正交試驗優(yōu)化山地五月茶總黃酮的提取工藝

鄭麗杰++袁曉強(qiáng)++王恭發(fā)++周丹

摘 要 通過單因素試驗，分析乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比、提取次數(shù)等對總黃酮提取率的影響，采用正交試驗確定山地五月茶總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果表明，山地五月茶總黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度85%、料液質(zhì)量體積比1∶10、提取溫度90℃，加熱回流提取2.0 h，提取3次。在此條件下，測得山地五月茶總黃酮的含量為（4.548 6±0.041 5）mg/g。本研究建立了山地五月茶總黃酮的提取工藝，可為山地五月茶資源的充分利用、研究開發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 山地五月茶 ；總黃酮 ；正交試驗

中圖分類號 TQ464 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.018

Optimization of Extraction Technology for Total Flavonoids from

Antidesma montanum Using Orthogonal Experiment

ZHENG Lijie1） YUAN Xiaoqiang2） WANG Gongfa1） ZHOU Dan1）

（1 School of Pharmacy， Hainan Medical University， Haikou， Hainan 571199；

2 Pharmacy Department， Xiantao First People's Hospital， Xiantao， Hubei 433000）

Abstract Total flavonoids were extracted from Antidesma montanum by using single-factor experiment to determine the effect of ethanol concentration， temperature， duration of sample extraction， solid-liquid ratio and extraction times on the extraction ratio of total flavonoids. An orthogonal experimental design was arranged to optimize the technology for extraction of the total flavonoids from A. montanum . The results showed that the optimal condition for extracting total flavonoids from A. montanum was as follows： 5% ethanol， solid-liquid ratio of 1∶10， temperature 90℃， and heat reflux extraction for 2 h and 3 times. Under the optimal condition， the total flavonoids content extracted from A. montanum was （4.548 6±0.041 5） mg/g. An optimal technology for extraction of total flavonoids from A. montanum was hence established， which would provide scientific data for further research， development and utilization of A. montanum germplasm resources.

Keywords Antidesma montanum ； total flavonoids ； orthogonal experiment

黃酮類化合物又稱生物類黃酮，是分布廣泛的次生物質(zhì)。黃酮類化合物有許多有益的生物學(xué)活性，如抗癌、鎮(zhèn)痛、抗炎抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、消除自由基等，能提高機(jī)體免疫力，對消化呼吸系統(tǒng)疾病有治療作用[1-2]，可廣泛用于醫(yī)藥、食品及化妝品等領(lǐng)域[3]。

山地五月茶（Antidesma montanum），是大戟科（Euphorbiaceae）五月茶屬（Antidesma）植物，主要產(chǎn)于廣東、海南、廣西等省區(qū)[4]。五月茶屬植物通常以根、葉、莖入藥，具有很好地藥理活性和開發(fā)前景。民間常用于治療眼疾[5]。目前，國內(nèi)外對山地五月茶的化學(xué)成分研究表明，山地五月茶含有黃酮類、甾萜類、生物堿類等化合物[6-8]。目前尚未見有關(guān)山地五月茶中黃酮的研究報道。本研究采用溶劑提取法提取山地五月茶總黃酮，利用正交試驗優(yōu)化設(shè)計山地五月茶總黃酮的提取工藝條件，并測定山地五月茶中總黃酮的含量，為山地五月茶黃酮類產(chǎn)品的研究開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

山地五月茶采自海南省萬寧市興隆縣，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室曾念開老師鑒定為山地五月茶。

1.1.2 儀器與試劑

儀器：UV-1800C型紫外-可見分光光度計（上海鳳凰儀器有限公司）；800B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AE-100型電子分析天平（南京庚辰科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)W100高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

試劑：蘆丁對照品（批號100080，中國食品藥品檢驗研究院）、無水AlCl3（天津市福晨化學(xué)試劑廠）、三水合乙酸鈉（西隴化工股份有限公司）、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙酸均購自廣州化學(xué)試劑廠，試劑級別為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備

稱取2.000 0 g干燥的山地五月茶粉末于100 mL圓底燒瓶中，加入95%乙醇20 mL，80℃下加熱回流提取2 h，離心過濾，提取3次，合并濾液，用95%乙醇定容至100 mL，搖勻，即得山地五月茶樣品溶液。

1.2.2 總黃酮的測定

采用 AlCl3顯色法測定山地五月茶總黃酮的含量[9]。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取105℃下干燥至恒重的蘆丁對照品0.020 40 g，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，搖勻，得0.204 0 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.2、1.3 mL于10 mL容量瓶中，加入3.20 mL 1.5% AlCl3，并用pH 5.5的NaAc-HAc緩沖液定容，搖勻。常溫下顯色反應(yīng)20 min后，在415 nm波長處測定吸光度。

1.2.4 樣品中總黃酮含量的測定

準(zhǔn)確移取樣品溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，按1.2.3進(jìn)行顯色、測定。根據(jù)線性方程計算樣品中總黃酮的含量。

1.2.5 單因素試驗

1.2.5.1 乙醇濃度對提取效果的影響

精密稱取2 g山地五月茶粉末5份，分別加入不同濃度的乙醇溶液20 mL（60%、70%、80%、90%、無水乙醇），80 ℃加熱回流提取2 h，離心過濾，提取3次，合并濾液，定容至100 mL，搖勻。按1.2.3方法測定樣品的吸光度。

1.2.5.2 提取溫度對提取效果的影響

精密稱取2 g山地五月茶粉末5份，加入90%的乙醇溶液20 mL，分別在50、60、70、80、90 ℃條件下加熱回流提取2 h，離心過濾，提取3次，合并濾液，定容至100 mL，搖勻。按1.2.3方法測定樣品的吸光度。

1.2.5.3 提取時間對提取效果的影響

精密稱取2 g山地五月茶粉末5份，加入90%的乙醇溶液20 mL，在90℃下分別加熱回流提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，離心過濾，提取3次，合并濾液，定容至100 mL，搖勻。按1.2.3方法測定樣品的吸光度。

1.2.5.4 料液比對提取效果的影響

精密稱取2 g山地五月茶粉末5份，分別加入12、16、20、24、28 mL的90%乙醇溶液（料液質(zhì)量體積比分別為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14），在90℃下加熱回流提取2 h，離心過濾，提取3次，合并濾液，定容至100 mL，搖勻。按1.2.3方法測定樣品的吸光度。

1.2.5.5 提取次數(shù)對提取效果的影響

精密稱取2 g山地五月茶粉末5份，加入90%的乙醇溶液20 mL，在90 ℃條件下分別加熱回流提取1、2、3、4次，每次2 h，離心過濾，合并濾液，定容至100 mL，搖勻。按1.2.3方法測定樣品的吸光度。

1.2.6 正交試驗

根據(jù)單因素結(jié)果，以樣品的吸光度為綜合考察指標(biāo)，選定提取溫度、乙醇濃度、料液比、提取時間4因素3水平，進(jìn)行正交試驗設(shè)計（表1），優(yōu)化山地五月茶總黃酮的提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。線性方程為A=0.031 7c-0.011 8，相關(guān)系數(shù)r =0.999 6。

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 乙醇濃度對提取效果的影響

由圖2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，山地五月茶總黃酮的提取率也越高。當(dāng)乙醇濃度為90%時，總黃酮提取率達(dá)到最大。之后，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取率明顯下降。黃酮類化合物種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其溶解度會因結(jié)構(gòu)、存在狀態(tài)及提取溶劑極性不同而有所差異。由圖2可以看出，乙醇的濃度不宜過高或過低。濃度過低，提取率下降，濃度過高會增加生產(chǎn)成本。因此選定85%、90%和95%作為正交試驗的3個水平。

2.2.2 提取溫度對提取效果的影響

由圖3可知，山地五月茶總黃酮提取率隨溫度升高而增加；當(dāng)提取溫度為90℃時，樣品中總黃酮提取率最高。為了保證實驗的安全，溫度不宜繼續(xù)升高。因此，選定80、85、90℃作為正交試驗的3個水平。

2.2.3 提取時間對提取效果的影響

由圖4可知，隨著提取時間的增加，總黃酮提取率逐漸增高?？梢姺磻?yīng)時間越長，提取越充分。當(dāng)提取時間為2 h時，總黃酮提取率基本穩(wěn)定。之后，提取時間的變化對總黃酮提取率影響不大。因此，選擇提取時間為1.5、2.0和2.5 h作為正交試驗的3個水平。

2.2.4 料液比對提取效果的影響

由圖5可知，總黃酮提取率隨著料液比的增加而逐漸增高。料液比越大，提取溶劑的用量越多，有利于總黃酮的提取。當(dāng)料液質(zhì)量體積比為1∶10時，總黃酮提取率基本穩(wěn)定。之后，料液比的變化對總黃酮提取率基本無影響，這意味著總黃酮已提取完全，繼續(xù)增加料液比會造成試劑的浪費。因此，選定料液質(zhì)量體積比為1∶8、1∶10、1∶12作為正交試驗的3個水平。

2.2.5 提取次數(shù)對提取效果的影響

由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮提取率有所增加。提取次數(shù)達(dá)到3次以上時，總黃酮提取率變化緩慢，當(dāng)提取4次時，達(dá)到最大值。實驗中對總黃酮的提取次數(shù)為3次。

2.3 正交試驗結(jié)果

結(jié)合單因素試驗的結(jié)果，對山地五月茶總黃酮的提取工藝進(jìn)行正交試驗設(shè)計（表2）。正交試驗結(jié)果如表2。

由表2、3可以看出，不同因素對山地五月茶總黃酮提取率的影響不同；極差的大小顯示了影響因素的主次，各因素對總黃酮提取率的影響大小依次為：提取溫度（A）>乙醇濃度（B）>料液比（C）>提取時間（D）；提取溫度（A）和乙醇濃度（B）對山地五月茶總黃酮提取率有顯著的影響。

綜合單因素試驗和正交試驗結(jié)果分析，山地五月茶總黃酮的最佳提取條件是A3B2C2D2，即乙醇濃度85%、料液質(zhì)量體積比1∶10、提取溫度90℃，加熱回流提取2 h，提取3次。

2.4 樣品中黃酮總含量的測定

為進(jìn)一步考察山地五月茶總黃酮的最佳提取條件的穩(wěn)定性，依據(jù)最佳提取條件，對山地五月茶樣品進(jìn)行提取、顯色、測定，平行測定3次。結(jié)果表明，山地五月茶中總黃酮的含量為（4.548 6±0.041 5）mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.38%。

3 結(jié)論

本研究對山地五月茶總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究。通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計，得到山地五月茶總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度85%、料液質(zhì)量體積比1∶10、提取溫度90℃，加熱回流提取2 h，提取3次。在此條件下對山地五月茶總黃酮進(jìn)行提取、顯色、測定，測得山地五月茶總黃酮的含量為（4.548 6±0.041 5）mg/g。

本研究建立的山地五月茶總黃酮的提取工藝，具有操作簡單，提取時間短，提取率高，綠色環(huán)保等特點。本研究將為山地五月茶資源的充分利用、研究開發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)。同時，以乙醇為溶劑對總黃酮進(jìn)行提取，整個過程中無污染、易回收和循環(huán)利用，是較為理想的提取方法。

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① 基金項目：海南省大學(xué)生創(chuàng)新項目（No.20140096）；海南醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項目（No.HYCX201336）。

收稿日期：2016-10-30；責(zé)任編輯/古小玲；編輯部E-mail： rdnk@163.com。

② 鄭麗杰（1994～），女，漢族，本科在讀。

③ 通訊作者：周 丹（1981～），女，副教授，碩士，研究方向為植物化學(xué)成分分析，E-mail： zhoudan1014@126.com。