肖茜文，王艷蕊，劉 桐，劉 爽，何 苗，任大勇，陳 萍

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林省安信食品技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春 130012）

沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌DNA提取方法的比較

肖茜文1，王艷蕊1，劉 桐1，劉 爽1，何 苗2，任大勇1，*陳 萍1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林省安信食品技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春 130012）

采用水煮法、試劑盒法、改良CTAB法、DNA提取液法及TEX裂解液法提取沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA，比較5種方法提取的DNA品質(zhì)，選取適用于農(nóng)產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌多重PCR檢測(cè)的DNA提取方法。結(jié)果表明，TEX裂解液法提取的DNA純度高、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、成本低，提取的沙門(mén)氏菌基因組DNA純度為1.88，質(zhì)量濃度為412.6 ng/μL；金黃色葡萄球菌DNA純度為1.84，質(zhì)量濃度為366.7 ng/μL。以TEX裂解液法提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物有清晰的目的條帶。

沙門(mén)氏菌；金黃色葡萄球菌；基因組DNA提取

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌是農(nóng)產(chǎn)品中致病菌檢測(cè)的常檢項(xiàng)目；食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量規(guī)定，肉制品、糧食制品、即食豆制品、即食果蔬制品（含醬腌菜類(lèi)）等農(nóng)產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌為安全衛(wèi)生必檢項(xiàng)目[1]。為縮短檢測(cè)周期，農(nóng)產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌可應(yīng)用多重PCR同時(shí)檢測(cè)，在進(jìn)行PCR檢測(cè)之前需同時(shí)快速高效地提取出品質(zhì)優(yōu)良的2種致病菌基因組DNA。

金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁較厚，不易裂解，有些金黃色葡萄球菌自身還分泌一種耐熱核酸酶可降解核酸，使DNA提取難度加大[2]。目前，提取沙門(mén)氏菌基因組DNA的方法有很多，但這些方法并不能同時(shí)有效地提取金黃色葡萄球菌基因組DNA。為了提高檢測(cè)效率、簡(jiǎn)化檢測(cè)程序、降低檢測(cè)成本、保證檢測(cè)正確性，試驗(yàn)就快速有效提取沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA的方法進(jìn)行研究比較，進(jìn)而縮短農(nóng)產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌多重PCR檢測(cè)的時(shí)間，便于實(shí)際檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

沙門(mén)氏菌（Salmonella spp.）ASI1859、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） CMCC21600，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；沙門(mén)氏菌invA基因特異性引物、金黃色葡萄球菌nuc基因特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；2×Taq PCR StarMix with Loading Dye，DNA MarkerDL2000、溶菌酶、蛋白酶K等，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器

722E型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；Red-96G型梯度PCR儀，上海山富科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-12C型電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備

從冷凍管中取出100 μL保存菌液放入100 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，于37℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的菌液用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)瑒澠桨澹?7℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落至100 mL LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。菌液于4℃條件下保存，用于基因組DNA的提取。

1.3.2 細(xì)菌基因組DNA提取方法

取沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌菌液各1 mL加入1.5 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心2 min，棄上清液，備用。

（1）水煮法。細(xì)菌沉淀用滅菌ddH2O洗滌2次，每次100 μL，離心后棄上清液，用100 μL滅菌ddH2O懸浮沉淀，煮沸15 min后以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min，取上清液作為DNA模板，于-20℃條件下保存[3]。

（2）試劑盒法。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Tiangen），參照說(shuō)明書(shū)的操作步驟完成。

（3）TEX裂解液法。細(xì)菌沉淀用90 μL TEX裂解液（20mmol/LTris-HCl，20mmol/LEDTA，1%（V/V）TritonX-100（pH值8.0），加入20 mg/mL溶菌酶）混懸，于37℃條件下孵育30min，再加20mg/mL蛋白酶K 10 μL，于100℃條件下煮沸10 min，離心后取上清液作為DNA模板[4]。

（4）DNA提取液法。細(xì)菌沉淀用100 μL DNA提取液（20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，1.2%（V/V）TritonX-100（pH值8.0））混懸，于56℃條件下孵育30 min，后沸水浴10 min，冰上放置10 min；以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心2 min，上清液即為DNA模板[5]。

（5）改良CTAB法。離心后得到細(xì)菌沉淀，進(jìn)行液氮研磨，依次加入10%SDS 30 μL，高鹽緩沖液（Tris-Cl 50 mmol/L，pH值8.0；EDTA 10 mmol/L；NaCl 0.7 mol/L；CTAB 1.5%）150 μL，80 μL CTAB/ NaCl，并分裝到1.5 mL的離心管中，于60℃條件下水浴40min；加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），輕輕混勻，于4℃條件下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min；取上清液，加入400 μL異丙醇混勻，于4℃條件下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min；棄上清液，加入70%的乙醇洗滌沉淀，自然晾干后，用100 μL含有胰RNA酶（20 mg/mL）的TE溶解DNA，于-20℃條件下冷凍保存?zhèn)溆肹6]。

2.4 基因組DNA濃度和純度的測(cè)定

提取的沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)量其在波長(zhǎng)260，280 nm處的OD值，計(jì)算基因組DNA濃度和純度OD260/280。

2.5 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[7]，選擇沙門(mén)氏菌invA基因?yàn)榘谢?，其引物為：正向引?'-gtcatgatattccgccccatatt-3'，反向引物5'-cggtgcgatgaagtttatcaaag-3'；選擇金黃色葡萄球菌nuc基因?yàn)榘谢?，其引物為：正向引?'-gctaagcaaatgcatcataaac-3'，反向引物5'-agcgtt gtcttcgctccaaa-3'。反應(yīng)體系：2×Taq PCR Star Mix with Loading Dye 12.5 μL，DNA模板1 μL，引物濃度0.1 μmol/L，加ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，進(jìn)行凝膠成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 比較5種不同方法提取的基因組DNA

不同方法提取沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌基因組DNA比較見(jiàn)表1。

表1 不同方法提取沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌基因組DNA比較

為評(píng)價(jià)不同方法提取的基因組DNA品質(zhì)，分別對(duì)5種方法提取的基因組DNA進(jìn)行濃度和純度比較。由表1可知，水煮法提取的基因組DNA質(zhì)量濃度最高，之后依次為試劑盒法、TEX裂解液法、改良CTAB法、DNA提取液法。水煮法提取的基因組DNA純度最低，原因是水煮法提取的基因組DNA中含有較多的雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)等），符合Psifidi A等人[8]的研究結(jié)果；試劑盒法和TEX裂解液法提取的基因組DNA純度較高，且OD260/280值均在1.8～2.0。試劑盒法提取基因組DNA純度和質(zhì)量濃度都是最為理想的，但是其操作步驟復(fù)雜、成本高；而TEX裂解液法操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力，大大節(jié)省了檢測(cè)成本。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

不同方法提取基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)圖1。

圖1 不同方法提取基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

以5種方法提取的沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。由圖1（a）可知，5種方法提取的沙門(mén)氏菌DNA均能夠成功用于沙門(mén)氏菌invA基因的擴(kuò)增，目的片段大小為255 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后得到清晰的目的條帶；TEX裂解液法和試劑盒法提取的沙門(mén)氏菌基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶最為清晰明亮。由圖1（b）可知，除水煮法外其他4種方法提取的金黃色葡萄球菌DNA，均能夠成功用于金黃色葡萄球菌nuc基因的擴(kuò)增，目的片段大小為506 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后都得到清晰的目的條帶；試劑盒法和TEX裂解液法提取的金黃色葡萄球菌DNA條帶清晰，DNA提取液法提取的DNA擴(kuò)增條帶有拖尾現(xiàn)象。

2.3 多重PCR檢測(cè)TEX裂解法提取的基因組DNA

以TEX裂解液法提取的沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

多重PCR檢測(cè)TEX裂解液法提取的基因組DNA見(jiàn)圖2。

3 討論

細(xì)菌基因組DNA提取制備的品質(zhì)是決定PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，如果提取時(shí)不能完全釋放DNA，或未去除干凈的蛋白質(zhì)、有機(jī)試劑殘留在所制備的模板中，都可能導(dǎo)致后續(xù)的PCR反應(yīng)效率和靈敏度降低，甚至導(dǎo)致反應(yīng)失敗。目前，細(xì)菌基因組DNA的提取方法有很多，試驗(yàn)選擇5種提取方法對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取效果進(jìn)行比較。找到簡(jiǎn)易高效、穩(wěn)定可靠同時(shí)提取沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA的方法，用于農(nóng)產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌多重PCR檢測(cè)。

圖2 多重PCR檢測(cè)TEX裂解液法提取的基因組DNA

水煮法所需費(fèi)用低、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，與其他方法相比，提取的基因組DNA質(zhì)量濃度顯著增加，但DNA純度顯著降低，同時(shí)因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌細(xì)胞壁較厚，水煮法并不能對(duì)其進(jìn)行有效地提取。改良CTAB法是目前最常用的基因組DNA提取方法，所需費(fèi)用低，但操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、DNA損失量大，且使用的有機(jī)溶劑有污染和毒性作用。試驗(yàn)使用改良CTAB法提取DNA的OD260/280值不理想，可能是殘留的有機(jī)溶劑或所用溶劑去除蛋白的能力有限所導(dǎo)致，與Murray J R等人研究結(jié)果相同[9]。TEX裂解液法和DNA提取液法避免了有機(jī)溶劑對(duì)人體的危害，操作省時(shí)省力。TEX裂解液法樣本裂解更為充分,蛋白質(zhì)消化更為完全，溶菌酶使金黃色葡萄球菌破除細(xì)胞壁，釋放細(xì)胞內(nèi)DNA。商業(yè)試劑盒法提取基因組DNA效率高且可減少有機(jī)試劑對(duì)人體的傷害，近年來(lái)得到普遍的認(rèn)可和應(yīng)用，但是商業(yè)試劑盒成本較高，如不考慮成本的因素，試劑盒法最為理想。在實(shí)際現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)過(guò)程中，需要大批量檢測(cè)樣本，基層單位在檢測(cè)過(guò)程中對(duì)成本的限制較大，需要在保證檢測(cè)品質(zhì)的同時(shí)降低成本，以適應(yīng)市場(chǎng)的需求。TEX裂解液法在保證提取DNA品質(zhì)的同時(shí)，成本大大低于試劑盒法。

因沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌為農(nóng)產(chǎn)品致病菌檢測(cè)中必檢項(xiàng)目，通過(guò)多重PCR可對(duì)2種致病菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。經(jīng)試驗(yàn)比較后，選擇TEX裂解液法對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行同時(shí)提取，為后續(xù)PCR檢測(cè)找到了經(jīng)濟(jì)適用、操作簡(jiǎn)單快速的基因組DNA提取方法。

[1]中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量GB 29921—2013[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[2]唐俊妮.金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶相關(guān)基因的功能與特征分析 [D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007．

[3]Gussow D，Clackson T.Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction[J]. Nucleic Acids Res，1989，17（10）：4 000-4 010．

[4]金姝，鄒玉涵，閆佩毅，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌DNA提取方法的改進(jìn) [J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，37（3）：303-305.

[5]中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì).出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法第一部分：金黃色葡萄球菌：SN/T 2754.1—2011[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[6]賈愛(ài)榮，張永剛，王萍，等.食品檢測(cè)中革蘭氏陽(yáng)性菌DNA提取新方法的研究 [J].食品工業(yè)，2011（12）：104-107.

[7]劉道文，陳萍，魏瓊，等.Percoll分離法與多重PCR快速檢測(cè)肉品中沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌 [J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32（11）：871-874.

[8]Psifiedi A，Dovas C I，Banos G.A comparison of six methods for genomic DNA extraction suitable for PCR-based genotyping applications using ovine milk samples[J].Mol Cell Probes，2010，24（2）：93-98.

[9]Murray J R，Rajevan M S.Evaluation of DNA extraction from granulocytes discarded in the separation medium after isolation of peripheral blood mononuclear cells and plasma from whole blood[J].MBC Research.，2013（6）：440-444.

A Comparative Study on Salmonella spp.and Staphylococcus aureus DNA Extraction Methods

XIAO Qianwen1，WANG Yanrui1，LIU Tong1，LIU Shuang1，HE Miao2，REN Dayong1，*CHEN Ping1
（1.Food Science and Engineering College，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118，China；2.Anxin Food Technology Services of Limited Liability Company in Jinlin Province，Changchun，Jilin 130012，China）

To extract Salmonella spp.and Staphylococcus aureus DNA by the methods of boiling water extraction，kit assay，improved CTAB method，DNA extracting solution method and TEX cracking liquid method，compare the quality of the extracted DNA by the five methods.Choosing an extraction method applied to multiplex PCR detection of Salmonella spp.and Staphylococcus aureus in agricultural products.The results show that TEX cracking liquid method to extract high purity of DNA，simple operation，save time and effort，low costs.The purity of Salmonella DNA is 1.88，and the concentration is 412.6 ng/μL；the purity of Staphylococcus aureus DNA is 1.84 with the concentration 366.7 ng/μL by using the TEX cracking liquid method.The extraction of DNA by PCR can amplify objective band with extraction DNA as template.

Salmonella spp.；Staphylococcus aureus；genome DNA extraction

TS201.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.015

1671-9646（2017）02a-0048-03

2016-12-01

吉林省發(fā)改委產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目資助（2014Y106）。

肖茜文（1990— ），女，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

*通訊作者：陳 萍（1968— ），女，博士，教授，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。