番鴨細(xì)小病毒玍P3基因的原核表達(dá)及鑒定

吳萌 王安平 吳海濤

摘要[目的]使番鴨細(xì)小病毒（DPV）VP3在原核表達(dá)系統(tǒng)中正確表達(dá)。[方法]根據(jù)番鴨細(xì)小病毒 VP3基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出VP3基因；將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a，獲得重組表達(dá)載體pET-32a-VP3。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白。[結(jié)果]成功表達(dá)出與預(yù)期大小相符的重組蛋白，約89 kDa；且當(dāng)IPTG濃度為1.2 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)蛋白表達(dá)量最大。[結(jié)論]該研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了DPV、VP3蛋白，并摸索了蛋白最佳表達(dá)條件。

關(guān)鍵詞番鴨細(xì)小病毒；VP3基因；原核表達(dá)

中圖分類號(hào)S852.65+7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）35-0124-04

Abstract[Objective]To prepare the prokaryotic expression of VP3gene of Muscovy duck parvovirus.[Method]One pair of specific primers was designed to amplify VP3 gene by PCR.The amplified fragments were cloned into prokaryotic expression vector pET32a，and the recombinant plasmids were transformed into E.coli BL21（DE3）cells.The protein was expressed following IPTG induction，and detected by the SDSPAGE.[Result]The recombinant protein matched with the expected result was successfully expresssed，the size of the recombinant protein was about 89 kDa.When the concentration of IPTG was 1.2 mmol/L，the time was 6 h，the expression of protein was the largest.[Conclusion]The expression of VP3 protein of DPV was successfully expressed through the prokaryotic expression system，and the best expression conditions were explored.

Key wordsMuscovy duck parvovirus；VP3 gene；Prokaryotic expression

番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus，DPV）引起的主要侵害3周齡以內(nèi)雛番鴨的疫病[1-3]。該病在很多國(guó)家和地區(qū)均有流行，以腹瀉、喘氣和腳軟為主要癥狀[4]。該病的發(fā)病率較高、傳播迅速、造成番鴨大量死亡，且病鴨痊愈后機(jī)能障礙，成為僵鴨。DPV屬于細(xì)小病毒科依賴病毒屬，為單股線性DNA病毒?；蚪M全長(zhǎng)約5.1 kb，含有2個(gè)開放閱讀框（Open Reading Frame；ORF），左側(cè)ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS，右側(cè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白。其中，VP3是最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，約占總蛋白的80%，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的主要抗原[5]。該試驗(yàn)通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)DPV VP3蛋白，并摸索蛋白最佳表達(dá)條件，以期為進(jìn)一步研究番鴨細(xì)小病毒奠定基礎(chǔ)。

1材料與分析

1.1材料

1.1.1病毒與菌種。DPV尿囊液、新城疫病毒（NDV）尿囊液、pET-32a載體、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）均由江蘇省農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院省獸用生物制藥高技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2酶類和主要試劑。

Pfu DNA Polymerase、限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Sac Ⅰ及T4 DNA連接酶、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒和DNB顯色液購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Ampicillin）購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3主要儀器。PCR儀（Applied Biosystems公司）；臺(tái)式低溫離心機(jī)（HITACHI公司）；生化培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；DYY-10C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon公司）；超聲波裂解儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；SDS-PAGE電泳儀及TE70X半干轉(zhuǎn)印裝置（BIO-RAD公司）；紫外分光光度計(jì)（HITACHI公司）。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成。

參考GenBank中已發(fā)表的DPV VP3衣殼蛋白基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)用于擴(kuò)增VP3基因的引物（上游插入BamH I酶切位點(diǎn)，下游插入Sac I酶切位點(diǎn)），由北京英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為VP3-pET-F：5-TATGGATCCATGGCAGAGGGAGCAAGC-3， VP3-pET-R：5-TAAGAGCTCCAGATTCTGAGTCAAATACC-3，產(chǎn)物大小為1 602 bp。

1.2.2VP3目的基因的合成。

將含有DPV的雞胚尿囊液煮沸10 min，-20 ℃冷凍10～20 min， 4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液為PCR模板。PCR反應(yīng)體系（25 μL）如下：

模板DNA 1 μL；PrimerF、PrimerR（25 mmol/ L）各1 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL；dNTP（2.5 mmol/ L）2.5 μL；Pfu DNA Polymerase（5 U/μL）0.5 μL；dd H2O 16.5 μL。

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30～35個(gè)循環(huán)后，72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3重組表達(dá)載體pET-32a-VP3的構(gòu)建。

1.2.3.1目的基因VP3與載體pET-32a的連接。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的基因，將目的基因VP3和質(zhì)粒pET-32a分別經(jīng)BamH I和Sac I雙酶切。回收酶切后的目的片段VP3和質(zhì)粒pET-32a，經(jīng)T4 DNA連接酶連接，連接體系（10 μL）如下：10×Buffer 1 μL；T4 DNA Ligase 0.5 μL；pET-32a 2 μL；目的片段VP3 5 μL；ddH2O 1.5 μL。22 ℃作用90 min，連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化。

1.2.3.2連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。

根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第3版）[6]所述，采用氯化鈣法制備CaCl2感受態(tài)細(xì)胞，以每管125 μL分裝。取連接產(chǎn)物3 μL加至1管DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42 ℃熱休克90 s，迅速冰浴2 min，而后加入800 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃、140 r/min培養(yǎng)1 h。取200 μL菌液涂布于含有Amp+100 μg/mL的LB平板上， 37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h。

1.2.3.3重組質(zhì)粒的酶切鑒定及測(cè)序。

隨機(jī)挑取上述平板中數(shù)個(gè)單菌落，分別接種于5 mL 含Amp+100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)過夜。取過夜菌為模板，VP3-pET-F、VP3-pET-R為上下游引物，進(jìn)行PCR。將PCR初步鑒定為陽性的菌株提取質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-VP3。

將重組質(zhì)粒pET-32a-VP3分別經(jīng)BamH I單酶切以及BamH I和Sac I雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系（40 μL）如下：

重組質(zhì)粒30 μL；BamH Ⅰ 0.5 μL；Sac Ⅰ 0.5 μL；10×Buffer BamH Ⅰ 4 μL；10×Buffer Sac Ⅰ 4 μL；ddH2O 1 μL。單酶切反應(yīng)體系（40 μL）如下：重組質(zhì)粒30 μL；BamH Ⅰ 0.5 μL；10×Buffer BamH Ⅰ 4 μL；ddH2O 5.5 μL。37 ℃水浴3～4 h，取10 μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

將酶切鑒定正確的重組菌送至測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序后正確的即為陽性重組表達(dá)載體pET-32a-VP3。

1.2.4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定。

1.2.4.1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

將鑒定正確的表達(dá)載體pET-32a-VP3的重組質(zhì)粒和載體pET-32a質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。挑取重組菌BL21（pET-32a-VP3）及宿主菌BL21（pET-32a）單菌落，接種于5 mL含有Amp+ 100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)過夜，即為種子液。

12～16 h后，將種子液分別轉(zhuǎn)接種于5 mL含有Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)約3 h，當(dāng)OD600達(dá)0.6～0.8時(shí)，向其中分別加入IPTG（終濃度為1 mmol/L），37 ℃、220 r/min搖床中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.2.4.2表達(dá)條件的優(yōu)化。

（1）IPTG濃度的優(yōu)化。將種子液轉(zhuǎn)接種于30 mL含有Amp+的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min振搖培養(yǎng)。當(dāng)OD600等于0.6時(shí)，將30 mL菌液平均分裝到6支試管，向其中分別加入IPTG（終濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol/L），37 ℃、220 r/min搖床中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

（2）誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化。將種子液轉(zhuǎn)接種于30 mL含有Amp+的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)。當(dāng)OD600等于0.6時(shí)，向其中加入IPTG（終濃度為1 mmol/L），在37 ℃、220 r/min搖床中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為2、4、6、8 h及過夜后，分別收集5 mL誘導(dǎo)的菌液。

1.2.4.3重組蛋白SDS-PAGE分析和Western blot檢測(cè)。

將上述菌液分別離心，收集菌體，而后冰浴中超聲波裂解，離心，取上清，沉淀以500 μL PBS重懸。分別取裂解上清液、沉淀與5×SDS Loading Buffer混合，煮沸10 min，上樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

并對(duì)重組蛋白和空載體蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，以5%脫脂乳封閉，以抗His標(biāo)簽蛋白的鼠單抗為檢測(cè)一抗，在DAB顯色試劑盒作用下顯色觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1VP3基因的克隆PCR結(jié)果經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)1條大小約1 600 bp的條帶，與預(yù)期相符，初步判斷為目的片段VP3，結(jié)果見圖1。

2.2重組表達(dá)載體pET-32a-VP3的構(gòu)建與酶切鑒定

將重組質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ和Sac Ⅰ 雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，產(chǎn)生與預(yù)期大小相符的2個(gè)條帶，分別為1 600、5 900 bp；經(jīng)BamH Ⅰ 單酶切后產(chǎn)生1條約7 500 bp大小的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果顯示，目的片段VP3序列正確，且閱讀框正確，酶切鑒定結(jié)果見圖2。

2.3重組蛋白pET-32a-VP3的SDS-PAGE分析

重組菌BL21（pET-32a-VP3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，以PBS溶液重懸，超聲裂解，SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，重組菌獲得了表達(dá)，蛋白大小約89 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符，且以包涵體形式存在，SDS-PAGE結(jié)果見圖3。重組蛋白能與His標(biāo)簽蛋白的鼠單抗特異性反應(yīng)，在約89 kDa處出現(xiàn)條帶（圖4）。

2.4表達(dá)條件的優(yōu)化

重組菌BL21（pET-32a-VP3）隨著誘導(dǎo)劑IPTG濃度的增加，重組蛋白的表達(dá)量逐漸增加，當(dāng)IPTG的總濃度為1.2 mmol/L時(shí)，蛋白表達(dá)量達(dá)頂峰，結(jié)果見圖5。

重組菌BL21（pET-32a-VP3）隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，重組蛋白表達(dá)量增加，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)6 h時(shí)，表達(dá)量最大（圖6）。

3結(jié)論與討論

番鴨細(xì)小病毒（DPV）的VP基因相互重疊，雖然起始密碼子不在同一位置，但終止密碼子在同一位點(diǎn)。編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3的基因起始密碼子分別位于2 450、2 885、3 044 nt[7]，所以VP1含有組成VP2、VP3的全部氨基酸序列， VP2在蛋白酶的作用下裂解出VP3。VP3是最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體[8]。

該研究將番鴨細(xì)小病毒的VP3基因克隆到pET-32a載體上，在原核表達(dá)體系中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出大小約89 kDa的VP3重組蛋白；且當(dāng)IPTG濃度為1.2 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)蛋白表達(dá)量最大。

該研究成功獲得了DPV重組蛋白，為DPV 的研究以及番鴨細(xì)小病毒疫苗的研制提供了參考資料。

參考文獻(xiàn)

[1]

林世棠，郁曉嵐，陳炳鈿，等.一種新的雛番鴨病毒性傳染病的診斷[J].中國(guó)畜禽傳染病，1991（2）：25-26.

[2] 程由銓，林天龍，胡奇林，等.雛番鴨細(xì)小病毒病的病毒分離和鑒定[J].病毒學(xué)報(bào)，1993，9（3）：228-235.

[3] 董嘉文，李林林，孫敏華.雛番鴨細(xì)小病毒病研究進(jìn)展[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2012（10）：2-6.

[4] 阮二壘，陳芳艷，陳瑞愛，等.雛番鴨細(xì)小病毒病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26（5）：68-70.

[5] 余兵，王永坤，朱國(guó)強(qiáng)，等.番鴨細(xì)小病毒M91G27株病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP3編碼基因的克隆與鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，22（6）：409-411.

[6] 李載平.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第3版）[J].科學(xué)通報(bào)，2002，47（24）：1888.

[7] 程由銓，胡奇林，陳少鶯，等.番鴨細(xì)小病毒和鵝細(xì)小病毒生化及基因組特性的比較[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，21（5）：429-433.

[8] 孟松樹，王永坤.番鴨細(xì)小病毒特性的初步研究[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，15（4）：52-57.