申萌萌　劉雁峰　柳井杜莎　石玥　吳麗婷　穆國(guó)華　趙青竹

不孕不育是21世紀(jì)危害人類生殖健康的重要疾病之一，世界范圍內(nèi)育齡期夫婦不孕不育癥發(fā)病率約10%～15%[1]，我國(guó)育齡女性不孕癥發(fā)病率為7%-10%[2]。隨著二胎政策的放開(kāi)，越來(lái)越多的高齡婦女尋求生育幫助，但是人類輔助生殖技術(shù)(Assisted Reproductive Technology,ART)周期平均成功率約40%[3]。子宮內(nèi)膜容受性是影響其成功率的重要因素，也是國(guó)際相關(guān)研究的焦點(diǎn)難點(diǎn)問(wèn)題。子宮內(nèi)膜容受性[4]是指子宮內(nèi)膜在特定時(shí)期內(nèi)允許胚胎著床的能力，胚胎著床是胚胎在子宮內(nèi)膜定位、黏附、侵入等復(fù)雜生理過(guò)程。PI3K/Akt/eNOS是一條廣泛存在于細(xì)胞中的經(jīng)典信號(hào)通路，通過(guò)磷酸化或去磷酸化在體內(nèi)多個(gè)方面發(fā)揮重要作用，尤其在血管生成方面。血管生成是體內(nèi)一個(gè)非常重要的過(guò)程，它的正常進(jìn)行有助于胚胎侵入，實(shí)現(xiàn)血管重鑄，保證妊娠的順利進(jìn)行[5-6]。PI3K/Akt/eNOS通路可能參與調(diào)控這一過(guò)程。因此，本文探討PI3K/Akt/eNOS通路對(duì)胚胎植入和妊娠維持的作用，以期為改善子宮內(nèi)膜容受性、提高ART成功率的臨床和科學(xué)研究提供新思路。

一、PI3K/Akt/eNOS通路

PI3K/Akt/eNOS是位于內(nèi)皮細(xì)胞具有重要調(diào)控作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)是由P110催化亞基和P85調(diào)節(jié)亞基組成的異源二聚體，是一種具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性的胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶。雌激素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胰島素等信號(hào)分子與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合能夠?qū)麅?nèi)PI3K激活，被激活的PI3K在質(zhì)膜上磷酸化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)產(chǎn)生第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PIP3)。PIP3與胞內(nèi)信號(hào)蛋白絲或蘇氨酸蛋白激酶/蛋白激酶B(Akt/PKB)的PH結(jié)構(gòu)域和PDK1(phosphoinositi dependent kinase-1)結(jié)合，促使PDK1磷酸化Akt[7]，活化的Akt又能夠激活分布于血管內(nèi)皮的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)從而釋放具有擴(kuò)血管作用的一氧化氮(nitric oxide,NO)。

PI3K具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶活性，是由催化亞基p110和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基p85構(gòu)成的二聚體蛋白。根據(jù)p110結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和底物分子的不同可將PI3K其分為I型、II型、III型3個(gè)亞型。其中，I型PI3K被廣泛研究。p85亞基與蛋白激酶C、Ras蛋白等激活蛋白發(fā)生相互作用，激活p110亞基，從而活化PI3K[8]。被活化的PI3K通過(guò)磷酸化產(chǎn)生PIP3[9]。

Akt是PIP3下游主要分子之一。PIP3與Akt氨基末端的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，Akt的構(gòu)象發(fā)生改變并且Thr308和Ser473磷酸化位點(diǎn)被暴露[10-11]。激酶域的Thr308和調(diào)節(jié)域的Ser473是Akt磷酸化發(fā)生的兩個(gè)特殊位點(diǎn)，其中Ser473磷酸化位點(diǎn)是Akt活化所必需的位點(diǎn)之一。Akt通過(guò)磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)其活性?；罨腁kt 通過(guò)磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白的表達(dá)。

eNOS是Akt已知的下游底物之一，活化的Akt 可促進(jìn)eNOS蛋白表達(dá)。eNOS是一氧化氮合酶同工酶的一種，多分布于血管內(nèi)皮，催化左旋精氨酸(L-arginine)產(chǎn)生NO，NO具有擴(kuò)血管、增加血管通透性的作用。eNOS蛋白表達(dá)增加或絲氨酸殘基磷酸化可使eNOS活性上升。eNOS主要有Ser116、Thr495、Ser11773個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中Thr495磷酸化減弱eNOS活性，Ser1177磷酸化增強(qiáng)eNOS活性[12]。Ser1177位于eNOS羧基端的還原酶區(qū)，Ser1177磷酸化后使羧基端自抑控制區(qū)失活，還原酶區(qū)到氧化酶區(qū)電子流增強(qiáng)，eNOS的解離活化，從而使eNOS的活性提高[13]。

二、PI3K/Akt/eNOS通路與血管生成

血管生成是指從已經(jīng)存在的毛細(xì)血管和毛細(xì)血管后微靜脈形成新的毛細(xì)血管，主要包括激活血管基底膜降解；血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移；重建形成新的血管和血管網(wǎng)等過(guò)程。PI3K/Akt/eNOS通路能夠通過(guò)動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell,EPCs)、產(chǎn)生NO等方式，在血管生成以及血管修復(fù)中起到重要作用[14]。

PI3K/Akt/eNOS通路能夠動(dòng)員EPCs促進(jìn)血管再生和內(nèi)皮修復(fù)。EPCs又稱為血管內(nèi)皮干細(xì)胞，能夠歸巢于缺血部位，并參與血管的生理性和病理性重建[15]。陳永存[16]研究顯示阿托伐他汀可能通過(guò)激活PI3K/Akt/eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增加單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎間質(zhì)管周微血管密度，亦可通過(guò)該通路動(dòng)員EPCs促進(jìn)微血管再生，延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。秦臻等[17]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有他汀類藥物的作用，通過(guò)PI3K/Akt/eNOS通路促進(jìn)EPCs增殖、黏附、遷移，從而增殖、遷移、分化、替代、更新并修復(fù)受損動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。徐寒松等[18]研究證實(shí)黃芪多糖能夠增強(qiáng)Akt-Ser473、eNOS-Ser1177磷酸化蛋白的表達(dá)，通過(guò)PI3K/Akt/eNOS信號(hào)途徑增加EPCs的數(shù)量、促進(jìn)其增殖分化，改善血管內(nèi)皮的修復(fù)力，促進(jìn)血管生成和重建。Nana Yang等[19]發(fā)現(xiàn)一定劑量的載脂蛋白模擬肽反轉(zhuǎn)D-4F能夠通過(guò)PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路，促進(jìn)EPCs的增殖、遷移、血管生成，從而有利于阻止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)行。

活化的Akt可使eNOS磷酸化并激活，活化的eNOS產(chǎn)生NO，PI3K/Akt/eNOS通路主要通過(guò)產(chǎn)生NO發(fā)揮促進(jìn)血管生成作用。NO是高活性的自由基，它作為信號(hào)分子參與機(jī)體正常生理功能的調(diào)節(jié)，如舒張平滑肌細(xì)胞、抑制血小板活化、促進(jìn)血管再生和增加血管通透性等。王東彬等[20]研究發(fā)現(xiàn)腎上腺髓質(zhì)素(ADM)通過(guò)影響VEGF激活PI3K/Akt/eNOS通路，也可以直接激活PI3K/Akt/eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與腎腫瘤血管生成。趙婷[21]發(fā)現(xiàn)分別用Akt上游抑制劑Akt inhibitor Ⅳ、PI3K抑制劑LY294002以及eNOS抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)后，人的異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中SLIT2的表達(dá)較單純應(yīng)用雌激素組均下降，說(shuō)明雌激素可能是通過(guò)PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路誘導(dǎo)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中SLIT2的表達(dá)，從而促進(jìn)新生血管生成，利于異位子宮內(nèi)膜侵入。Shuzhen Li等[22]發(fā)現(xiàn)決明子素降血壓的機(jī)制可能與其激活內(nèi)皮的PI3K/Akt/eNOS通路有關(guān)，調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生和內(nèi)皮的完整性，促進(jìn)血管擴(kuò)張，終而達(dá)到降血壓的作用。

可見(jiàn)，PI3K/Akt/eNOS通路在體內(nèi)發(fā)揮促血管生成作用，通過(guò)動(dòng)員EPCs增殖、遷移、促管腔形成，以促進(jìn)血管生成和修復(fù)；主要通過(guò)產(chǎn)生NO，擴(kuò)張血管、增加血管通透性，促進(jìn)血管生成。

三、血管生成在胚胎植入和妊娠維持中的作用

血管生成是體內(nèi)許多生理病理改變的基礎(chǔ)。胚胎植入過(guò)程中，滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮螺旋小動(dòng)脈，代替血管內(nèi)皮，擴(kuò)張螺旋動(dòng)脈，使植入部位血流增加，子宮內(nèi)膜迅速蛻膜化。這一過(guò)程有賴于血管生成的正常進(jìn)行，最終發(fā)生血管重鑄，保證胚胎植入和妊娠維持[5,23]。

胚胎血管系統(tǒng)形成發(fā)育通過(guò)血管發(fā)生和血管生成兩種方式。妊娠早期主要通過(guò)血管生成的方式產(chǎn)生，中胚層間充質(zhì)細(xì)胞侵入到絨毛間質(zhì)[24]，原始毛細(xì)血管融合形成血管網(wǎng)，并連接到胚胎血管。胚胎血管系統(tǒng)形成在子宮內(nèi)膜蛻膜化過(guò)程中具有重要作用，也是胚胎植入和維持妊娠狀態(tài)的必要環(huán)節(jié)。血管生成的動(dòng)態(tài)平衡通過(guò)促血管生成因子和抑制血管生成因子的調(diào)節(jié)控制[25-27]，促血管生成因子產(chǎn)生增多或者抑制血管生成因子產(chǎn)生不足時(shí)，促血管生成因子占優(yōu)勢(shì)，引起血管生成。促進(jìn)血管生成的因子有血管內(nèi)皮生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、NO、白細(xì)胞介素等；抑制血管內(nèi)皮生成的因子有內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)、血管抑素(angiostatin)。

VEGF是一種肝素血管生長(zhǎng)因子，是特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和血管生成最重要的細(xì)胞因子。VEGF與其特異性受體VEGFR結(jié)合產(chǎn)生生物效應(yīng)：促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖；內(nèi)皮細(xì)胞遷移；管腔形成；增加血管通透性；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)等基因表達(dá)；單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞遷移。VEGF的這些生物效應(yīng)有助于血管生成，在胚胎植入和妊娠維持中具有重要作用，其異常表達(dá)與妊娠期高血壓疾病、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、流產(chǎn)、子癇等妊娠疾病有關(guān)[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)，受精第5天胚胎植入局部VEGF高表達(dá)，提示VEGF促進(jìn)血管生成和毛細(xì)血管網(wǎng)的建立，改善子宮內(nèi)膜容受性[30]，促進(jìn)胚胎植入[31-32]。Rowe等[31]用原位雜交技術(shù)檢測(cè)妊娠狨猴子宮內(nèi)膜，發(fā)現(xiàn)VEGFmRNA在腺上皮持續(xù)存在于妊娠期，說(shuō)明VEGF對(duì)妊娠的維持有重要作用。VEGF表達(dá)不足時(shí)，胚胎著床部位血管生成減少，早期絨毛生成不良，出現(xiàn)流產(chǎn)等[33]。王珺等[5]對(duì)38例不明原因早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)絨毛組織中VEGF進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其VEGF表達(dá)較正常妊娠絨毛組織低。說(shuō)明在母胎界面，低表達(dá)的VEGF使絨毛組織中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成和螺旋小動(dòng)脈的侵入障礙，胚胎缺血缺氧，終而導(dǎo)致RSA。

NO作為內(nèi)源性血管擴(kuò)張劑，使著床部位血管擴(kuò)張和血管通透性增加；另外，NO還可以激活平滑肌中的糖皮質(zhì)激素，使cGMP產(chǎn)生增多，增多的cGMP促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝入鈣離子并減少胞漿中的鈣離子，從而使平滑肌松弛[35]，這些都為胚胎植入和妊娠維持提供保障。黃睿等[34]還通過(guò)向小鼠腹腔內(nèi)注射NOS非特異性競(jìng)爭(zhēng)抑制劑L-NAME，發(fā)現(xiàn)L-NAME能競(jìng)爭(zhēng)性抑制NOS從而抑制NO的產(chǎn)生，影響胚胎著床，說(shuō)明NO在胚胎著床過(guò)程中起著重要的作用，這種作用可能是通過(guò)促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管通透性增加和胚胎發(fā)育而實(shí)現(xiàn)的。NO促進(jìn)植入期子宮內(nèi)膜蛻膜化，子宮內(nèi)膜蛻膜化是子宮內(nèi)膜為胚胎植入做準(zhǔn)備，表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜進(jìn)一步增厚、血供豐富、腺體分泌旺盛、基質(zhì)細(xì)胞肥大、含有豐富的糖原和脂滴。Ota等[36]發(fā)現(xiàn)抑制NO表達(dá)會(huì)延遲基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化，蛻膜細(xì)胞功能異常，嚴(yán)重影響胚胎植入。

MMPs是一類具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，在妊娠的各個(gè)時(shí)期發(fā)揮重要作用，VEGF和NO都可以促進(jìn)其表達(dá)與活化。在胚胎植入期，細(xì)胞外間質(zhì)組織被滋養(yǎng)層細(xì)胞組織產(chǎn)生的MMP降解，胚胎滋養(yǎng)組織侵入。但是過(guò)多的MMPs就會(huì)引起子宮內(nèi)膜異位癥[38]、胚胎過(guò)度植入而對(duì)傷害母體。NO還可以抑制子宮內(nèi)膜自然殺傷細(xì)胞(uterine nature killer cell，uNK細(xì)胞)的細(xì)胞毒效應(yīng)。uNK細(xì)胞是子宮內(nèi)膜間質(zhì)中表型為CD56bright的一群特殊細(xì)胞，直接細(xì)胞毒性弱，在分泌期和妊娠早期表達(dá)快速增加，通過(guò)分泌細(xì)胞因子和表面抗體對(duì)胚胎著床植入進(jìn)行調(diào)節(jié)。

四、雌激素通路和滋養(yǎng)細(xì)胞分化

在胚胎植入過(guò)程中，滋養(yǎng)細(xì)胞彼此融合，形成多核滋養(yǎng)細(xì)胞層，即合體滋養(yǎng)細(xì)胞層。合體滋養(yǎng)細(xì)胞層具有侵蝕性，能夠?qū)ψ訉m內(nèi)膜進(jìn)行初級(jí)侵襲[23]。雌激素為卵巢類固醇激素，其與孕激素相互協(xié)調(diào)調(diào)控胚胎植入和妊娠維持[39]。雌激素能夠與細(xì)胞表面雌激素受體結(jié)合，激活PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路，產(chǎn)生NO促進(jìn)血管生成與修復(fù)[40]。有實(shí)驗(yàn)[41]觀察體外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞向合體滋養(yǎng)細(xì)胞分化過(guò)程，用eNOS抗體對(duì)eNOS進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)合體滋養(yǎng)細(xì)胞陽(yáng)性，而細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞陰性，說(shuō)明eNOS產(chǎn)生的NO與細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞向合體滋養(yǎng)細(xì)胞分化有關(guān)。經(jīng)過(guò)初級(jí)侵襲后，合體滋養(yǎng)細(xì)胞改變其功能和表型。細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行分化，形成長(zhǎng)絨毛深入子宮內(nèi)膜和子宮肌層，形成絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞[23]。部分絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞形成血管滋養(yǎng)細(xì)胞，具有侵入子宮螺旋動(dòng)脈代替母體內(nèi)皮細(xì)胞的作用，擴(kuò)張螺旋動(dòng)脈，終而實(shí)現(xiàn)血管重鑄。

五、PI3K/Akt/eNOS通路在子宮內(nèi)膜容受性中的價(jià)值與意義

子宮內(nèi)膜容受性是影響ART成功率的重要因素，如何提高子宮內(nèi)膜容受性是ART技術(shù)研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。PI3K/Akt/eNOS是一條經(jīng)典信號(hào)通路，通過(guò)磷酸化或去磷酸化激活分布于血管內(nèi)皮的下游分子eNOS。eNOS是NO合成的限速酶，NO作為內(nèi)源性血管擴(kuò)張劑，具有舒張平滑肌細(xì)胞、抑制血小板活化、促進(jìn)血管再生和增加血管通透性等作用。PI3K/Akt/eNOS通路能夠通過(guò)動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞、產(chǎn)生NO等方式，尤其以產(chǎn)生NO為主要方式促進(jìn)血管生成。血管生成為胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞侵入螺旋小動(dòng)脈、擴(kuò)張螺旋動(dòng)脈、形成毛細(xì)血管網(wǎng)提供基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)血管重鑄，對(duì)提高子宮內(nèi)膜容受性，增加胚胎植入部位血流，以及胚胎植入后妊娠的維持，都起著非常重要的作用。另外，PI3K/Akt/eNOS還促進(jìn)胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞的分化。

由此可見(jiàn)，PI3K/Akt/eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以通過(guò)促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)層血管的生成和血管通透性的增加，有利于胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞植入子宮內(nèi)膜，為保證妊娠過(guò)程的進(jìn)行提供足夠的血液供應(yīng)，并促進(jìn)胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞的分化。本文對(duì)PI3K/Akt/eNOS通路對(duì)胚胎植入和妊娠的維持進(jìn)行綜述，以期為改善子宮內(nèi)膜容受性[37]、提高ART成功率的臨床和科學(xué)研究提供新的研究角度與思路。

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