任友花 王羿超++李娜 李雪++殷海松

摘要：芽孢桿菌已被廣泛應用于微生物肥料的生產。以巨大芽孢桿菌11433作為出發(fā)菌株，對其進行紫外誘變，根據平板解磷圈直徑與菌落直徑比值進行初篩，再根據解磷能力進行復篩，并最終獲得一株高效解磷菌。該菌株的搖瓶試驗結果表明，發(fā)酵3 d后，pH值從7.00降到了4.03，其解磷含量可達到46.79 μg/mL，較出發(fā)菌株11433的產量提高了115.62%，且其遺傳穩(wěn)定性良好。以得到的高產菌11433-D作為研究對象，對其解磷機理進行分析。發(fā)現有機酸的產生促進了解磷量的提高且使發(fā)酵液pH值降低。氣相色譜質譜和高效液相色譜檢測發(fā)現，巨大芽孢桿菌發(fā)酵液中的主要代謝產物為葡萄糖酸、乙酸、丙酸。

關鍵詞：巨大芽孢桿菌；誘變育種；解磷機理；高效液相色譜

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0537-03

收稿日期：2015-10-21

基金項目：天津市科技計劃（編號：14ZCZDTG0025）。

作者簡介：任友花（1989—），女，山東臨沂人，碩士研究生，主要研究方向微生物發(fā)酵制劑。E-mail：renyouhua123456@163.com。

通信作者：喬長晟，博士，教授，主要研究方向為生物高分子及食品生物學。Tel：（022）25328451；E-mail：qiaochangsheng@tust.edu.cn。

磷在農業(yè)中起到重要作用，土壤有效磷的缺乏導致植物減產[1-2]。磷肥的施用能夠促進各種代謝正常進行，植物生長發(fā)育良好，同時可提高植物的抗寒性和抗旱性。肥料中70%以上的水溶性磷與土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+等結合，轉化為難溶性磷酸鹽，很難被植物吸收利用[3]。然而巨大芽孢桿菌不但能分解有機磷物質，而且也能分解難溶性磷化合物[4]。因此，在農業(yè)上常被用來做磷細菌肥料。

紫外線是一種使用最早、沿用最久、應用廣泛、效果明顯的物理誘變劑。盡管幾十年來，不斷有各種新的誘變劑出現和應用于誘變育種，但到目前為止，經誘變處理后得到的微生物肥料高產菌中，有80%左右是通過紫外線誘變后篩選獲得的。紫外線迄今仍然是微生物育種中最常用和有效的誘變劑之一[5-6]。盧金珍等研究表明，采用蒙金娜有機磷培養(yǎng)基對巨大芽孢桿菌進行紫外誘變，其解磷能力達到16.85 mg/mL，比出發(fā)菌株提高了117.7%[7]。

微生物溶解無機磷的機理復雜，研究認為，一些微生物解磷主要是其分泌質子的溶解作用，另一些猜測認為是小分子有機酸的酸溶和螯合作用。虞偉斌等研究表明，有機酸的螯合作用是解磷菌K3解磷的主要機理[8]。研究表明，巨大芽孢桿菌有機酸主要代謝產物是葡萄糖酸、乳酸和乙酸[9]。伊鋆研究發(fā)現，產氣腸桿菌在溶磷過程中可能是主要通過增強細胞內TCA循環(huán)而增加體系能量，從而獲得較多種類和含量的有機酸[10]。

本試驗以解磷能力較強的巨大芽孢桿菌11433為出發(fā)菌株，進行紫外誘變，獲得高效解磷菌株，進而對解磷菌發(fā)酵液中的有機酸與溶磷量的關系進行了探索，為該菌株在微生物肥料中的應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗主要儀器（表1）和主要試劑

衍生化試劑：甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液（色譜純，Fluka公司），色譜純N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA），（購自Fluka公司）；色譜純吡啶（純度：99.8%），購自美國Sigma公司。試驗用水為Milli-Q超純水。葡萄糖酸、乙酸、檸檬酸等標準樣品，分析純。

1.2菌株與培養(yǎng)基

菌種來源：巨大芽孢桿菌11433，中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號1.223。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，氯化鈉 5 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.0～7.2，121 ℃ 20 min滅菌。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，K2HPO4·3H2O 6 g/L，KH2PO4 3 g/L，尿素1.5 g/L，酵母粉1 g/L，MgSO4·7H2O 041 g/L，pH值 7.0，121 ℃ 20 min滅菌。

無機磷發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，MnSO4·H2O 0.03 g/L，Ca3（PO4）2 5 g/L，pH值70～7.5，121 ℃ 20 min 滅菌。

無機磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，MnSO4·H2O 0.03 g/L，Ca3（PO4）2 5 g/L，瓊脂 20 g/L，pH值7.0～7.5，121 ℃ 20 min滅菌。

1.3高效解磷菌的篩選

1.3.1種子液制備將4 ℃斜面保存的巨大芽孢桿菌活化，將其分別劃線于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取活化的菌落，接于種子培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)20 h。

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)

將種子液按5%接種量接入無機磷發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)4 d，同時設置不接種作為對照培養(yǎng)。

1.3.3菌株的誘變處理方法

菌株的誘變處理采用紫外誘變方法，誘變處理的流程為：出發(fā)菌株孢子懸液→紫外誘變→根據解磷圈直徑與菌落直徑比值初篩→搖瓶復篩→斜面保存、遺傳穩(wěn)定性試驗。

將磁力攪拌器置于功率為30 W的紫外燈下30 cm處，打開紫外燈，以穩(wěn)定波長預先照射20 min殺菌。無菌移液管移取 1 mL，放入盛有99 mL無菌水的三角瓶中，振蕩5 min充分搖勻，使細菌分散。將樣品稀釋成為10-2 CFU/mL菌懸液。取5 mL制作的孢子懸液于直徑7 cm帶有轉子的平皿中。將平皿放在誘變箱的磁力攪拌器上，開啟磁力攪拌器，打開皿蓋，分別照射0、15、30、45、60、75、90、120 s。將照射處理的孢子懸液分別進行梯度稀釋，取各照射劑量10-8～10-5稀釋度的孢子懸液0.1 mL分別涂布平皿，每個梯度做3個平行。37 ℃ 避光的環(huán)境下，將平皿倒置培養(yǎng)18～26 h，觀察平皿上解磷圈和菌落的生長情況。以未經紫外線處理（處理 0 s）的孢子懸浮液涂布的平皿作對比，計算致死率，以紫外照射時間為橫坐標，致死率為縱坐標繪制致死率曲線。

1.3.4解磷菌的篩選

1.3.4.1解磷菌的初篩

根據誘變存活菌株在解磷培養(yǎng)基上形成的解磷圈直徑與菌落直徑比值觀察誘變效果，篩選比值大于出發(fā)菌株15%的為正突變，小于15%的為負突變，進行復篩。

1.3.4.2解磷菌的復篩

采用“1.3.1”節(jié)和“1.3.2”節(jié)的方法搖瓶培養(yǎng)，加入0.5%質量濃度經酸洗堿洗后的無磷活性炭，發(fā)酵液15 000 r/min，離心10 min，取上清液，據國標NY 412—2000中所述方法以鉬銻抗比色法測定速效磷含量。以菌株發(fā)酵液含磷量減去不接菌的空白對照發(fā)酵液含磷量衡量菌株的解磷能力，同時測定菌株不同時間段的pH值變化。

1.3.4.3遺傳穩(wěn)定性試驗

將篩選出的高產菌株D在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)轉接5代，根據鉬銻抗比色法測定有效磷含量，檢測其遺傳穩(wěn)定性。

1.3.5種子生長曲線測定

本試驗以菌株11433-D為研究對象，將甘油管保存的孢子懸液0.8 mL接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)18 h得到一級種子液。按2%的接種量將一級種子液接種至含300 μL培養(yǎng)基的生長板中，37 ℃條件下在全自動生長曲線分析儀上培養(yǎng)48 h，每隔2 h取樣測定1次D600 nm，3個平行樣。試驗結束后，根據培養(yǎng)過程中不同時間的吸光度，繪制D600 nm與培養(yǎng)時間（h）的關系曲線。

1.4解磷機理的探討

1.4.1氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）測定有機酸

無機磷發(fā)酵液離心—冷凍干燥—衍生化—氣質檢測。

1.4.1.1樣品的處理

取5 mL發(fā)酵液在10 000 r/min條件下離心10 min，取上清100 μL，加入10 μL內標混合液，混勻后真空冷凍干燥。

1.4.1.2樣品的衍生化

凍干后樣品加50 μL甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液（20 mg/mL），渦旋使凍干的樣品充分溶解，置于40 ℃水浴反應80 min；加80 μL MSTFA（N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺溶液，混合均勻，置于40 ℃水浴反應80 min；將衍生化后的樣品10 000 r/min離心5 min；取上清液100 μL裝于進樣瓶中，并編號，室溫放置2 h，準備進行GC-MS 檢測。

1.4.1.3主要色譜條件

色譜柱：硅色譜柱[DB-5MS，30 m （長）×0.25 mm（內徑）×0.25 μm（膜厚）]，購自J&W Scientific，Folsom，CA，USA；進樣量：1 μL；采用柱后分流技術，分流比為1 ∶[KG-*3]10；載氣：高純氦氣（純度：99.999 5%），購自北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司；恒壓模式：91 kPa；進樣口溫度：280 ℃；柱溫箱升溫程序：進樣后爐溫在 70 ℃ 保持 2 min，以5 ℃/min的速度升溫到290 ℃，保持 3 min，再降溫到70 ℃；GC-MS 接口溫度：280 ℃。

1.4.1.4主要質譜條件

電離方式：電子轟擊電離（EI+）；離子源溫度：250 ℃；電子轟擊能量：70 eV；離子電流：40 μA；掃描質量范圍：50～800 m/z。

1.4.2HPLC法測定有機酸

1.4.2.1色譜條件

高效液相色譜儀：Agilent technologies 1200 series；檢測器：紫外檢測器；色譜柱：Prevail有機酸柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：磷酸調pH值至2.5的 25 mmol/L K2HPO4 溶液；流速：0.5 mL/min；檢測波長：210 nm；進樣量：5 μL；柱溫：20 ℃。

發(fā)酵液中有機酸的測定：取發(fā)酵液5 mL，10 000 r/min離心，取上清液，稀釋10倍，過0.22 μm微孔濾膜，利用高效液相色譜測定所產有機酸。

1.4.3測量指標

對發(fā)酵液每隔12 h取樣測定1次，測定pH值、有機酸和有效磷含量，并且對發(fā)酵液進行平板計數。

發(fā)酵液pH值用pH計測定。解磷能力據國標NY412—2000中鉬銻抗比色法測定有效磷含量。計數根據稀釋涂布平板法計數。有機酸采用儀器GC-MS和HPLC測定。

2結果與分析

2.1紫外誘變篩選高效解磷菌

2.1.1紫外誘變的致死率曲線

由圖1可見，紫外照射時間為45 s時，致死率達到了72%，當照射時間分別為15 s和30 s 時，致死率分別為30%和51%。對于不同的菌株，在不同的致死率下，其正突變率不容易確定，所以為了增加高效磷細菌篩選的概率，本研究采取高、中、低3個致死率下對應的照射時間45、30、15 s分別對菌株11433的孢子懸液進行處理，處理完畢后將3個致死率下的菌液混合均勻，用于高產菌株的篩選。

2.1.2初篩、復篩高效解磷菌

在照射功率為30 W、照射距離為30 cm條件下對11433進行紫外誘變，選取照射時間為15、30、45 s以及經照射后三者的混合液在黑暗條件下進行稀

[TPQCS1.tif]

釋涂布平板，分別標記為A、B、C和D。根據菌落在平板上產生的解磷圈直徑與菌落直徑的比值，篩選比值大于出發(fā)菌株[JP3]15%的為正突變，小于15%的為負突變，鑒定誘變效果（表1）。

根據初篩菌株，選取表1中的正向突變菌株測定解磷能力。根據4個菌株的解磷能力，其中D菌株的解磷能力最強。結果發(fā)現，經搖床培養(yǎng)12 h誘變菌株的有效磷含量比出發(fā)菌株高出36%，培養(yǎng)24～72 h突變菌株D有效磷含量比出發(fā)菌株高出48%～115.62%，其中培養(yǎng)72 h有效磷含量達到最大，為46.79 μg/mL，比出發(fā)菌株高出115.62%。培養(yǎng) 72～84 h時，解磷能力有所下降，pH值也逐步升高（圖2）。

2.1.3高產菌株11433-D的遺傳穩(wěn)定性試驗

將篩選出的高產菌株D在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)傳代5次，解磷量穩(wěn)定在43.29～46.71 μg/mL（表2），表明該菌株的遺傳性能穩(wěn)定。

2.1.4菌株種子生長曲線的確定

測定11433-D的生長曲線，有利于了解種子的生長狀態(tài)，對指導發(fā)酵生產具有重要意義。從圖3可以看出，菌體在培養(yǎng)8 h左右達到對數生長期，根據試驗安排，選取處于對數生長期中期，18 h左右的種子液進行接種試驗，此時的種子液為乳白色，并具有特殊氣味，染色鏡檢時，菌絲體致密。

[TPQCS3.tif]

2.2解磷機理研究

根據氣相色譜-質譜聯用儀的測定結果（表3），對發(fā)酵液中的有機酸進行分析，發(fā)現峰值最高的是葡萄糖酸，峰值最低的是乙酸，匹配度較高的是硬脂酸、棕櫚酸和葡萄糖酸，匹配度較低的是戊酸、2-丁烯酸。由于在解磷作用發(fā)揮主要功能的是小分子有機酸，所以對匹配度相對較高的有機小分子酸（葡萄糖酸、乙酸、丙酸、丁酸）進行液相分析，以期在發(fā)酵液中快速檢測到有機酸。結果發(fā)現，菌株產生3種有機酸，分別為葡萄糖酸、乙酸和丙酸。

通過對解磷菌11433-D發(fā)酵液中解磷能力、活菌數進行檢測，發(fā)現0～12 h菌處于對數生長期，菌數快速增到8×109 CFU/mL，pH值下降到6.56，12～36 h菌體生長處于穩(wěn)定期，菌數維持在3×1010 CFU/mL，達到最大值，發(fā)酵液中有機酸以葡萄糖酸為主，此外，還有乙酸和丙酸。36～84 h主要產生葡萄糖酸，且36 h開始有少量乙酸分泌，48 h開始產生丙酸。發(fā)酵液pH值伴隨有機酸的分泌一直在下降。12～84 h發(fā)酵液中有效磷含量從12.25 μg/mL上升至46.58 μg/mL。試驗發(fā)現解磷量與pH值、小分子有機酸有關。

3結論

本研究采用紫外誘變對巨大芽孢桿菌進行誘變處理，獲得1株高效突變菌株11433-D，該菌株解磷量達 46.79 μg/mL，比出發(fā)菌株高出115.62%，經連續(xù)傳代5次，其遺傳穩(wěn)定性非常高。經GC-MS和HPLC檢測發(fā)現， 該菌能[CM（25]產生葡萄糖酸、乙酸和丙酸。有機酸的變化直接影響磷含[CM）]

量的變化。試驗結果為更好地研究解磷菌在土壤中發(fā)揮作用奠定了一定的理論基礎。

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