的抗原，因此無主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制，還可以避免因腫瘤細(xì)胞MHC下調(diào)或丟失導(dǎo)致的免疫逃逸。而且通過在嵌合基因設(shè)計時增加共刺激分子信號，可增強CAR-T細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。經(jīng)過20多年的發(fā)展，CAR-T的設(shè)計已經(jīng)越來越完善，手段也越來越多。

經(jīng)過26年的研究，CAR-T技術(shù)已經(jīng)發(fā)展出三代。第一代CAR-T在細(xì)胞內(nèi)只有一個T細(xì)胞CD3ξ受體的信號區(qū)；第二代在第一代基礎(chǔ)上增加了一個共刺激分子信號：第三代則在第一代基礎(chǔ)上增加了2個共刺激分子信號。第一代CAR-T在體內(nèi)存在時間太短且臨床效果不佳。第三代CAR-T已被用于套細(xì)胞淋巴瘤及濾泡性非霍奇金淋巴瘤臨床試驗，但并未顯示出比第二代更優(yōu)越的臨床結(jié)果。

目前在血液腫瘤臨床應(yīng)用上較為成功的主要是第二代CAR-T技術(shù)，轉(zhuǎn)染的共刺激分子主要是CD28或CD137(4-1BB)。

注入的效應(yīng)T細(xì)胞的持續(xù)存在已被證實為腫瘤過繼T細(xì)胞免疫治療效果的決定因素。臨床實驗調(diào)查過繼輸入cTCR+T細(xì)胞證明該T細(xì)胞僅短暫存在于有大量能產(chǎn)生抗原的病人體內(nèi)[4,5]。與這些臨床研究一致的是我們的結(jié)果顯示正常B細(xì)胞表達(dá)CD20能降低CD20特異cTCR+T細(xì)胞的存活和功能，且提示抗體介導(dǎo)的B細(xì)胞減少可能是提高CD20特異T細(xì)胞治療效果的有效方法。已證實正常B細(xì)胞可以使提呈給初始T細(xì)胞的抗原能力下降或數(shù)量減少[6,7]。相比之下，記憶性T細(xì)胞在應(yīng)答B(yǎng)細(xì)胞表達(dá)的抗原時可以擴(kuò)增[7]。CD20特異cTCR+T細(xì)胞在與正常B細(xì)胞應(yīng)答時減少，表明B細(xì)胞表達(dá)的抗原的致耐受性潛能沒有被之前激活的T細(xì)胞消除。雖然T細(xì)胞減少說明CD20特異cTCR+T細(xì)胞抗白血病功能在接觸到表達(dá)CD20的正常B細(xì)胞之后有限性，在T細(xì)胞減少之前也許有其他機制限制T細(xì)胞功能。靶抗原在正常組織的高表達(dá)可以干擾T細(xì)胞的抗腫瘤功能，其過程是通過促進(jìn)cTCR下調(diào)、T細(xì)胞脫敏以及通過增加全部抗原表達(dá)細(xì)胞減少體內(nèi)效應(yīng)器對靶目標(biāo)的比例。因此，正常組織的抗原可能損害抗原特異T細(xì)胞的抗腫瘤功能，即使T細(xì)胞依然存活。

體外實驗表明，正常人B細(xì)胞上高表達(dá)CD20抗原可以從CD20特異cTCR+T細(xì)胞表面下調(diào)cTCR分子[8]。正常TCR的下調(diào)可以降低效應(yīng)器功能及敏感性[9]，表明cTCR下調(diào)可能限制對靶目標(biāo)的識別。持續(xù)暴露于B細(xì)胞上的CD20分子也許能損害CD20特異cTCR+T細(xì)胞的存活。臨床經(jīng)驗表明在有大量抗原負(fù)荷的病人血中cTCR+T細(xì)胞減少[4，5]。全淋巴細(xì)胞減少證明可以增加T細(xì)胞活性[10，11]，但在過繼轉(zhuǎn)入B細(xì)胞抗原特異的T細(xì)胞之前選擇性B淋巴細(xì)胞減少的效果還未評估。雖然幾個B細(xì)胞相關(guān)分子以TCRs為靶目標(biāo)，包括CD19[12，13]，CD20[14，15]，CD22[16，17]，沒有研究論及在模型機制中的體內(nèi)cTCR+T細(xì)胞的功能，在此模型當(dāng)中正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表達(dá)相同的靶分子。在此研究中，我們以免疫功能正常鼠中正常細(xì)胞和白血病細(xì)胞上的CD20為靶目標(biāo)，正常B細(xì)胞上CD20的表達(dá)嚴(yán)重?fù)p害cTCR+CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的白血病免疫治療，導(dǎo)致T細(xì)胞減少。在B細(xì)胞缺乏CD20的鼠中和用單抗的CD20B細(xì)胞減少的鼠中cTCR+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至骨髓且除掉了白血病細(xì)胞。結(jié)果顯示白血病模型鼠在T細(xì)胞輸入之前B細(xì)胞減少可以提高B細(xì)胞抗原特異性cTCR+T細(xì)胞在體內(nèi)的功能和存活。CD19抗原的變異，以及具有干細(xì)胞樣特征的B-ALL起始細(xì)胞不表達(dá)CD19是應(yīng)用CD20的原因。

綜上所述，應(yīng)用抗CD20單抗導(dǎo)致B細(xì)胞減少明顯提高T細(xì)胞在白血病體內(nèi)的活性及抗白血病效果，可以在人體內(nèi)采用此預(yù)處理方法進(jìn)行CD20特異cTCR+T細(xì)胞治療急性B淋巴細(xì)胞白血病或B淋巴細(xì)胞淋巴瘤的臨床實驗。

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此項目受吉林省科技廳項目資助(項目編號20160101165JC)

1007-4287(2017)02-0326-03

2016-05-26)

*通訊作者