邢亞萍，宋曉霞，丁胭脂，孔令非

子宮頸癌是全球女性常見的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例約528 000例，死亡約266 000人[1]。高危型人乳頭狀瘤病毒(high risk human papillomavirus, HR-HPV)持續(xù)感染是子宮頸癌的主要致病因素，其中HPV 16、18型是最常見的高危型，84.1%的浸潤性子宮頸癌是由其引起的[2]。子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(squamous intraepithelial lesions, SIL)是子宮頸癌的癌前病變，WHO(2014)子宮頸腫瘤分類將其分為低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesions, LSIL)和高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesions, HSIL)。SIL的發(fā)生、發(fā)展與HR-HPV感染密切相關，有學者認為不同程度子宮頸病變感染的型別不同，HSIL與子宮頸癌的關系密切，感染的主要亞型為HPV 16、18型。目前關于LSIL患者與HR-HPV的關系，學者們的觀點不太統(tǒng)一[3-4]。因此，本文采用兩種方法對LSIL的組織標本進行檢測，對其感染情況、HR-HPV亞型及感染方式進行分析和總結，重新探討LSIL與HR-HPV的關系。

1 材料與方法

1.1材料收集2015年8月～2016年8月河南省人民醫(yī)院病理科經(jīng)病理組織學診斷為SIL的石蠟標本328例，排除有子宮頸治療史及蠟塊保存不良影響的病例。所有標本均重新進行切片、HE染色，并由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師采用雙盲法進行閱片；兩人意見一致作為最終的病理診斷結果，意見不一時由主任醫(yī)師進行閱片，最終診斷為168例LSIL和160例HSIL。患者年齡17～78歲，中位年齡38歲。本實驗已通過醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2HE染色收集患者的石蠟標本進行切片，HE染色，顯微鏡下觀察，記錄LSIL和HSIL的病變部位。

1.3cobas4800HPV檢測HPV DNA提?。簩⑾瀴K標本切成5 μm厚薄片，取5片置于1.5 mL離心管中，脫蠟、裂解、熱水浴，最后過柱、離心。將DNA溶液作為擴增模板，加入TCT保存液，通過實時熒光定量(PCR)和核酸雜交技術擴增，檢測高危型HPV DNA，包括HPV 16、18及其他12種高危HPV亞型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)。QIAGEN試劑盒購自上海凱杰公司，cobas 4800分子診斷系統(tǒng)及HPV基因分型檢測試劑盒均購自羅氏公司；具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.4原位雜交法HPV檢測采用原位雜交法進行HPV 6、11、16、18、31、33、51的定型檢測，各型HPV DNA探針和檢測試劑盒均購自上海Leica公司，具體操作步驟如下：常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟處理，微波修復切片，加HPV探針，放入濕盒中37 ℃過夜，加入適量的一、二抗，滴加HRP多聚體、DAB顯色劑，鏡下觀察，顯色充分后PBS終止顯色，蘇木精復染、封固。以病變組織細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色沉積為陽性，無陽性著色為陰性。每批實驗均設陰、陽性對照。

1.5統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析；采用χ2檢驗、Fisher精確檢驗等方法進行數(shù)據(jù)處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1LSIL和HSIL的HE染色LSIL經(jīng)HE染色鏡下表現(xiàn)為表面上皮細胞排列改變或形成挖空細胞，表層細胞核出現(xiàn)非典型性，病變均集中在上皮表層。HSIL表現(xiàn)為細胞極性消失，出現(xiàn)異常核分裂象，核非典型性廣泛分布，主要集中在上皮下2/3層。

2.2HR-HPV在LSIL和HSIL中的分布HR-HPV總陽性率97.0%(318/328)，其中LSIL患者168例，HR-HPV陽性率95.2%(160/168)；HSIL患者160例，HR-HPV陽性率98.8%(158/160)；兩組患者HR-HPV陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.105)。LSIL、HSIL中HPV 16、18的陽性率分別為26.2%、57.5%，除HPV 16、18外的HR-HPV其他型陽性率分別為80.9%、55.0%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表1)。

表1 HPV感染亞型在LSIL和HSIL患者中的分布[n(%)]

LSIL：低級別鱗狀上皮內(nèi)病變；HSIL：高級別鱗狀上皮內(nèi)病變。*Fisher精確檢驗

2.3LSIL、HSIL中HR-HPV的感染方式原位雜交法檢測HPV DNA，光鏡下觀察HPV陽性病毒顆粒呈棕黃色，位于細胞核內(nèi)。LSIL中HR-HPV的陽性率為70.2%(118/168)。118例HR-HPV陽性患者中，89例患者的棕黃色陽性細胞局限在子宮頸鱗狀上皮表層，29例患者的陽性細胞位于上皮中表層，基底層未見陽性細胞(圖1)。HSIL檢測結果顯示子宮頸鱗狀上皮的基底層和副基底層可見HR-HPV陽性細胞(圖2)。推測LSIL中HR-HPV首先感染上皮表層，逐漸移向基底層(圖3)。傳統(tǒng)的觀點認為HR-HPV首先從基底層感染，引起LSIL、HSIL及子宮頸癌等一系列病變(圖4)，與本實驗結果不一致。

①②

圖1低級別鱗狀上皮內(nèi)病變的鱗狀上皮表層見大量棕黃色陽性細胞，原位雜交法圖2高級別鱗狀上皮內(nèi)病變的子宮頸鱗狀上皮基底層見棕黃色陽性細胞，原位雜交法

圖3 HR-HPV從子宮頸鱗狀上皮表層感染引起>低級別鱗狀上皮內(nèi)病變模式圖

圖4 傳統(tǒng)觀點：HR-HPV從基底層感染引起一系列子宮頸病變模式圖

3 討論

3.1LSIL與HSIL的組織學表現(xiàn)SIL分為LSIL和HSIL。Christopher等[5]對LSIL和HSIL進行重新定義：LSIL包括輕度異型增生(CIN1)、扁平濕疣、輕度異性增生、外生性濕疣、不成熟性濕疣、移行細胞乳頭狀瘤和乳頭狀不成熟化生；HSIL包括中度異型增生(CIN2)、重度異型增生(CIN3/原位癌)、角化性SIL和原位乳頭狀癌。本實驗對328例患者的切片行HE染色，在顯微鏡下觀察。LSIL患者的病變細胞均位于子宮頸鱗狀上皮表層，鏡下表現(xiàn)為鱗狀上皮厚度的改變，表層細胞染色過深或細胞核密度輕微增加，表面上皮細胞排列改變或空暈結構形成，表層細胞核出現(xiàn)非典型性。HSIL患者的病變細胞分布較廣泛，有的遍布全層，但細胞核的非典型性主要集中在上皮下2/3層，組織學特點為細胞核非典型性廣泛分布，核分裂指數(shù)增加，細胞極性消失，出現(xiàn)異常核分裂象。LSIL和HSIL的病理學表現(xiàn)及病變部位均存在明顯不同，LSIL患者中HR-HPV首先感染鱗狀上皮表層，引起表層細胞病變，逐漸移向基底部；HSIL患者中HR-HPV從上皮糜爛處感染基底層細胞，首先引起基底層細胞病變，逐漸向表層移動。

3.2不同HR-HPV亞型在LSIL、HSIL中的分布HPV的持續(xù)感染與子宮頸癌密切相關，尤其是HPV 16型[6]，宿主細胞感染后病毒DNA整合到宿主基因組中，導致E6、E7基因過度表達，E6、E7分別與抑癌基因p53、pRb結合，解除腫瘤的抑制功能，引起子宮頸鱗狀上皮的惡性增生，導致子宮頸SIL和子宮頸癌的發(fā)生[7]。目前已分離出200多種HPV，根據(jù)致癌危險性可將其分為LR-HPV和、HR-HPV兩類。HPV 6、11等12種亞型為低危型，主要引起LSIL等上皮細胞良性病變，HPV 16、18等14種亞型為高危型，主要引起HSIL和子宮頸癌等惡性病變[8-9]。有研究[10-11]表明，HSIL與子宮頸癌的關系密切，主要由HR-HPV感染引起的，尤其是HPV 16、18型，而對于LSIL患者HPV感染的主要亞型仍存在爭議。本實驗采用實時熒光定量PCR檢測技術對患者的石蠟標本進行HPV分型檢測。結果顯示：LSIL患者中HR-HPV的陽性率為95.2%，與本實驗組前期報道[12]結果一致。LSIL、HSIL中HPV 16、18陽性率分別為26.2%、57.5%， HR-HPV其他型陽性率分別為80.9%、55.0%，與Guan等[3]的觀點一致。因此HR-HPV感染與LSIL的發(fā)生密切相關，尤其是HR-HPV其他型，而HPV 16、18亞型與HSIL的關系更為密切。然而，LSIL患者的HR-HPV感染率高卻不易進展為HSIL和子宮頸癌，可能與其感染方式和HR-HPV型別有關，其具體致病機制有待進一步探討。

3.3LSIL、HSIL在原位雜交法檢測中陽性細胞的分布位置不同原位雜交法利用分子探針及堿基互補的原理進行HPV-DNA檢測，一種探針只與同源的核酸序列雜交，排除了交叉反應，根據(jù)顯示的陽性病毒顆粒所在的位置，可判斷HPV的感染方式，特異性強。本實驗采用HPV原位雜交法對LSIL患者進行檢測，結果顯示HR-HPV陽性率為70.2%(118/168)；另外，發(fā)現(xiàn)HR-HPV陽性的LSIL患者子宮頸組織鱗狀上皮表層均可見陽性細胞，因此作者推斷LSIL的HR-HPV感染開始于子宮頸鱗狀上皮表層。之前的研究[5]表明，從正常子宮頸組織到原位癌是一種有序的延續(xù)，LSIL和HSIL屬于同一個譜系，HR-HPV感染宿主細胞后，首先侵入子宮頸鱗狀上皮的基底細胞層，病毒DNA整合到宿主細胞內(nèi)，引起子宮頸病變，隨著基底細胞的分化成熟，病毒顆粒也逐漸向上皮表層移動。本實驗LSIL患者的陽性細胞局限于子宮頸鱗狀上皮的上1/2，基底層未見陽性細胞；HSIL患者的基底層見HR-HPV陽性細胞，提示LSIL中HR-HPV感染是從上皮表層開始，HSIL中HR-HPV感染是從基底層開始，LSIL患者并不易進一步發(fā)展為HSIL或子宮頸癌，因此LSIL和HSIL是兩個不同的譜系。HE染色的結果進一步證實該觀點。原位雜交技術突出表現(xiàn)了組織學形態(tài)變化和HPV的感染位置，與cobas 4800 HPV檢測相比其靈敏度較低，基底部陰性不能代表病毒DNA絕對不存在，本組結果顯示LSIL的陽性細胞均位于表層，而非基底層，陽性細胞的分布差異有一定的統(tǒng)計學意義。本實驗為探討HR-HPV與子宮頸SIL的關系提供了不同的方向，但研究不夠深入，結果存在一定的局限性。

綜上所述，HR-HPV感染不僅是HSIL、子宮頸癌的主要致病因素，也與LSIL密切相關，尤其是HR-HPV其他型。HR-HPV從子宮頸鱗狀上皮表層開始感染引起LSIL；從上皮基底層感染導致HSIL，本實驗通過HE染色和原位雜交兩種方法推斷HSIL不是由LSIL發(fā)展而來，其可以不經(jīng)過LSIL階段而自行發(fā)生。另外，HR-HPV感染引起的HSIL較LSIL更易進展為子宮頸癌，除了受HR-HPV整合狀態(tài)的影響，還可能與HR-HPV的型別及感染方式相關，其具體機制有待進一步分析。

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