doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.046

摘要：希金斯炭疽菌侵染菜心、蘿卜等十字花科植物引起炭疽病，給各國農業(yè)生產造成了巨大的經濟損失?；卺劸平湍傅湫偷牧姿峒〈继禺愋粤字窩（PI-PLC）序列，利用Blastp以及關鍵詞對該菌蛋白質數據庫進行比對、搜索，以及通過SMART分析，明確該菌存在8個典型的PI-PLC序列；通過生物信息學分析，明確上述PI-PLC序列在蛋白質二級結構組成、信號肽等方面均具有一定差異。遺傳關系比較分析明確該菌中的PI-PLC序列與禾谷炭疽菌（Colletorichum graminicola）、松針炭疽菌（C. fioriniae）等炭疽菌屬中的病菌具有較近的親緣關系。

關鍵詞：希金斯炭疽菌；磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C；亞細胞定位；二級結構；炭疽菌屬

中圖分類號：S432.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0177-04

收稿日期：2015-08-28

基金項目：國家自然科學基金（編號：31560211）；云南省森林災害預警與控制重點實驗室開放基金（編號：ZK150004）；云南省優(yōu)勢特點重點學科生物學一級學科建設項目（編號：50097505）；云南省高校林下生物資源保護及科用科技創(chuàng)新團隊項目（編號：2014015）；云南省教育廳科學研究基金（編號：2014Y330）。

作者簡介：韓長志（1981—），男，河北石家莊人，博士，講師，主要從事經濟林木病害生物防治與真菌分子生物學研究。Tel：（0871）63862918；E-mail：hanchangzhi2010@163.com。植物與病原菌互作過程中，眾多細胞信號轉導途徑參與其中，現已明確G蛋白信號途徑及其下游的MAPK信號傳導途徑和cAMP信號傳導途徑具有重要的作用。因此，學術界關于真菌RGS的研究產生了較多成果[1]，磷酸肌醇特異性磷脂酶C（PI-PLC）的一種異構體PI-PLC β為磷脂肌醇信號途徑PKC系統(tǒng)中的重要效應物[2]，可以將4，5-二磷酸磷脂酰肌醇水解為三磷酸肌醇和二酰甘油，而上述分子均作為細胞信號轉導的第二信使，發(fā)揮著重要作用。

希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、蘿卜等十字花科蔬菜引起炭疽病，該菌現主要分布于美國、日本、印度等國家[3-5]，在我國，由該菌侵染菜心引起的炭疽病成為影響菜心產量和品質的重要危害之一[6]。國內外對該菌的研究主要集中在病菌的生物學特性[7]、生防菌篩選[8]、遺傳轉化[9-10]以及不同營養(yǎng)元素（硅、氮、鉀等）[11-14]、外源酚酸類物質pHBA[15]控制病害等方面，同時，隨著該基因組序列的釋放[16]，林春花等對其開展了MAPK途徑相關基因的找尋及信號通路簡圖的繪制工作[17]，韓長志對其進行了RGS[18]、14-3-3[19]、septin[20]、AC、PITP等蛋白生物信息學分析。此外，對于該菌致病基因的研究，建立根癌農桿菌介導的轉化技術及直接重復重組介導的基因打靶等技術[9-10]。華中農業(yè)大學黃俊斌教授實驗室建立了希金斯炭疽菌轉化子的突變體庫，為進一步對這些轉化子基因功能研究提供了技術支持[21-22]。然而，對于該菌中存在的PI-PLC數量、功能尚不清楚。本研究利用釀酒酵母S288c（Saccharomyces cerevisiae S288c）中已經報道的PI-PLC氨基酸序列，通過在炭疽菌屬蛋白質數據庫中進行Blastp比對分析[23]，以及通過關鍵詞搜索，獲得與釀酒酵母PI-PLC同源的希金斯炭疽菌序列，并通過保守結構域分析、疏水性分析、二級結構預測位等生物信息學分析以及遺傳關系分析，以期為進一步開展希金斯炭疽病菌的研究提供重要的指導。

1材料與方法

1.1材料

根據釀酒酵母S288c中含有的1個PI-PLC氨基酸序列，利用炭疽菌屬蛋白質數據庫在線Blastp比對，同時通過輸入“phosphatidylinositol-specific Phospholipase”“Phospholipase C”“PLC”關鍵詞在上述數據庫中進行檢索PLC（表1）。

1.2方法

1.2.1保守結構域預測利用SMART網站[24]在線分析 PI-PLC所具有的保守結構域特征。

1.2.2蛋白質疏水性預測利用Protscale程序[25]對PI-PLC進行疏水性測定。

1.2.3蛋白質轉運肽及信號肽預測對蛋白質轉運肽的預測利用TargetP 1.1 Server在線分析實現[26]，信號肽的預測則是利用SignalP 3.0 Server[27]在線分析實現。

1.2.4蛋白質二級結構及跨膜區(qū)結構預測對蛋白質二級結構預測采用PHD[28]在線分析實現，利用TMHMM Server v. 2.0[27]實現PI-PLC的跨膜區(qū)結構預測。

1.2.5亞細胞定位分析利用ProtComp v 9.0實現PI-PLC的亞細胞定位分析[29]。

1.2.6系統(tǒng)進化樹構建在NCBI中，以希金斯炭疽菌中所含PI-PLC氨基酸序列為基礎，在線進行Blastp同源搜索，獲得來自不同物種的同源蛋白質序列。對所獲得的同源序列，利用ClustalX[30]進行多重比對分析，隨后利用 MEGA 5.2.2 軟件[31]構建系統(tǒng)進化樹。

2結果與分析

2.1希金斯炭疽菌中8個PI-PLC均具有典型的PLCXc或者PLCYc保守結構域

通過Blastp比對分析，共獲得10個同源序列，同時，利用3個關鍵詞搜索，分別獲得8、9、7個蛋白序列，對上述蛋白進行整理、去除重復，共獲得9個蛋白，其ID分別為CH063_08309.1、CH063_07411.1、CH063_07011.1、CH063_05432.1、CH063_04045.1、CH063_03075.1、CH063_02624.1、CH063_00149.1、CH063_00100.1（表1）。其中，發(fā)現一個蛋白序列（CH063_04045.1）僅可以通過Phospholipase-C搜索到，不能通過“phosphatidylinositol-specific Phospholipase”“PLC”搜索到，該蛋白通過Blastp也未能比對到，有待于進一步核實；隨后，利用SMART在線分析，結果顯示，僅有8條序列具有典型的PLCXc保守域結構，同時還具有諸如PLCYc、C2等保守結構域（圖1）。

對CH063_04045.1進行深入分析，明確該蛋白為肌醇鞘磷脂磷脂酶C，并不是G蛋白下游的效應因子，同時，基于SMART分析，該蛋白并不含有磷脂酶所含有的保守PLCXc或者PLCYc結構域，因此將該蛋白排除。根據上述分析，共獲得8條蛋白序列，依據其氨基酸大小進行排序，分別將其命名為ChPLC1、ChPLC2、ChPLC3、ChPLC4、ChPLC5、ChPLC6、ChPLC7、ChPLC8（表1）。

2.2ChPLC2具有典型的信號肽區(qū)域

通過SignalP分析，除ChPLC2在N端含有1個典型信號肽序列外，其他PI-PLC均不含有信號肽；同時，通過TMHMM分析，除ChPLC2在N端含有1個跨膜結構域外，其他PI-PLC均不含有跨膜結構域（圖1），鑒于TMHMM不能將蛋白中所含的信號肽與跨膜結構域嚴格區(qū)分，因此，ChPLC2在N端含有的序列結構是信號肽，而不是由TMHMM、SMART程序所預測的跨膜結構域（圖1）。

2.3希金斯炭疽菌PI-PLC均為親水性蛋白

通過疏水性分析，明確ChPLC1和ChPLC2、ChPLC3和ChPLC6、ChPLC4和ChPLC5在疏水性最強氨基酸殘基上相同，分別為L、I、V；ChPLC1和ChPLC8、ChPLC4和ChPLC6在親水性最強氨基酸殘基上相同，分別為R、E（表2）。盡管如此，其他PI-PLC彼此之間在親（疏）水性最強氨基酸殘基及位置方面仍然存在較大的差異（表2、圖2），推測在細胞信號轉導過程中，PI-PLC所具有的功能存在一定的差異性。

2.4二級結構分析

明確8個PI-PLC均含有無規(guī)卷曲、α-螺旋以及β-轉角，所占比例不盡相同。就所含的無規(guī)卷曲比例而言，ChPLC2最低，為17%，ChPLC8最高，為45%，其他PI-PLC所含比例集中于20%～35%；就所含的α-螺旋而言，ChPLC1最低，為5%，ChPLC7最高，為41%，其他PI-PLC所含比例集中于20%～40%；就β-轉角而言，ChPLC3最低，為5%，ChPLC1最高，為44%，其他PI-PLC所含比例集中于5%～25%（圖3）。

2.5轉運肽及亞細胞定位分析

轉運肽分析結果顯示，除ChPLC2明確定位于分泌途徑，ChPLC1、ChPLC4、ChPLC7定位于線粒體，其他PI-PLC定位在任何位置（表3）。為了更好地明確PI-PLC的亞細胞定位，利用ProtComp進行分析，結果顯示，ChPLC1、ChPLC7定位于線粒體，這與通過TargetP預測結果相同，ChPLC2定位于細胞膜，ChPLC3、ChPLC6定位于細胞核，ChPLC4、ChPLC5、ChPLC7定位于細胞質中（數據未顯示）。上述定位預測結果說明希金斯炭疽菌中數量眾多的PI-PLC定位情況不盡相同，在細胞信號轉導過程中發(fā)揮著不同的功能。

2.6遺傳關系分析

通過在NCBI中對PI-PLC進行Blastp比對，獲得與希金斯炭疽菌PI-PLC的同源序列，選擇炭疽菌屬真菌其他序列進行遺傳關系分析。結果顯示，就物種之間關系而言，該菌中的PI-PLC與禾谷炭疽菌、松針炭疽菌親緣關系較近；就該菌中的PI-PLC之間的關系而言，8個PI-PLC可以大致聚為五大類，具體而言，ChPLC6、ChPLC5、ChPLC7關系較近，為一類；ChPLC3與ChPLC1關系較近，為一類；ChPLC8、ChPLC4、ChPLC6各為一類。

3結論與討論

隨著希金斯炭疽菌全基因組序列的釋放[16]，為深入解析該菌致病因子研究提供了重要的數據支撐，一些涉及G蛋白信號轉導途徑上的重要效應物[18，32]以及MAPK途徑上的重要蛋白得到進一步明確[17]。本研究基于前人研究成果，明確了該菌中存在7個典型的PI-PLC，初步明確了上述蛋白具有典型的PLCXc、PLCYc、C2等保守結構域、均為親水性蛋白等特點。盡管如此，希金斯炭疽菌中8個PI-PLC彼此之間在亞細胞定位、信號肽、二級結構組成方面存在一定差異，推測上述蛋白在不同位置發(fā)揮不同作用，同時，對上述PI-PLC與其他物種進行遺傳關系分析，明確希金斯炭疽菌與松針炭疽菌親緣關系較近，為進一步深入研究其他炭疽菌屬真菌PI-PLC打下堅實的理論基礎。通過深入解析希金斯炭疽菌中G蛋白信號轉導過程中的致病因子，有助于為開發(fā)用于以G蛋白信號通路為作用靶標的化學藥劑提供重要的理論意義。

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