宋 纖，平 勇

(上海交通大學(xué)Bio-X研究院，教育部遺傳發(fā)育與精神疾病重點實驗室,上海 閔行 200240)

Aβ42對果蠅攻擊和交配等社交行為的不同調(diào)節(jié)作用

宋 纖，平 勇

(上海交通大學(xué)Bio-X研究院，教育部遺傳發(fā)育與精神疾病重點實驗室,上海 閔行 200240)

Aβ42(β-amyloid 42)蛋白聚集的毒性作用可能是阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease,AD)的主要病因之一.運用模式生物果蠅研究Aβ42可能對果蠅部分社交行為的影響.首先，在Aβ42果蠅AD模型中觀察到Aβ42在果蠅神經(jīng)中樞蘑菇體區(qū)域的聚集和沉積.然后，觀察Aβ42果蠅的攻擊性，實驗發(fā)現(xiàn)Aβ42能加速首次攻擊時間，并增加攻擊頻率等.最后，觀察Aβ42果蠅的交配行為.實驗證明,表達(dá)Aβ42可以增強中年果蠅攻擊性行為，而對交配取向沒有明顯作用.實驗結(jié)果可為后續(xù)深入研究Aβ42對攻擊性行為影響的神經(jīng)環(huán)路和分子基礎(chǔ)提供參考.

果蠅；β淀粉樣蛋白；社交行為；攻擊性行為；調(diào)節(jié)作用

0 引言

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種起病相對隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，并且一般發(fā)病較晚，大多在65歲以上.中國已進(jìn)入老齡化社會，老齡人比例將逐步升高，AD患者數(shù)量也將呈遞增趨勢[1].AD最常見的臨床問題是出現(xiàn)認(rèn)知障礙.通過多種動物模型研究，在細(xì)胞分子水平上，已獲得相當(dāng)多的研究成果，從神經(jīng)元突觸的變化到神經(jīng)元凋亡等[2-4].除了認(rèn)知問題外，AD病人也會出現(xiàn)一些精神紊亂和社交障礙[5]，包括部分病人相對具有較強的攻擊性[6].在與AD相關(guān)的小鼠APP(amyloidprecursorprotein)基因突變體中也有類似現(xiàn)象[7].為此，需要了解這些社交行為變化的細(xì)胞分子基礎(chǔ)，為針對性治療提供實驗和理論支持.

果蠅行為學(xué)研究歷史久遠(yuǎn)[8]，從節(jié)律睡眠到交配機(jī)制研究等均有涉及[9-10].關(guān)于果蠅攻擊性研究可以追溯到1915年[11].最近，對果蠅攻擊性和交配取向又有了更多新的認(rèn)識[12-14]，比如章魚胺能神經(jīng)元參與調(diào)控果蠅攻擊性行為[13]等.考慮到果蠅也是眾多神經(jīng)退行性疾病研究的模式生物[15-17]，果蠅行為學(xué)研究或許能為一些神經(jīng)疾病的研究如AD等貢獻(xiàn)力量.

Aβ42在腦內(nèi)的聚集被認(rèn)為是引起AD的主要病因之一[4].利用模式生物可以獲得更多的關(guān)于AD病發(fā)的分子機(jī)制，例如，前期工作利用Aβ42果蠅發(fā)現(xiàn)了AD果蠅中神經(jīng)元興奮性變化的分子基礎(chǔ)，即Aβ42下調(diào)一類鉀通道(Kv4)表達(dá)[18].除此之外，已有更多的下游分子被發(fā)現(xiàn)[15].因此，Aβ42果蠅是研究AD病理基礎(chǔ)的重要動物模型之一[15,19].

本研究率先用AD果蠅模型檢測其部分社交行為，包括攻擊性行為和交配取向行為.實驗發(fā)現(xiàn)表達(dá)Aβ42能增強大齡果蠅的攻擊性行為，包括攻擊頻率增加等，而Aβ42對交配取向行為則沒有明顯影響.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

實驗中用到的果蠅有elav-Gal4；UAS-Aβ42，W；UAS-Aβ40，elav-Gal4；+；其中UAS-Aβ42和UAS-Aβ40系來自美國科羅拉多州立大學(xué)生物醫(yī)學(xué)部Susan Tsunoda教授和清華大學(xué)鐘毅教授的實驗室.所有果蠅都在明暗12 h交替，溫度25 ℃的環(huán)境中培養(yǎng).實驗中所用到的果蠅無論雌雄都挑選羽化8 h以內(nèi)的果蠅.實驗中用到的5#剝腦鑷子購自廣州伯齊生物科技有限公司，后經(jīng)磨尖等處理；Triton、多聚甲醛以及PBS磷酸緩沖液均購自美國SIGMA公司；BSA和Rhodamine二抗購自上海生物生工有限公司；抗熒光衰減封片劑(fluorescent mounting medium)購自美國Dako公司；果蠅培養(yǎng)液、Thioflavin S( TS )購自美國SIGMA公司；Anti-β-Amyloid(1-42)抗體購自美國CALBIOCHEM公司；普通體式顯微鏡購于意大利OPTIKA公司；激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)來自德國LEICA公司.

1.2 果蠅雜交實驗

挑選處女蠅elav-Gal4；+；+與雄果蠅W；UAS-Aβ40，將其放在同一管食物里置于25 ℃環(huán)境中培養(yǎng)繁殖.10 d后轉(zhuǎn)走親代果蠅，挑選剛羽化出來的子一代elav-Gal4；UAS-Aβ40果蠅進(jìn)行后續(xù)實驗.

1.3 腦組織切片ThioflavinS(TS)染色

分別挑選7 d左右的elav-Gal4；UAS-Aβ42和elav-Gal4；UAS-Aβ40雄性果蠅，用CO2迷暈后置于90倍體式顯微鏡下在果蠅培養(yǎng)液中剝離腦組織.將剝離干凈的腦組織放置多聚甲醛溶液中室溫固定30 min，之后用2%(體積分?jǐn)?shù)，以下同)的PBT(PBS+Triton)溶液清洗3～4次，使細(xì)胞膜孔打開，每次10～15 min.接著將腦組織轉(zhuǎn)入0.025 g·mL-1的TS溶液(0.25 g TS，5 mL PBS，5 mL Ethanol)中，4 ℃冰箱過夜.第二天，在50%(體積分?jǐn)?shù))的酒精中清洗浸泡10 min進(jìn)行脫色，再用2%的PBT溶液清洗3～4次，每次5 min.最后滴加封片劑進(jìn)行封片.

在加入Anti-β-Amyloid(1-42)抗體(Rabbit pAb,Calbiochem)實驗中，固定清洗后加入適量的10% BSA(BSA+2% PBT，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以下同)溶液進(jìn)行封閉.30 min后，加入1 μL抗體和100 μL的10% BSA溶液(抗體體積分?jǐn)?shù)為1∶100)，置于4℃冰箱過夜.第二天，繼續(xù)用2%的PBT溶液清洗4～5次，每次5～10 min.過后加入1 μL的Rhodamine二抗和100 μL的10% BSA溶液，室溫避光封閉1 h后再用PBT溶液清洗3～4次，每次5 min.然后滴加適量封片劑封片，避光保存，在-20 ℃冰箱放置2 h后進(jìn)行激光掃描共聚焦顯微成像實驗[18].

1.4果蠅攻擊性實驗

收集羽化8 h以內(nèi)的果蠅，將實驗組和對照組果蠅都分別分成7 d和15 d兩個不同年齡段的組別.將每只需要測試的雄果蠅單獨飼養(yǎng)在5 mm×60 mm的小管里.果蠅飼養(yǎng)到第7天或第15天的時候，分別將對照組和實驗組的果蠅各自成對地放入測試室進(jìn)行攻擊性行為實驗.測試室是15 mm×15 mm×8 mm的手工制作的小紙盒，果蠅迷暈放進(jìn)去后，蓋上18 mm×18 mm的蓋玻片.需要注意的是，測試室里面必須放有充足的食物.待果蠅蘇醒后，記錄15 min內(nèi)的攻擊次數(shù)以及第一次發(fā)起攻擊的時間.實驗過程通過攝像頭拍攝.攻擊行為包括俯沖/追逐等，檢測參見文獻(xiàn)[20].

1.5 果蠅交配取向?qū)嶒?/p>

大量收集羽化8 h以內(nèi)的果蠅.其中，將測試需要用的雄果蠅(test fly)單獨放置在盛有適量食物的小管里培養(yǎng)7 d或15 d，而供選擇交配的目標(biāo)雄性果蠅和雌性果蠅(testee male or female)則分別群體培養(yǎng)相應(yīng)的天數(shù).第7天以及第15天的時候，將群體飼養(yǎng)的雄果蠅和雌果蠅分別斷頭后固定在用來供選擇交配的小型一次性培養(yǎng)皿的兩端.之后，將迷暈的測試雄果蠅放入，待其蘇醒后，將在兩只去頭的目標(biāo)果蠅中選擇它要交配的對象，記錄其2 h內(nèi)選擇不同的交配對象的交配時間.實驗過程通過攝像頭拍攝，參見文獻(xiàn)[14].計算交配取向指數(shù)，公式如下：

Preference Index(PI)=(tfemale-tmale)/(tfemale+tmale)×100%

1.6 數(shù)據(jù)分析

獲得數(shù)據(jù)通過Sigma Plot 10、Coreldraw、Photoshop CS2等軟件分析并作圖.數(shù)據(jù)完全根據(jù)實驗方法所獲得，每組數(shù)據(jù)分析采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean ± SEM).對于成正態(tài)分布的數(shù)據(jù)一般通過student’s test和ANOVA(多組)比較分析，分為匹配比較和非匹配比較兩種.當(dāng)*P值小于0.05,即為有顯著性差異，同時設(shè)定**P< 0.01,***P< 0.001.

2 實驗結(jié)果

2.1 Aβ42果蠅腦內(nèi)出現(xiàn)Aβ纏結(jié)

分別將相同年齡段的elav-Gal4；UAS-Aβ42，elav-Gal4；UAS-Aβ40雄果蠅迷暈剝?nèi)∧X組織，固定后用TS染色制成腦切片.TS即硫代黃素S，是一種混合物，來自于甲基化的脫氫硫甲苯胺和磺酸，可以用于對阿爾茲海默斑點進(jìn)行染色.elav-Gal4是一種pan-Gal4，可以驅(qū)動UAS-目的基因在全神經(jīng)元范圍內(nèi)的表達(dá).elav-Gal4；UAS-Aβ40基因型的果蠅表達(dá)神經(jīng)毒性相對較小的Aβ40(記為Aβ40)[19]，實驗組則為Aβ42.進(jìn)而，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察TS標(biāo)記的Aβ纏結(jié).圖1(a)左側(cè)圖顯示的是通過TS染色的Aβ40果蠅神經(jīng)中樞蘑菇體(mushroom body,MB)區(qū)域的情況，顏色較暗，幾乎沒有染上；圖1(a)右側(cè)圖為Aβ42果蠅腦切片，顏色鮮亮，在鏡下可以看到MB區(qū)域有非常明顯的纏結(jié).這結(jié)果說明TS識別了Aβ42果蠅中由Aβ42形成的纏結(jié)，而Aβ40果蠅則幾乎沒有纏結(jié).一般認(rèn)為，長肽Aβ42相較Aβ40而言更易形成纖維纏結(jié).而在誘導(dǎo)遺傳型AD的早老素突變的小鼠模型中，雖然總量可能降低，目前認(rèn)為Aβ42/Aβ40比例增加而導(dǎo)致纖維纏結(jié)的出現(xiàn)[21]，提示Aβ40可能具備抑制Aβ42形成纏結(jié)的功能.Aβ40果蠅沒有出現(xiàn)纏結(jié)可能的解釋包括：① 驅(qū)動表達(dá)的Aβ40量不足以形成纏結(jié)；② 果蠅腦內(nèi)環(huán)境(包括Aβ40清除)不利于Aβ40形成纏結(jié).

接著，檢測Aβ42果蠅腦內(nèi)Aβ42蛋白的表達(dá)情況.分別加入相同體積比(1∶100)的Aβ42抗體制成腦切片后繼續(xù)在顯微鏡下觀察，圖1(b)分別顯示的是通過Aβ42抗體標(biāo)記的對照組w;UAS-Aβ42 (Control,Ctr)果蠅和實驗組Aβ42果蠅MB區(qū)域Aβ42蛋白表達(dá)的共聚焦圖.與TS染色結(jié)果基本一致，對照組依然沒有看到明顯的Aβ42蛋白表達(dá)，而統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)實驗組Aβ42蛋白表達(dá)量則顯著高于對照組(見圖1(c)).

圖1 Aβ42果蠅腦內(nèi)MB區(qū)域出現(xiàn)Aβ纏結(jié)Fig.1 Aβ42 depositions in Aβ42 flies,but not in Aβ40 or Ctr flies

2.2 Aβ42果蠅影響果蠅攻擊性行為

分別測試實驗組Aβ42果蠅和對照組Aβ40果蠅在7 d以及15 d大小時的攻擊性行為.果蠅的生活周期較短，7 d的AD果蠅正處于青年時期，而15 d時已接近中年.在果蠅攻擊性行為實驗中主要統(tǒng)計兩個數(shù)據(jù)：一是果蠅進(jìn)入攻擊室蘇醒后15 min內(nèi)首次發(fā)起攻擊的時間，即第一次攻擊開始的延時(latency)；二是15 min內(nèi)攻擊的次數(shù)(即頻率，frequency).圖2(a)左邊的柱狀圖顯示的是對照組和實驗組年輕果蠅首次攻擊的延時時間平均值.可以看到它們幾乎都是在200 s后才開始發(fā)動攻擊，且Aβ40果蠅和Aβ42果蠅之間沒有顯著差異.當(dāng)繼續(xù)測試15 d大小的果蠅攻擊性實驗時，發(fā)現(xiàn)Aβ40果蠅和Aβ42果蠅之間有了明顯的差異.Aβ40果蠅進(jìn)入攻擊室后2 min左右才會出現(xiàn)第一次攻擊對方，而Aβ42果蠅的延時明顯短于Aβ40果蠅，如圖2(a)右邊所示.選用Aβ40對照組主要考慮到轉(zhuǎn)基因背景對果蠅可能潛在的影響，相較野生型果蠅，Aβ40果蠅作為對照組更為適宜.Aβ40果蠅在14 d出現(xiàn)攻擊潛伏時間縮短現(xiàn)象，在野生型果蠅中也觀察到類似現(xiàn)象.

分析其在15 min之內(nèi)攻擊的次數(shù)，不同年齡段不同基因型的果蠅的表現(xiàn)很不一致.年輕的果蠅，不管是實驗組還是對照組，似乎都不具備強的攻擊性，彼此之間也沒有很大的差別.而當(dāng)它們到中年時，實驗組和對照組果蠅的攻擊頻率都增大了，且實驗組果蠅增加的幅度高于對照組，攻擊次數(shù)顯著高于對照組，見圖2(b).實驗結(jié)果說明，Aβ42能加速首次攻擊時間，且增強中年AD果蠅的攻擊性行為.

圖2 Aβ42增強中年果蠅的攻擊性行為Fig.2 Aβ42 expression enhances aggression behaviors in mid-aged flies

2.3 Aβ42果蠅對交配取向行為沒有影響

為了進(jìn)一步觀察Aβ42對果蠅的其它的行為是否有影響，除去已被大眾所熟知的的學(xué)習(xí)記憶等，研究方向定在果蠅的交配取向行為上.繼續(xù)選取Aβ40果蠅作為Aβ42果蠅的對照組，繼續(xù)檢測不同年齡段的交配取向行為實驗.當(dāng)果蠅飼養(yǎng)至7 d大小時，將目標(biāo)雌雄果蠅分別斷頭放在測試皿的兩端，之后將迷暈的測試果蠅放在中間位置，距離斷頭果蠅距離幾乎相同，見圖3(a).待其蘇醒后，記錄2 h內(nèi)測試果蠅分別與斷頭雌果蠅和雄果蠅的交配行為時間，分別記作tfemale和tmale.統(tǒng)計交配取向指數(shù)PI如圖3(b)所示：Aβ40和Aβ42果蠅之間沒有顯著性變化.是不是如攻擊性行為實驗一樣，Aβ42果蠅的交配取向行為也要到中年時才會有顯著差異呢？于是又做了15 d大小果蠅的交配取向行為實驗.這一次，Aβ40和Aβ42組之間依然沒有任何顯著性變化.這些結(jié)果說明了Aβ42不改變雄性果蠅交配取向.

圖3 Aβ42不改變雄性果蠅交配取向 Fig.3 Aβ42 expression doesn’t change the mating orientation of the flies

3 結(jié)語

實驗結(jié)果首次證明了Aβ42表達(dá)能影響部分果蠅社交行為，如攻擊性行為，而對交配取向則沒有明顯作用.這些結(jié)果與對AD病人的觀察基本一致，比如一些AD病人在早期也會出現(xiàn)攻擊性行為.這些結(jié)果提示，今后可以利用果蠅AD模型，深入研究一些社交行為變化的神經(jīng)環(huán)路和細(xì)胞分子基礎(chǔ).

AD病人如何會出現(xiàn)社交障礙？社會活動經(jīng)驗是現(xiàn)代化生活的必須知識，且主要是后天通過與環(huán)境和其他人交互作用而獲得[22].在退行性疾病如AD中，會出現(xiàn)多種不同層面的衰退，從突觸消失，到神經(jīng)元凋亡、行為異常[2,23].在果蠅中，控制社交行為如攻擊性行為的神經(jīng)中樞目前還不明確[12-13].下一步將研究控制攻擊性行為的中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng).進(jìn)而觀察在AD模型中，網(wǎng)絡(luò)功能的可能變化以及推測其對攻擊性行為的影響.研究也提示了果蠅腦內(nèi)部分中間神經(jīng)元參與調(diào)控果蠅攻擊性行為[12-13]，因此，后續(xù)可以找出Aβ42果蠅的中間神經(jīng)元活動的變化是否導(dǎo)致攻擊性行為變化.

[1] 寧宇,李波,方芳,等.人口老齡化與老年人口健康及疾病問題的研究進(jìn)展[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2008,34(4):1 102-1 105.

[2] SELKOE D J.Alzheimer’s disease[M].New York:Cold Spring Harb Perspect Biol,2011:1-198.

[3] SELKOE D J.Preventing Alzheimer’s disease[J].Science,2012,337(6 101):1 488-1 492.

[4] WALSH D M,SELKOE D J.A beta oligomers:a decade of discovery[J].J Neurochem,2007,101(5):1 172-1 184.

[5] LI X L,HU N,TAN M S,etal.Behavioral and psychological symptoms in Alzheimer’s disease[J].Biomed Res Int,2014,2014(13):927-934.

[6] BALLARD C,CORBETT A.Agitation and aggression in people with Alzheimer’s disease[J].Curr Opin Psychiatry,2013,26(3):252-259.

[7] LALONDE R,FUKUCHI K,STRAZIELLE C.APP transgenic mice for modelling behavioural and psychological symptoms of dementia(BPSD)[J].Neurosci Biobehav Rev,2012,36(5):1 357-1 375.

[8] BELLEN H J,TONG C,TSUDA H.100 years ofDrosophilaresearch and its impact on vertebrate neuroscience:a history lesson for the future[J].Nat Rev Neurosci,2010,11(7):514-522.

[9] OZKAYA O,ROSATO E.The circadian clock of the fly:a neurogenetics journey through time[J].Adv Genet,2012,77:79-123.

[10] YAMAMOTO D,KOGANEZAWA M.Genes and circuits of courtship behaviour inDrosophilamales[J].Nat Rev Neurosci,2013,14(10):681-692.

[11] STURTEVANT A H.Experiments on sex recognition and the problem of sexual selection inDrosophila[J].Anim Behav,1915,5:351-366.

[12] LIU W,LIANG X,GONG J,etal.Social regulation of aggression by pheromonal activation of Or65a olfactory neurons inDrosophila[J].Nat Neurosci,2011,14(7):896-902.

[13] ZHOU C,RAO Y.A subset of octopaminergic neurons are important forDrosophilaaggression[J].Nat Neurosci,2008,11(9):1 059-1 067.

[14] SHAO L,SHUAI Y,WANG J,etal.Schizophrenia susceptibility gene dysbindin regulates glutamatergic and dopaminergic functions via distinctive mechanisms inDrosophila[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(46):18 831-18 836.

[15] FERNANDEZ-FUNEZ P,DE MENA L,RINCON-LIMAS D E.Modeling the complex pathology of Alzheimer’s disease inDrosophila[J].Exp Neurol,2015,274(Pt A):58-71.

[16] FINELLI A,KELKAR A,SONG H J,etal.A model for studying Alzheimer’s Abeta42-induced toxicity inDrosophilamelanogaster[J].Mol Cell Neurosci,2004,26(3):365-375.

[17] LU B,VOGEL H.Drosophilamodels of neurodegenerative diseases[J].Annu Rev Pathol,2009,4(4):315-342.

[18] PING Y,HAHM E T,WARO G,etal.Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration,learning and motor deficits,and a shorter lifespan in an Alzheimer’s model[J].PLoS Genet,2015,11(3):e1005025.

[19] IIJIMA K,LIU H P,CHIANG A S,etal.Dissecting the pathological effects of human Abeta40 and Abeta42 inDrosophila:a potential model for Alzheimer’s disease[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(17):6 623-6 628.

[20] CHEN S,LEE A Y,BOWENS N M,etal.Fighting fruit flies:a model system for the study of aggression[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(8):5 664-5 668.

[21] XIA D,WATANABE H,WU B,etal.Presenilin-1 knockin mice reveal loss-of-function mechanism for familial Alzheimer’s disease[J].Neuron,2015,85(5):967-981.

[22] SOKOLOWSKI M B.Social interactions in “simple” model systems[J].Neuron,2010,65(6):780-794.

[23] SELKOE D J.The therapeutics of Alzheimer’s disease:where we stand and where we are heading[J].Ann Neurol,2013,74(3):328-336.

(責(zé)任編輯：洪江星)

Aβ42 differently regulates aggression and courtship behaviors inDrosophila

SONG Qian,PING Yong

(Bio-X Institutes,Key Laboratory for the Genetics of Developmental and Neuropsychiatric Disorders (Ministry of Education),Shanghai Jiao Tong University,Minhang,Shanghai 200240,China)

The accumulation of β-amyloid(Aβ)oligomers in the brain has strongly been implicated as one of primary events in the progression of AD(Alzheimer’s disease).This study tested possible social interaction changes,including aggression and mating orientation by using a Aβ42 expressingDrosophilaAD model.Firstly,the results confirmed that there were Aβ42 depositions in Aβ42 fly brains.Moreover,Aβ42 increased aggression behaviors in middle-aged flies,but not in young flies.Aβ42 significantly decreased aggression latency and increased frequency.Lastly,no mating orientation changes were found in Aβ42 flies at different ages.Results demonstrated that Aβ42 expression increased aggression behaviors in flies,but without changing mating orientation.

Drosophila; β-amyloid; group behavior; aggression behavior; modulation effects

10.7631/issn.1000-2243.2017.02.0296

1000-2243(2017)02-0296-05

2015-12-22

平勇(1985- )，副教授，主要從事神經(jīng)生物學(xué)方面的研究，yoping@sjtu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金資助項目(81371482)；上海教委科研創(chuàng)新重點資助項目(14ZZ028)；上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉資助項目(YG2014MS71)

Q42

A