韓瑞鈺 馬 婧 王樹(shù)松

河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，國(guó)家衛(wèi)計(jì)委計(jì)劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(石家莊，050071)

·綜 述·

人類(lèi)胚胎植入前診斷的研究進(jìn)展

韓瑞鈺 馬 婧 王樹(shù)松*

河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，國(guó)家衛(wèi)計(jì)委計(jì)劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(石家莊，050071)

植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)是在人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的基礎(chǔ)上篩選無(wú)染色體異常的胚胎，診斷并選擇未見(jiàn)遺傳缺陷的胚胎植入子宮，幫助妊娠成功、減少出生缺陷[1]。1990年一對(duì)X-性連鎖疾病夫婦通過(guò)PGD誕下一名健康女?huà)隱2]，標(biāo)志著PGD走入臨床應(yīng)用階段。PGD主要適用于攜帶遺傳性疾病、遺傳風(fēng)險(xiǎn)或染色體重排的夫婦[3]，還可應(yīng)用于反復(fù)胚胎種植失敗等一些基因突變的疾病、遲發(fā)型疾病、HLA配型等[4]。本文對(duì)人類(lèi)胚胎植入前診斷的研究進(jìn)展及前沿進(jìn)行綜述。

1 現(xiàn)階段PGD的主要技術(shù)

1.1 活檢技術(shù)

PGD活檢取材主要來(lái)源包括極體活檢、卵裂球活檢以及囊胚期胚胎活檢[5]。極體活檢主要檢測(cè)胚胎來(lái)自母源性的遺傳信息，不會(huì)因?yàn)榧?xì)胞嵌合體而產(chǎn)生誤診風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)胚胎發(fā)育影響較小，后續(xù)對(duì)采集的極體細(xì)胞可進(jìn)行遺傳診斷的時(shí)間長(zhǎng)。卵裂期活檢是早些時(shí)候應(yīng)用廣泛的活檢方法，在卵子受精第3天發(fā)育至6～8個(gè)細(xì)胞的卵裂球進(jìn)行活檢。近年來(lái)囊胚期胚胎活檢成為主流，在受精后第5天取滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，可取得更多的細(xì)胞進(jìn)行分析，且胚胎嵌合體發(fā)生率較低。但缺點(diǎn)在于它還不是胎兒本體的真正代表，染色體異常比例大[6]，容易造成誤診。

1.2 診斷技術(shù)

1.2.1 熒光原位雜交(FISH)技術(shù) 此技術(shù)是用基因或染色體片段的特異性探針進(jìn)行熒光標(biāo)記，1994年應(yīng)用于胚胎性別診斷，此后FISH被用于間期核進(jìn)行非整倍體篩查[7]。FISH技術(shù)簡(jiǎn)單、快速，精確率有所提高，但仍存在一些問(wèn)題，如 FISH檢測(cè)染色體的數(shù)目如何增加，如何提高探針的聯(lián)合使用效率，不同植入前篩查指征患者如何選擇FISH探針組合等仍存在爭(zhēng)議。

1.2.2 比較基因組雜交(CGH)技術(shù) CGH原理是用不同顏色的熒光染料標(biāo)記DNA進(jìn)行熒光強(qiáng)度對(duì)比分析。該方法可分析所有染色體的數(shù)目、各位點(diǎn)遺傳物質(zhì)，但不能檢出多倍體、DNA序列的微缺失、點(diǎn)突變及低拷貝的擴(kuò)增，也不能檢出平衡易位等染色體畸變。

1.2.3 微陣列技術(shù) 目前常用的技術(shù)為微陣列比較基因組雜交技術(shù)(array CGH)，可檢測(cè)全部染色體，且準(zhǔn)確、快速[8]。有研究顯示，array CGH技術(shù)比FISH技術(shù)可更多檢測(cè)出染色體畸形和異常胚胎[9]。array CGH聯(lián)合囊胚期活檢方法被建議作為PGD中檢測(cè)全部染色體非整倍體的優(yōu)先選擇方法[10]。另單核苷酸多態(tài)性array技術(shù)作為微陣列技術(shù)方法之一，可用于檢測(cè)非整倍體、部分單基因遺傳病[11]，并且可以提供胚胎的DNA圖譜[12]。

1.2.4 單核苷酸多態(tài)性(SNP)芯片 SNP芯片通過(guò)對(duì)比位點(diǎn)、熒光強(qiáng)度來(lái)診斷染色體?？赏瑫r(shí)分析每個(gè)胚胎遺傳信息的DNA指紋，用于鑒別胚胎的遺傳性狀。SNP 可自動(dòng)化分析，分辨率和準(zhǔn)確性高；可以判斷缺失、重復(fù)的親源和單體二體性，但區(qū)分正常和平衡易位仍有難度。在PGD應(yīng)用中，通過(guò)SNP技術(shù)進(jìn)行胚胎植入前檢測(cè)比FISH方法檢測(cè)臨床妊娠率高、流產(chǎn)率低[13]。CGH芯片和NGS技術(shù)相比SNP較為經(jīng)濟(jì)、性價(jià)比高，應(yīng)用相對(duì)較多。近幾年在診斷單基因疾病以及染色體異常方面, 應(yīng)用二代測(cè)序、全基因組擴(kuò)增等在PGD診斷中逐漸增多，更多的新技術(shù)也在研發(fā)中[14]。

1.2.5 第二代測(cè)序(NGS)技術(shù) 第二代測(cè)序與一代測(cè)序相比增加了通量、降低了成本、提高了速度，為同時(shí)分析單基因病和進(jìn)行全面染色體診斷提供可能[15]。隨著第二代測(cè)序的快速發(fā)展，作為基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)將成為PGD主流[16-17]，在全球基因測(cè)序市場(chǎng)上占有著絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

1.2.6 全基因組擴(kuò)增(WGA) WGA是對(duì)所有基因組序列進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增，使DNA總量在最小偏倚下得到大幅度增加，最大限度增加遺傳信息量，用微量DNA分析多基因位點(diǎn)以及重復(fù)檢測(cè)。對(duì)于PGD活檢取材少或只有單個(gè)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，WGA具有操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)量多且穩(wěn)定、擴(kuò)增效率高、高保真性，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度長(zhǎng)等特點(diǎn)。

2 無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)技術(shù)是未來(lái)PGD發(fā)展趨勢(shì)

2.1 傳統(tǒng)PGD面臨的挑戰(zhàn)

在近20年的發(fā)展中，隨著囊胚活檢技術(shù)的規(guī)范、胚胎玻璃化冷凍技術(shù)的成熟以及單細(xì)胞全基因組遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用和分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)的涌入，PGD應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。因此，傳統(tǒng)PGD的安全性開(kāi)始受到關(guān)注，從對(duì)技術(shù)本身的認(rèn)識(shí)到臨床應(yīng)用也逐漸趨于客觀和理性。

2.1.1 安全獲取胚胎遺傳物質(zhì) 安全的獲得胚胎遺傳物質(zhì)避免胚胎損傷，是PGD面臨的挑戰(zhàn)之一。胚胎的細(xì)胞活檢是PGD的主要內(nèi)容之一，主要分為透明帶開(kāi)孔和胚胎活檢。激光法由于更加簡(jiǎn)便、快速和精準(zhǔn)，成為目前各生殖中心比較公認(rèn)的透明帶開(kāi)孔技術(shù)。但是激光束對(duì)胚胎帶來(lái)的熱效應(yīng)影響了細(xì)胞的分化和發(fā)育值得關(guān)注，隨后很多學(xué)者對(duì)活檢物質(zhì)的安全性進(jìn)行了研究。Levin等[19]研究結(jié)果顯示，與未活檢的胚胎相比，極體活檢的D2和D3胚胎卵裂率、胚胎碎片、胚胎細(xì)胞數(shù)和胚胎質(zhì)量等均較差，極體的診斷效率低于卵裂球的診斷效率。Kirkegaard等[20]報(bào)道，經(jīng)過(guò)卵裂球活檢的胚胎形成桑葚胚、囊胚的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，透明帶厚度明顯增加，形成囊胚的直徑明顯減少。這說(shuō)明卵裂球活檢對(duì)胚胎的后續(xù)分裂發(fā)育存在著影響。Scott等[21]的研究則更有代表性，他認(rèn)為卵裂球活檢的胚胎著床能力比未活檢胚胎下降了39%，而在囊胚期活檢滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢與未活檢胚胎著床能力差別不大。囊胚的滋養(yǎng)層活檢雖然可獲得更多的細(xì)胞供診斷，嵌合率也顯著降低，但囊胚的培養(yǎng)技術(shù)要求較高，或者卵裂球發(fā)育的自我淘汰，使得囊胚形成率現(xiàn)在只有40%左右。體外培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)也可能對(duì)印記基因有一定的影響。另外胚胎植入子宮是要受內(nèi)膜種植窗的時(shí)間限制，如果想避免胚胎冷凍或者冷凍技術(shù)不完全成熟， PGD診斷的時(shí)間要受到嚴(yán)格控制，此時(shí)囊胚可供診斷的時(shí)間較短。

2.1.2 子代發(fā)育安全 隨著PGD子代的出生，其子代發(fā)育的安全性和生存質(zhì)量越來(lái)越受到人們的關(guān)注。目前，流行病學(xué)調(diào)查研究的PGD子代年齡還局限于出生后2～5年，因此仍然缺乏大樣本、前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究。Liebaers等[22]分析了581名PGD或PGS出生后的嬰兒，發(fā)現(xiàn)在多胚胎妊娠中PGD組的嬰兒圍產(chǎn)期死亡率(11.73%)高于ICSI組(2.54%)。Schendelaar等[23]前瞻性研究表明，PGD、PGS雖然不影響4歲單胎兒童的神經(jīng)系統(tǒng)、認(rèn)知能力及生長(zhǎng)發(fā)育，但接受輔助醫(yī)療護(hù)理(如語(yǔ)言訓(xùn)練、身體訓(xùn)練等)的比例高于對(duì)照組兒童；并且對(duì)于PGD、PGS雙胎而言，其神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受到影響。雖然近來(lái)對(duì)PGD子代的流行病學(xué)調(diào)查研究未提示胚胎活檢會(huì)影響行為發(fā)育，但是一些動(dòng)物的PGD模型研究帶給我們一些警示。在一組研究小鼠PGD模型活檢后妊娠發(fā)育情況，顯示PGD子代成年小鼠的神經(jīng)退行性病變的幾率增加。另外還有研究顯示，胚胎活檢對(duì)小鼠的腎上腺發(fā)育可能產(chǎn)生影響，從而改變小鼠對(duì)冷刺激的適應(yīng)[24]。盡管這些模式動(dòng)物研究從蛋白組學(xué)的角度認(rèn)為PGD對(duì)子代安全性有影響，但能否說(shuō)明會(huì)影響人類(lèi)PGD子代的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育還需進(jìn)一步研究。因此，對(duì)于PGD子代嬰兒期至成年期的安全性仍要持續(xù)關(guān)注。

2.2 無(wú)創(chuàng)胚胎植入前篩查技術(shù)進(jìn)展

胚胎植入前診斷為選擇遺傳學(xué)正常的胚胎進(jìn)行移植提供了可行方法，但其面臨著活檢損傷、誤診率、子代健康、倫理等諸多問(wèn)題，因此必須認(rèn)識(shí)到PGD作為一項(xiàng)侵入性的技術(shù)，仍然是把“雙刃劍”。鑒于未進(jìn)行PGD的單胚胎移植的出生率較低以及傳統(tǒng)PGD面臨的挑戰(zhàn)和安全性，目前胚胎學(xué)研究的方向傾向于探索更有效的無(wú)創(chuàng)評(píng)估體系來(lái)優(yōu)選最具發(fā)育潛能的胚胎進(jìn)行單胚胎移植。近幾年來(lái)，代謝組學(xué)分析、形態(tài)學(xué)分析以及無(wú)創(chuàng)胚胎染色體篩查技術(shù)通過(guò)無(wú)創(chuàng)傷性方式進(jìn)行胚胎植入前檢測(cè)已成為PGD技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

2.2.1 胚胎代謝組分析 胚胎代謝與胚胎活力有關(guān)，通過(guò)檢測(cè)胚胎培養(yǎng)液中的代謝物和分泌物再結(jié)合胚胎評(píng)估方法來(lái)優(yōu)選高潛能的胚胎,甚至還可以洞察到胚胎表現(xiàn)型。胚胎代謝物主要包括丙酮酸[25]、葡萄糖[26]、脂肪酸[27]、氨基酸[28]等，隨著胚胎培養(yǎng)體系的發(fā)展，通過(guò)對(duì)這些物質(zhì)的攝入量及代謝進(jìn)行分析可能挑選出具有發(fā)育潛能的胚胎。Sakkas等[29]研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的囊胚攝取的葡萄糖量較劣質(zhì)的多；Brison等[30]對(duì)胚胎培養(yǎng)液中氨基酸的改變研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酸、亮氨酸水平降低而天冬氨酸水平升高可能代表胚胎的代謝情況。這種改變有助于提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率。有學(xué)者[27]用氣相色譜分析培養(yǎng)液中脂肪酸的代謝, 顯示4細(xì)胞以上的胚胎相比4細(xì)胞以下胚胎其不飽和脂肪酸濃度升高,而飽和脂肪酸濃度降低,說(shuō)明植入前胚胎生長(zhǎng)代謝需要脂肪酸的存在。培養(yǎng)液代謝物檢測(cè)胚胎活力以其簡(jiǎn)單無(wú)創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn)，應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)技術(shù)包括光譜分析、質(zhì)譜聯(lián)用和磁共振等技術(shù)。2002年Houghton等[28]通過(guò)高效液相色譜法來(lái)分析不同階段的胚胎氨基酸的代謝和攝入量與囊胚形成的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)一些特定氨基酸的含量變化直接影響著囊胚的形成。2007年，Seli等[31]首次用拉曼光譜技術(shù)對(duì)受精后第1～3天的胚胎培養(yǎng)液分析，預(yù)測(cè)胚胎種植的靈敏度為75%，特異性為83.3%。2008年Seli等[25]用1H-NMR技術(shù)顯示培養(yǎng)液中高谷氨酸水平與臨床妊娠率和活產(chǎn)率有關(guān)。代謝組學(xué)作為一種新興的技術(shù)與方法，通過(guò)分析胚胎培養(yǎng)液中各種成分的改變來(lái)判斷胚胎的代謝和發(fā)育潛能，還可以檢測(cè)由于細(xì)胞破損而泄露的代謝物等[32]，能夠客觀、無(wú)創(chuàng)、全面地反映胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育情況，可作為無(wú)創(chuàng)胚胎質(zhì)量評(píng)估系統(tǒng)的內(nèi)容之一。

2.2.2 胚胎形態(tài)學(xué)分析 近年來(lái)，胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)估被普遍應(yīng)用于各個(gè)生殖中心，并且提出許多胚胎的評(píng)估動(dòng)態(tài)觀察指標(biāo)，主要包括胚胎的分裂速度、卵裂球發(fā)育的同步性、碎片的量等參數(shù)。一些回顧性研究也證明了妊娠結(jié)局與胚胎動(dòng)態(tài)指標(biāo)之間存在相關(guān)性。時(shí)差成像系統(tǒng)(TLI)是近年來(lái)發(fā)展的一種新的胚胎質(zhì)量影像評(píng)估體系，能自動(dòng)捕捉胚胎發(fā)育各個(gè)階段的形態(tài)以及發(fā)育發(fā)生的特定時(shí)間并將其合并成動(dòng)態(tài)影像，包括從受精卵到卵裂期胚胎或囊胚的一系列生物學(xué)變化，與胚胎發(fā)育潛能有著密切的關(guān)系[33]，從而為臨床上胚胎的篩選提供更多信息，以提高臨床妊娠率。Payne等[34]研究表明,從ICSI注射后到雙原核(2PN)相互靠近的間隔時(shí)間與胚胎質(zhì)量相關(guān),質(zhì)量好的胚胎較質(zhì)量差的胚胎間隔時(shí)間較短。2008年Lemmen等[35]研究表明原核消失時(shí)間早的胚胎發(fā)育潛能更好，優(yōu)質(zhì)胚胎的原核消失時(shí)間應(yīng)該是在受精后20h45min～25h之間。Meseguer等[36]研究表明最佳時(shí)間范圍內(nèi)卵裂的胚胎與此時(shí)間范圍之外發(fā)育的胚胎相比較,其著床率明顯較高。一套非侵入性早期胚胎活力評(píng)價(jià)系統(tǒng)(EEVA)已經(jīng)開(kāi)發(fā)，相關(guān)研究人員希望這套系統(tǒng)能夠成為一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)，用這些新的發(fā)育行為學(xué)指標(biāo)幫助技術(shù)人員更有效的評(píng)價(jià)胚胎質(zhì)量，并在臨床上取得良好的應(yīng)用。

2.2.3 胚胎游離DNA檢測(cè) Capalbo等[37]報(bào)道即使是形態(tài)學(xué)最高級(jí)別的囊胚也只有56%的染色體整倍體率。因此，對(duì)胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)分析和診斷是去除遺傳缺陷胚胎，選擇診斷正常胚胎植入子宮的唯一趨勢(shì)和方法，甚至可以提高妊娠率。因此，對(duì)培養(yǎng)液中胚胎來(lái)源的游離遺傳物質(zhì)進(jìn)行富集及遺傳分析來(lái)診斷胚胎染色體非整倍體疾病是目前唯一一種沒(méi)有侵入性的胚胎遺傳學(xué)診斷和分析技術(shù)。在2013年P(guān)oli等[38]就在囊胚期胚胎腔中發(fā)現(xiàn)了游離的核DNA引起了更多學(xué)者的研究， Magli等[39]通過(guò)對(duì)51對(duì)夫婦的116枚胚胎同時(shí)進(jìn)行了囊胚腔液檢測(cè)及胚胎細(xì)胞活檢，檢測(cè)結(jié)果分析顯示囊胚腔液游離DNA檢測(cè)能夠很好的反應(yīng)胚胎染色體的狀態(tài)。在2013年， Stigliani等[40]發(fā)現(xiàn)人卵裂期胚胎培養(yǎng)液中存在基因組DNA(gDNA)和線粒體DNA(mtDNA)，其mtDNA含量同胚胎發(fā)育水平、囊胚的形成及形態(tài)等具有相關(guān)性，培養(yǎng)液中mtDNA/gDNA值與胚胎質(zhì)量和片段化程度相關(guān)。他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胚胎3天培養(yǎng)的培養(yǎng)液中，mtDNA/gDNA增高與胚胎的優(yōu)選和移植率密切相關(guān)[41]。雖然這種DNA的存在還不能完全肯定其來(lái)源，但是如果作為胚胎來(lái)源的遺傳物質(zhì)，通過(guò)分析胚胎3天培養(yǎng)液中mtDNA/gDNA值，結(jié)合代謝組學(xué)以及形態(tài)學(xué)的分級(jí)，有可能作為一種新的非侵入性胚胎優(yōu)選指標(biāo)，提高識(shí)別早期胚胎活力與發(fā)育潛力。Capalbo 等[42]在胚胎培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)2種來(lái)源于滋養(yǎng)外胚層的miRNA，認(rèn)為可以作為評(píng)價(jià)胚胎潛能的生物學(xué)標(biāo)志物。隨后，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)液游離DNA的富集和基因組分析，在2014年一項(xiàng)研究顯示[43]，通過(guò)胚胎培養(yǎng)液中游離DNA的分析可以鑒別胚胎性別從而阻斷X-連鎖遺傳疾病的植入。2015年的一項(xiàng)研究通過(guò)胚胎培養(yǎng)液中游離DNA的檢測(cè)，篩查出地中海貧血的單基因突變，認(rèn)為這種檢測(cè)方法可以發(fā)展無(wú)創(chuàng)性的PGD進(jìn)行胚胎質(zhì)量的評(píng)估和遺傳病的篩查[44]。雖然目前對(duì)胚胎游離DNA的來(lái)源及釋放機(jī)制尚不十分明確，另一方面游離DNA的低產(chǎn)量和較差的完整性也為其臨床應(yīng)用帶來(lái)了挑戰(zhàn)，在臨床推廣可能尚需要一段時(shí)日。但是通過(guò)一些前期的研究，無(wú)創(chuàng)性的植入前胚胎潛能評(píng)估系統(tǒng)早已證明了其存在價(jià)值，其臨床需求正快速增加。

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[責(zé)任編輯：董 琳]

2016-09-29

2016-12-15

*通訊作者：wshsong@sina.com