唐玲，曾許珍，張靜，張碧瑩，蔣和體*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市威利農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，重慶，404700)

大頭菜發(fā)酵菌株比例及發(fā)酵工藝優(yōu)化

唐玲1，曾許珍2，張靜1，張碧瑩1，蔣和體1*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市威利農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，重慶，404700)

選擇合適的發(fā)酵條件對大頭菜發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸和感官評價至關重要，首先進行菌株的組合優(yōu)化，通過優(yōu)勢菌群的構建和發(fā)酵菌株的配比優(yōu)化實驗確定適合大頭菜發(fā)酵的菌種比例為鼠李糖乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶短乳桿菌=3∶2∶3；然后以大頭菜為原料進行乳酸菌接種發(fā)酵，通過單因素實驗和正交試驗最終確定大頭菜的最佳發(fā)酵工藝條件為乳酸菌(鼠李糖乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶短乳桿菌=3∶2∶3)接種量2%， 食鹽濃度8%，發(fā)酵溫度27 ℃，發(fā)酵時間90 d。

大頭菜；乳酸菌；發(fā)酵；菌種比例；工藝優(yōu)化

大頭菜(Brassicajuncesvar.megarrhizaTsen et Lee)又名根用芥菜、辣疙瘩、諸葛菜[1]，屬于十字花科蕓薹屬，為1年或2年生草本植物，是一種以其膨大的肉質(zhì)根為產(chǎn)品器官的根用蔬菜。大頭菜富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、氨基酸、維生素A、維生素C、胡蘿卜素、鈣、鐵、磷等營養(yǎng)物質(zhì)[2-3]，含有豐富的膳食纖維，可促進結(jié)腸蠕動，防止便秘。

目前，傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜以自然發(fā)酵為主，該方法發(fā)酵時間較長，不利于品質(zhì)控制，在發(fā)酵過程中易面臨營養(yǎng)成分流失及亞硝酸鹽、大腸桿菌超標等不容忽視的問題，影響企業(yè)的經(jīng)濟效益，不利于工廠化、規(guī)模化和標準化。因此，如何保持產(chǎn)品品質(zhì)、提高安全性、縮短生產(chǎn)周期就成為研究的熱點[4-5]。接種發(fā)酵已較多運用到榨菜、泡菜等發(fā)酵中[6-8]，具有提升產(chǎn)品品質(zhì)、提高安全性和縮短發(fā)酵時間的作用，但將菌種接種到大頭菜中進行半固態(tài)發(fā)酵的研究甚少。因此，本文以重慶市巫山縣大頭菜原料生產(chǎn)基地的大頭菜為材料，旨在研究乳酸菌(鼠李糖乳桿菌、腸膜明串珠菌和短乳桿菌)的主要發(fā)酵特性，探索最佳的乳酸菌菌種比例，進行人工接種發(fā)酵大頭菜試驗，優(yōu)化發(fā)酵工藝，為乳酸菌發(fā)酵劑在大頭菜生產(chǎn)中的進一步研究和推廣應用提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

大頭菜：重慶市巫山大頭菜基地提供；食鹽(食用級)：購于重慶市北碚區(qū)永輝超市；鼠李糖乳桿菌(6001)、腸膜明串珠菌(6055)、短乳桿菌(6239)：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，醋酸鈉5 g/L，吐溫80 0.1 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，MnSO40.28 g/L，MgSO40.58 g/L，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

大頭菜汁培養(yǎng)基：將無病蟲害、體積適當?shù)男迈r大頭菜清洗干凈后，切塊，按照大頭菜與蒸餾水1∶1的質(zhì)量比混合于打漿機中打漿，過濾，再加入2%葡萄糖、1%蛋白胨，調(diào)pH 6.8；用于菌種特性檢驗和制備發(fā)酵劑。

AgNO3(分析純)：重慶川東化工(集團)有限公司；絡酸鉀(分析純)：重慶北碚化學試劑廠；NaOH(分析純)：重慶川東化工(集團)有限公司；無水乙醇(分析純)：成都市科龍化工試劑廠；酚酞(分析純)：重慶川東化工(集團)有限公司。

1.3 儀器與設備

FA2004A電子天平，上海精天電子儀器廠；R2070飛利浦攪拌機，飛利浦電子香港有限公司；HWS-26數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；7200可見分光光度計，優(yōu)尼柯(上海)儀器有限公司；DL-1電爐，中興偉業(yè)儀器有限公司；滴定裝置，上海精宏實驗設備有限公司；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；HH.BLL.600-S恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；不銹鋼手提式滅菌器DSX-280A型，上海申安醫(yī)療器械廠；無菌操作臺VD-650型，蘇州凈化設備有限公司；牛津杯(內(nèi)徑為6 mm，外徑為8 mm，高10 mm),上海申源科學儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將保藏于冰箱中的鼠李糖乳桿菌、腸膜明串珠菌、短乳桿菌3株乳酸菌的菌種分別接種于MRS培養(yǎng)基中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化36 h。然后在超凈工作臺內(nèi)，把已活化菌種接種至10 mL經(jīng)滅菌后的大頭菜汁培養(yǎng)基中于30 ℃下恒溫培養(yǎng)24～36 h。

1.4.2 乳酸菌的活化與培養(yǎng)

乳酸菌菌種活化與培養(yǎng)[9]：將稀釋后的乳酸菌液接種于MRS培養(yǎng)基，無氧條件37 ℃培養(yǎng)。將生長良好的單菌落進行劃線分離并分別接種，再次分別進行無氧條件和有氧條件培養(yǎng)，并將生長良好菌種標記后保存。

1.4.3 優(yōu)勢菌群的構建

參照張超[10]方法，按鼠李糖乳桿菌：腸膜明串珠菌：短乳桿菌不同比例(3∶0∶0、0∶3∶0、0∶0∶3、1.5∶1.5∶0、1.5∶0∶1.5、0∶1.5∶1.5、1∶1∶1)接入3%乳酸菌于鹽度為8%的大頭菜中，在30 ℃下進行發(fā)酵，90 d后對以上7組試驗(及自然發(fā)酵對照組)進行總酸含量測定，并進行感官評價，以確定菌株的優(yōu)勢菌群。

1.4.4 發(fā)酵菌株比例優(yōu)化

參照王巧[11]方法，根據(jù)所得出的優(yōu)勢菌群結(jié)果確定目標菌為鼠李糖乳桿菌、腸膜明串珠菌、短乳桿菌，通過拮抗試驗，確定3株目標菌之間沒有拮抗作用，運用正交助手軟件得到以下9組配比結(jié)果：1∶1∶1、1∶2∶2、1∶3∶3、2∶1∶3、2∶2∶1、2∶3∶2、3∶1∶2、3∶2∶3、3∶3∶1。根據(jù)配比按照質(zhì)量比制作菌劑。按質(zhì)量接種3%的菌種加入到鹽度為8%的大頭菜中，在30 ℃下進行發(fā)酵，90 d后對以上9組試驗進行總酸含量測定，并進行感官評價，以確定最優(yōu)的菌種組合。

1.4.5 大頭菜發(fā)酵工藝流程

菌種→活化→一次擴大培養(yǎng)→二次擴 大培養(yǎng)

↓接種或不接種

原料→清洗→晾曬→切塊→第一次加鹽→脫水→第二次加鹽→發(fā)酵→成品

1.4.6 大頭菜發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.4.6.1 食鹽濃度

按質(zhì)量分別添加6%、7%、8%、9%、10%的食鹽，在乳酸菌接種量為3%，27 ℃條件下發(fā)酵80 d，并對發(fā)酵大頭菜進行總酸含量測定及感官評價，研究食鹽濃度對大頭菜發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評價的影響。

1.4.6.2 乳酸菌接種量

按質(zhì)量分別接種1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%的乳酸菌，在食鹽濃度為8%，發(fā)酵溫度為27 ℃的條件下發(fā)酵80 d，并對發(fā)酵大頭菜進行總酸含量測定及感官評價，研究乳酸菌接種量對大頭菜發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評價的影響。

1.4.6.3 發(fā)酵溫度

按照大頭菜發(fā)酵工藝的流程，在鹽濃度為8%，乳酸菌接種量為3%的條件下，分別在18、21、24、27、30 ℃的條件下發(fā)酵80 d，并對發(fā)酵大頭菜進行總酸含量測定及感官評價，研究發(fā)酵溫度對大頭菜發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評價的影響。

1.4.6.4 發(fā)酵時間

按照大頭菜發(fā)酵工藝的流程，在鹽濃度為8%，乳酸菌接種量為3%，發(fā)酵溫度為27 ℃的條件下，分別發(fā)酵60、70、80、90、100 d，并對發(fā)酵大頭菜進行總酸含量測定及感官評價，研究發(fā)酵時間對大頭菜發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評價的影響。

1.4.7 大頭菜發(fā)酵工藝正交試驗設計

選取食鹽濃度(A)、乳酸菌接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)和發(fā)酵時間(D)單因素中較優(yōu)的發(fā)酵條件設計正交試驗因素水平表，在此基礎上，以總酸和感官評分作為評定指標，采取L9(34)正交試驗來確定最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件。采用多指標正交試驗的變異系數(shù)分析方法[12-13]對總酸和感官評分兩個指標進行計算得出綜合評定值。

1.4.8 分析測定方法

1.4.8.1 常規(guī)指標測定

OD值測定：用7200可見分光光度計，在吸收光波長600 nm處測定；總酸：按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，采用酸堿滴定法測定；pH：pH計直接測定；氯化鈉：按照GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測定》，采用直接沉淀滴定法。

1.4.8.2 感官評價方法

將大頭菜樣品放置于一次性塑料碗中，由經(jīng)過專業(yè)感官評價訓練的評審員10人對大頭菜的色澤(10分)、香氣(40分)、滋味(40分)、脆性(10分)進行感官評分，共計100分[1, 4]。最后根據(jù)評分結(jié)果來確定大頭菜質(zhì)量，具體大頭菜感官評分標準見表1。

表1 大頭菜感官評分標準

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢菌群構建及發(fā)酵菌株比例優(yōu)化

2.1.1 優(yōu)勢菌群構建

表2 接種發(fā)酵和自然發(fā)酵對大頭菜產(chǎn)酸和感官評分的影響

注：同一列的不同字母表示在P<0.05水平差異顯著。

接種發(fā)酵和自然發(fā)酵對大頭菜產(chǎn)酸和感官評分的影響見表2。由于目前沒有發(fā)酵大頭菜的相關標準，考慮到大頭菜質(zhì)地上與榨菜相似，因此參照GB6094—1985《榨菜》和GHT1011—2007《榨菜》標準，結(jié)合大頭菜自身半干態(tài)發(fā)酵的特點和工廠實際生產(chǎn)狀況，確定大頭菜出壇標準(即發(fā)酵成熟)為總酸含量(以乳酸計)5.40～10.0 g/kg。由表2可知，發(fā)酵90 d時，添加乳酸菌的大頭菜樣品酸度均達到了5.40 g/kg以上，對照組總酸含量僅為4.28 g/kg。當鼠李糖乳桿菌、腸膜明串珠菌、短乳桿菌3種菌混合使用時，發(fā)酵大頭菜總酸含量最高，總體產(chǎn)酸更快，感官評分最高。單菌株發(fā)酵的大頭菜與兩菌株混合發(fā)酵大頭菜總體總酸差異不顯著(P>0.05)；而對照組的大頭菜自然發(fā)酵90 d的總酸和感官評分與其他組總酸和感官評分相比差異顯著(P<0.05)。通過綜合比較，3種菌株混合使用產(chǎn)酸速度更快，感官評分更高。因此，下面對3種菌株混合進行進一步配比，以得出最佳配比結(jié)果。

2.1.2 發(fā)酵菌株比例優(yōu)化

由表3可見，第4組總酸含量最高，其次為第8組、第1組、第2組；第8組感官評分最高，其次為第4組、第7組、第1組。通過顯著性分析可知，第4組與第8組總酸含量差異不顯著(P>0.05)，但感官評分差異顯著(P<0.05)。因此，結(jié)合總酸和感官評價指標，鼠李糖乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶短乳桿菌=3∶2∶3組合更有利于大頭菜的發(fā)酵，可作為菌種最佳比例。

表3 不同混合菌株比例對大頭菜產(chǎn)酸和感官評分的影響

注：同一列的不同字母表示在P<0.05水平差異顯著。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 食鹽濃度對大頭菜發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評價的影響

由圖1可知，隨著食鹽濃度的增大，總酸含量逐漸降低，主要是因為乳酸菌活性受到抑制，使大頭菜發(fā)酵產(chǎn)酸速度減慢，出壇時間延長。經(jīng)過顯著性分析可知，在發(fā)酵80 d時，感官評價結(jié)果差異顯著(P<0.05)。通過感官評價發(fā)現(xiàn)，在8%的鹽度下，其香氣和滋味明顯優(yōu)于其他鹽度，原因可能與8%鹽度下微生物作用有關，既可以很好的抑制雜菌生長，又可以使大頭菜口感酸咸適中，香氣豐富。因此食鹽用量應在既不影響乳酸發(fā)酵，又能抑制雜菌生長的范圍內(nèi)。因此，結(jié)合大頭菜總酸和感官評價指標，選擇食鹽濃度8%為最佳。

圖1 發(fā)酵大頭菜的總酸和感官評分隨食鹽濃度的變化Fig.1 Change of fermentation kohlrbi’s total acid and sensory score with the salinity

2.2.2 乳酸菌接種量對大頭菜發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評價的影響

由圖2可知，隨著發(fā)酵的進行，總酸含量不斷升高，在發(fā)酵80 d時，乳酸菌接種量為4%的條件下大頭菜總酸含量最高，之后在5%的條件下大頭菜總酸含量有所降低，這主要是由于乳酸菌添加量過多時，乳酸菌自身生長需要消耗大量的糖，但卻減少了乳酸的生成[14]。在乳酸菌添加量為3%時，大頭菜感官評分最高，此時大頭菜總酸含量為5.62 g/kg。而且，接種量太高會造成大頭菜香氣與滋味較差，脆度低等不良影響，從而影響感官品質(zhì)。因此，選擇合適的接種量對大頭菜發(fā)酵過程中產(chǎn)酸和感官評價至關重要，綜上，選擇3%作為大頭菜發(fā)酵的較適接種量。

圖2 發(fā)酵大頭菜的總酸和感官評分隨乳酸菌接種量變化Fig.2 Change of fermentation kohlrbi’s total acid and sensory score with the inoculation amount of lactic acid bacteria

2.2.3 發(fā)酵溫度對大頭菜發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評價的影響

溫度是影響大頭菜發(fā)酵速度和質(zhì)量的一個重要因素。由圖3可知，發(fā)酵大頭菜的感官評分隨著溫度的升高呈先升高后降低的趨勢，27 ℃時感官評分最高，達到91.2分；在18 ℃時大頭菜總酸含量僅為4.21 g/kg，感官評分為73.2分，原因主要是當發(fā)酵溫度過低時，乳酸菌的生長代謝較慢，大頭菜較易感染雜菌，從而不利于總酸的生成和品質(zhì)的穩(wěn)定[15]；之后隨著溫度的升高，乳酸菌生長代謝加快，逐漸成為優(yōu)勢菌群，總酸增長較快。綜上，發(fā)酵溫度選為27 ℃較為合適。

圖3 發(fā)酵大頭菜的總酸和感官評分隨發(fā)酵溫度的變化Fig.3 Change of fermentation kohlrbi’s total acid and sensory score with the fermentation temmper ature

2.2.4 發(fā)酵時間對大頭菜發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評價的影響

由圖4可知，發(fā)酵大頭菜產(chǎn)生的總酸含量隨著發(fā)酵時間的延長呈增加趨勢，感官評分隨著發(fā)酵時間呈先升高后降低的趨勢。發(fā)酵大頭菜在70 d時已達到出壇標準，但隨著發(fā)酵進行，其感官評分進一步增加，在80 d時達到最高。綜上，發(fā)酵時間選為80 d較為合適。

圖4 發(fā)酵大頭菜的總酸和感官評分隨發(fā)酵時間的變化Fig.4 Change of fermentation kohlrbi’s total acid and sensory score with the fermentation time

2.3 正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗基礎上，以食鹽濃度、乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間為探討因素，以總酸和感官評分為評定指標，進行4因素3水平的正交試驗，正交試驗結(jié)果與分析見表4。

由表4正交試驗極差R可知，影響發(fā)酵大頭菜因素順序為：A>D>C>B，各因素的最佳組合為A2B1C2D3。由于該組合在正交試驗的9組試驗中出現(xiàn)，且此組合條件下綜合評定值最高，因此不需要再做該組的驗證試驗。在該組合的工藝條件下，大頭菜總酸為5.80 g/kg，感官評分為94.0分，故確定發(fā)酵大頭菜的最佳工藝條件為：食鹽濃度8%，接種量2%，發(fā)酵溫度27 ℃，發(fā)酵時間90 d。

試驗結(jié)果中，乳酸菌接種量(B)因素的極差R與其他因素差別較大，相比其他3個因素，此因素的影響較小。因此采用羅琳等[16]方法以極差最小的一項為誤差項進行方差分析，方差分析結(jié)果表明發(fā)酵溫度(C)和發(fā)酵時間(D)均對發(fā)酵大頭菜有顯著影響(P<0.05)，而食鹽濃度(A)對其有極顯著影響(P<0.01)。

表4 大頭菜發(fā)酵正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

選擇鼠李糖乳桿菌(6001)、腸膜明串珠菌(6055)、短乳桿菌(6239)3株乳酸菌作為大頭菜接種發(fā)酵的發(fā)酵劑，通過對發(fā)酵大頭菜的優(yōu)勢菌群構建結(jié)果表明接種發(fā)酵組的總酸含量和感官評分明顯高于自然發(fā)酵組，縮短了其發(fā)酵成熟期，提高了感官品質(zhì)。其中3種乳酸菌混合發(fā)酵的總酸含量和感官評分高于其他乳酸菌發(fā)酵組。發(fā)酵大頭菜混合菌株配比優(yōu)化試驗中，鼠李糖乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶短乳桿菌=3∶2∶3組合的效果最佳，更有利于大頭菜發(fā)酵。

由發(fā)酵大頭菜的單因素試驗得出：食鹽濃度、乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間均對大頭菜的品質(zhì)有影響。在此單因素試驗的基礎上對大頭菜的發(fā)酵條件進行正交試驗工藝優(yōu)化，經(jīng)分析得知，大頭菜發(fā)酵正交工藝優(yōu)化試驗中影響因素主次順序為食鹽濃度>發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>乳酸菌接種量，其中發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度為顯著性因素，食鹽濃度為極顯著因素。并根據(jù)各因素對發(fā)酵大頭菜的總酸和感官評分的影響結(jié)果，確定了大頭菜發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為：食鹽濃度8%，接種量2%，發(fā)酵溫度27 ℃，發(fā)酵時間90 d。在此條件下，發(fā)酵大頭菜的滋味更加鮮美，香氣更加純正濃郁，此時大頭菜總酸度平均值為5.80 g/kg，感官評分為94.0分。

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Optimization of strain ratio for turnips fermentation and related process

TANG Ling1, ZENG Xu-zhen2, ZHANG Jing1,ZHANG Bi-ying1, JIANG He-ti1*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China) 2(Chongqing Willie Agriculture Development Co., Ltd., Chongqing 404700, China)

Selecting appropriate fermentation condition is essential for acid production and sensory evaluation of turnip during its fermentation. Firstly, the combination of strains was optimized, and suitable strain ratio for turnip fermentation was determined asLactobacillusrhamnosus∶Leuconostocmesenteroides∶Lactobacillisbrevis=3∶2∶3 through construction of dominant bacteria and optimization experiment for proportion of strains fermentation. Then turnips were used as raw materials to carry out fermentation inoculated with lactic acid bacteria. Using single factor experiment and the orthogonal experiment, the optimum fermentation condition for turnips was determined as follows: lactic acid bacteria (L.rhamnosus∶L.mesenteroides∶L.brevis=3∶2∶3) inoculum was 2%, the salt concentration was 8%; the fermentation temperature was 27℃, and the fermentation time was 90 d.

kohlrabi;lactic acid bacteria; fermentation; strain ratio;process optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701015

碩士研究生(蔣和體教授為通訊作者,E-mail：jheti@126.com)。

重慶市“121”科技支撐示范工程(cstc2013jcsf-jcssX0033)

2016-06-08，改回日期：2016-09-09