橡膠樹(shù)膠胞炭疽菌T—900突變體生物學(xué)研究及其假定基因LV1敲除載體構(gòu)建

鄭肖蘭 李秋潔 鄭行愷 劉先寶 李博勛 時(shí)濤 黃貴修

摘 要 從構(gòu)建的橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌RC178（Colletotrichum gloeosporioides）突變體庫(kù)中篩選獲得一株致病力明顯減弱突變體T-900，與野生菌株相比其菌落生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢能力，孢子萌發(fā)率及附著孢形成率均明顯降低。通過(guò)對(duì)突變菌株T-900 T-DNA側(cè)翼序列克隆、比對(duì)和基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明外源片段的插入破壞了一個(gè)預(yù)測(cè)基因的功能，該基因和組蛋白H3同源性為99%，暫命名為L(zhǎng)V1。通過(guò)同源臂克隆構(gòu)建了該基因敲除載體900-1A-900-1B-pCT74，為進(jìn)一步研究該基因在病原菌致病過(guò)程中的作用機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 膠孢炭疽菌；T-900；生物學(xué)特性；基因敲除載體；轉(zhuǎn)化與再生

中圖分類(lèi)號(hào) S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract A mutant strain T-900 with weakened virulence to rubber trees was obtained from T-DNA insertion mutation library， and the conidia sporulation rate， spore germination and appressorium formation rate of T-900 were significantly lower than the wild-type stain RC178. The T-DNA flanking sequence of T-900 was obtained by TAIL-PCR and compared with the whole genome of C. gloeosporioides by sequence alignment. The results showed that the sequence in which the T-DNA was inserted contains a gene that was designated as LV1， The gene and histone H3 homology were 99%. In order to study the function of the pathogenicity gene LV1， The gene knockout vector 900-1A-900-1B-pCT74 was successfully constructed by homologous cloning and restriction endonuclease digestion. This method was successfully used to construct a high efficient gene knockout system of LV1， which provides a technical platform for the functional verification of the pathogenic genes of Colletotrichum gloeosporioides.

Key words Colletotrichum gloeosporioides； biological characteristics； T-900； gene knockout vector； transformation and regeneration

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.022

天然橡膠是一種世界性重要工業(yè)原料和重要戰(zhàn)略物資[1-3]。蔡志英、孫董董等發(fā)現(xiàn)由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染引起的炭疽病是橡膠生產(chǎn)中常發(fā)的重要葉部病害，產(chǎn)量損失巨大[3-5]。劉艷等[6]發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌幾乎可以在所有作物上引起炭疽病害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

由于炭疽病寄主范圍廣、傳播途徑多、存活時(shí)間長(zhǎng)、生理小種變異多等，蔡志英等發(fā)現(xiàn)炭疽病一旦大面積發(fā)病后很難利用藥劑進(jìn)行防治[7-8]。培育和推廣抗病品種是一種經(jīng)濟(jì)、安全、有效的措施，但多年來(lái)，利用常規(guī)育種方式很難得到對(duì)炭疽病菌耐病或高抗的品種[9]。所以目前從分子方面研究其致病基因顯得尤為重要，通過(guò)對(duì)炭疽菌分子致病機(jī)制的研究，希望能為病害的防治和品種抗病性的保持提供新的思路和途徑[1，9]。許多真菌包括膠胞炭疽菌的大規(guī)模測(cè)序工作為人們提供了大量的EST序列、ITS序列、全基因組序列等信息，其中大部分基因仍然是功能未知基因，通過(guò)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)分析僅能預(yù)測(cè)出其假設(shè)功能，而利用基因敲除方法可為研究基因功能提供最直接有利的證據(jù)[10-11]。

基因敲除是研究基因功能最具說(shuō)服力的分子遺傳操作方法之一，是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)一系列實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，然后從整體觀察突變體的表型性狀，通過(guò)分析突變體表型而明確基因功能的方法[9，12]。筆者研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)獲得農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系在膠孢炭疽菌成功應(yīng)用，獲得1個(gè)致病相關(guān)突變體T-900，生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)其與野生型菌株RC178存在明顯差異，對(duì)其插入位點(diǎn)基因擬命名為L(zhǎng)V1。為了研究假設(shè)基因LV1的功能，目前迫切需要一個(gè)十分高效的基因敲除策略來(lái)研究各個(gè)基因?qū)τ谥虏⌒院痛渭?jí)代謝物方面的影響。本實(shí)驗(yàn)將潮霉素標(biāo)記技術(shù)引入到炭疽菌基因敲除載體中。利用該載體，篩選在潮霉素選擇壓力下能正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子，提高轉(zhuǎn)化子的篩選效率。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌T-DNA插入突變體（T-900）及其野生型菌株RC178均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所保存；突變體T-900致病力明顯減弱，且T-DNA單拷貝。

主要試劑：潮霉素B（Roch）、Tap酶（北京天根生物公司）、T4 DNA連接酶（大連寶生物）、溶壁酶（廣東碧德）、氨芐青霉素（Solarbio）、PEG3350（Sigama）、膠回收試劑盒和PCR回收試劑盒（Omega）等。

培養(yǎng)基：MM培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基、LR培養(yǎng)基等配置方法參照蔡志英博士論文[1]。

1.2 方法

1.2.1 突變菌株T-900的生物學(xué)性狀分析 膠孢炭疽菌突變菌株T-900致病力測(cè)定：參照劉艷的方法[6]；菌落形態(tài)及生長(zhǎng)速率測(cè)定方法參照鄭肖蘭論文[13]；產(chǎn)孢量及孢子形態(tài)測(cè)定方法、孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的觀察方法參照劉艷論文[6]。

1.2.2 突變菌株T-900的T-DNA測(cè)定分子檢測(cè)

原理是依據(jù)T-DNA（其中包含1個(gè)潮霉素及其啟動(dòng)子的片段，插入結(jié)構(gòu)如圖1）隨機(jī)插入到炭疽菌野生型RC178 DNA中，具體方法參照劉艷論文[14]。檢測(cè)所用hph通用引物為Hf：5′-GGTAATGGT AACGCCATGCTCCTT-3′，Hr：5′-CCATTACTGCA ACACTCGAGGCT-3′，以RC178、T-900和AGL-PT的基因組為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.3 突變菌株T-900 T-DNA側(cè)翼序列的克隆

采用TAIL-PCR[1]方法擴(kuò)增T-900的側(cè)翼序列，所采用的簡(jiǎn)并引物及其結(jié)構(gòu)圖和位置參照文獻(xiàn)[15]及劉艷[14]。

1.2.4 酶切法構(gòu)建LV1基因敲除載體 傳統(tǒng)酶切法構(gòu)建LV1載體示意圖見(jiàn)圖2。

（1）同源臂克隆與含酶切位點(diǎn)上下游片段的獲得。通過(guò)T-900的側(cè)翼序列所在膠胞炭疽菌全基因組中獲取預(yù)測(cè)基因LV1，并在基因LV1開(kāi)放閱讀框外兩側(cè)各取1 000 bp左右的片段作為L(zhǎng)V1基因兩個(gè)同源臂A，B（記為T(mén)-900-1A、T-900-1B）的備選區(qū)域，并對(duì)其進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，同時(shí)結(jié)合pCT74載體上潮霉素抗性基因兩端的酶切位點(diǎn)選擇同源臂兩端合適的酶切位點(diǎn)。

基因LV1同源A臂5的酶切位點(diǎn)為ApaI，3端酶切位點(diǎn)為Xhol，B臂5端酶切位點(diǎn)為EcoRI，3端酶切位點(diǎn)為SacI，根據(jù)選擇的酶切位點(diǎn)和同源臂備選區(qū)的序列，設(shè)計(jì)引物如下：

A臂：T-900-1A-F： CGGGCCCCCTGTGTCTTT GCGTTTGG ApaI

T-900-1A-R： CCCTCGAG GGAGTGATTGTGT GCCAGAC Xhol

B臂：T-900-1B-F：CGGAATTC TTCTTCTCC TTCAAAGACAAGC EcoRI

T-900-1B-R：CGAGCTC GCGTAGTCAAGAC AATACAAGA SacI

以橡膠樹(shù)炭疽菌野生型RC178的基因組DNA為模板，擴(kuò)增待敲除基因LV1上下游的AB臂。擴(kuò)增到預(yù)期的目的條帶后分別命名為：900-1A、900-1B。

將900-1A和900-1B PCR產(chǎn)物膠回收，回收產(chǎn)物連接到pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。菌落PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化成功，挑取轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌，搖菌過(guò)夜培養(yǎng)，菌液用于提取質(zhì)粒送測(cè)序。經(jīng)測(cè)序獲得上下游基因正確的質(zhì)粒，分別命名為：900-1A-T、900-1B-T；用于下步實(shí)驗(yàn)的雙酶切。

（2）900-1A-T連接至載體pCT74。用ApaI和Xhol酶對(duì)900-1A-T、pCT74進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，將回收得到的產(chǎn)物連接至pCT74。然后將連接后含有目的片段pCT74轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用ApaI和Xhol酶雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒命名為900-1A-pCT74。

（3）900-1B-T連接至載體900-1A-pCT74。用EcoRI和SacI酶對(duì)900-1B-T，900-1A-pCT74進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，將回收得到的900-1B連接至900-1A-pCT74。將連接后含有目的片段900-1A-pCT74轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用EcoRI和SacI酶雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒命名為900-1A-900-1B-pCT74，即為L(zhǎng)V1基因的敲除載體。

（4）結(jié)合上述酶切法驗(yàn)證后，將用相應(yīng)的酶也能獲得預(yù)測(cè)大小相等的目的片段載體送測(cè)序，利用序列正確進(jìn)行再次驗(yàn)證。

用ApaI和SacI酶雙酶切900-1A-900-1B-pCT74，獲得的目的片段用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。

1.2.5 原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化與再生

具體方法參照蔡志英[1]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變菌株T-900的生物學(xué)性狀分析

2.1.1 T-900 致病性測(cè)定結(jié)果 致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)：接種后第5天觀察，結(jié)果如圖3：空白對(duì)照基本沒(méi)有產(chǎn)生病斑，僅僅是培養(yǎng)基的印痕；T-900發(fā)病輕，病斑小；RC178則發(fā)病嚴(yán)重，病斑大。

2.1.2 T-900與RC178生長(zhǎng)速率測(cè)試結(jié)果 由圖4得知，RC178平均生長(zhǎng)速率為（0.933±0.003） cm/d，而T-900則為（0.503±0.011） cm/d，明顯低于野生型RC178，由此推測(cè)，菌落生長(zhǎng)速率的減弱可能是由于T-DNA插入導(dǎo)致突變體代謝紊亂造成的。

2.1.3 T-900與RC178產(chǎn)孢量的測(cè)定及分生孢子大小觀察結(jié)果 橡膠樹(shù)炭疽菌主要是通過(guò)分生孢子侵染為害橡膠樹(shù)，因此，產(chǎn)孢量的多少勢(shì)必對(duì)其致病性起著舉足輕重影響。從圖5-A可見(jiàn)，T-900產(chǎn)孢量與RC178產(chǎn)孢量方差分析結(jié)果顯示，在產(chǎn)孢能力上存在極顯著差異。

通過(guò)顯微鏡觀察并對(duì)分生孢子大小進(jìn)行測(cè)量發(fā)現(xiàn)（圖5-B），突變體T-900分生孢子形態(tài)與RC178相比，也存在變異。野生型RC178菌株分生孢子大小為（14.41±0.34） μm × （4.03±0.07） μm，長(zhǎng)柱型或長(zhǎng)圓型，表面光滑，兩端鈍圓。而T-900分生孢子大小為（10.27±0.31） μm × （5.09±0.08） μm，較短粗，呈橢圓形或短棍棒形。方差分析結(jié)果顯示，突變體T-900分生孢子長(zhǎng)度與野生型RC178差異顯著。

2.1.4 T-900與RC178分生孢子萌發(fā)及附著孢形成觀察結(jié)果 分生孢子萌發(fā)及附著胞形成是炭疽菌侵染寄主過(guò)程中非常關(guān)鍵的一步，分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生附著胞才有可能再分化出一系列侵染結(jié)構(gòu)侵染寄主，因此較低的萌發(fā)率或者附著胞形成率同樣可能是致病性降低或者喪失的原因之一。統(tǒng)計(jì)了T-900與野生型RC178的萌發(fā)率和附著胞形成率：其中孢子萌發(fā)率分別為32.00%、86.00%；而附著胞形成率則分別為28.00%、80.00%，相比較均存在顯著差異（圖6）。

2.2 突變菌株T-900的T-DNA分子檢測(cè)結(jié)果

從圖7可知，參試菌株T-900和含有載體質(zhì)粒AGL-PT的PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)均可擴(kuò)增到約800 bp的潮霉素片段，而陰性對(duì)照野生型菌株RC178和空白對(duì)照則沒(méi)有任何條帶。表明參試的突變體基因組中確實(shí)插入了潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hph。

2.3 突變菌株T-900 T-DNA側(cè)翼序列克隆結(jié)果

參試簡(jiǎn)并引物AD004在T-900右邊界擴(kuò)增到特異條帶，從圖8-A可見(jiàn)，第3輪擴(kuò)增的特異條帶比第2輪的小，與理論擴(kuò)增結(jié)果吻合。將PCR產(chǎn)物送樣測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖9。序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖8-B，與Conocephalum supradecompositum，Colletotrichum alienum，Colletotrichum ignotum的H3 gene相似性為99%，據(jù)此初步推測(cè)該T-DNA 插入位點(diǎn)相關(guān)基因?yàn)榻M蛋白H3相關(guān)基因。

2.4 酶切法構(gòu)建LV1基因敲除載體

2.4.1 同源臂的克隆與含酶切位點(diǎn)的上下游片段的獲得 同源臂的克隆和同源臂的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖10，泳道1、2均擴(kuò)增到預(yù)期的目的條帶分別命名為：900-1A、900-1B。對(duì)900-1A、900-1B的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、轉(zhuǎn)化、克隆、測(cè)序，測(cè)序獲得上下游基因正確的質(zhì)粒，分別命名為：900-1A-T、900-1B-T，用于下步實(shí)驗(yàn)的雙酶切。

2.4.2 900-1A-T連接至載體pCT74 用ApaI和Xhol酶對(duì)900-1A-T、pCT74進(jìn)行雙酶切，結(jié)果獲得預(yù)測(cè)的目的片段，見(jiàn)圖11-A，此外酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，回收得到的產(chǎn)物連接至質(zhì)粒pCT74。將連接后含有目的片段pCT74轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后再使用ApaI和Xhol酶雙酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖11-B。酶切檢測(cè)目的片斷大小與預(yù)測(cè)一致的質(zhì)粒送測(cè)序，鑒定正確的質(zhì)粒命名為900-1A-pCT74。

2.4.3 900-1B-T連接至載體900-1A-pCT74 利用EcoRI和SacI對(duì)900-1B-T、900-1A-pCT74進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，將回收得到的900-1B連接至900-1A-pCT74。將連接后含有目的片段900-1A-pCT74轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用EcoRI和SacI酶雙酶切鑒定。經(jīng)鑒定正確的質(zhì)粒命名為900-1A-900-1B-pCT74，即為L(zhǎng)V1基因的敲除載體（圖12）。

2.4.4 驗(yàn)證 將載體送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明：900-1A-900-1B-pCT74同源上、下臂插入的方向正確，序列正確，證明LV1敲除載體構(gòu)建成功。

利用ApaI和SacI酶雙酶切900-1A-900-1B-pCT74后，獲得的目的片段用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。

2.5 原生質(zhì)體的制備

通過(guò)炭疽菌野生型菌株RC178孢子在CM液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，以及溶壁酶的酶解，最終用1.2×STC溶液把原生質(zhì)體濃度調(diào)整為1×107～3×107個(gè)/mL，獲得的原生體質(zhì)體形態(tài)完整、呈球形、大小比較均一、未破裂，符合原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的要求（圖13）。

2.6 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化與再生

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化處理后取200 μL均勻涂抹于SR培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)5 d后，在SR培養(yǎng)基上長(zhǎng)出多個(gè)菌落，有些菌落菌絲稀薄透明，無(wú)氣生菌絲，有些菌落，相對(duì)較小，菌絲透明，但不能擴(kuò)散，這類(lèi)不能擴(kuò)散的菌落一般認(rèn)為是沒(méi)有轉(zhuǎn)化成功的野生型菌株。挑取能擴(kuò)散的單菌落轉(zhuǎn)接到潮霉素濃度為250 μg/mL的SR培養(yǎng)基，5 d后，挑取正常生長(zhǎng)的菌落，在含有350 μg/mL的SR培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩。最終獲得LV1疑似突變菌株18個(gè)。其中未轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子和RC178在含潮霉素（350 μg/mL）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d未長(zhǎng)出菌落（圖14）。

3 討論

目前已經(jīng)進(jìn)入后基因組時(shí)代， 基因功能研究勢(shì)必越來(lái)越受重視， 通過(guò)基因的改造和干預(yù)進(jìn)行控制植物病害， 相關(guān)基因的功能研究是必經(jīng)階段?；蚯贸夹g(shù)是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來(lái)的特異性敲除特定基因的技術(shù)，該技術(shù)定位性強(qiáng)， 是一種理想的修飾改造生物遺傳物質(zhì)的方法， 使人們有可能真正按自己的設(shè)想去改造生物的遺傳物質(zhì)， 并能穩(wěn)定遺傳， 具有其他研究方法無(wú)法替代的作用， 在基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用中都有著廣闊的前景[16]。目前對(duì)病原真菌膠胞炭疽菌的分子機(jī)制研究還相當(dāng)薄弱，利用基因敲除篩選鑒定膠胞炭疽菌致病相關(guān)基因?qū)ζ渲虏C(jī)制的研究及闡明相當(dāng)重要。而基因敲除轉(zhuǎn)化子的篩選是研究真菌基因敲除的關(guān)鍵點(diǎn)。本研究首先通過(guò)T-DNA插入突變技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)含有啟動(dòng)子潮霉素標(biāo)記的農(nóng)桿菌載體對(duì)膠胞炭疽菌野生型菌株RC178進(jìn)行隨機(jī)插入突變，獲得了致病力明顯減弱突變菌株T-900，并對(duì)該菌株進(jìn)行了系列生物學(xué)特性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T-900與RC178相比較致病力、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和附著胞形成率均明顯下降，據(jù)此推測(cè)T-DNA隨機(jī)插入突變菌株T-900其插入位點(diǎn)相關(guān)基因LV1與其致病力等生物學(xué)特性表型相關(guān)，為了進(jìn)一步研究該插入位點(diǎn)基因LV1的功能，很有必要通過(guò)對(duì)野生型菌株RC178敲除LV1進(jìn)行驗(yàn)證，因此本研究通過(guò)傳統(tǒng)酶切法成功構(gòu)建該基因的敲除載體。本研究在構(gòu)建的基因敲除載體中導(dǎo)入質(zhì)粒pCT74，其含有1個(gè)潮霉素hygB抗性基因，使基因敲除轉(zhuǎn)化子獲得潮霉素抗性，通過(guò)潮霉素培養(yǎng)基的篩選，可直接獲得基因敲除轉(zhuǎn)化子。在目前研究中，有關(guān)優(yōu)化轉(zhuǎn)化子篩選的報(bào)道較少，其中劉曉妹[17]將含全部編碼序列的CCK1毒素基因片段克隆在pMD18-T載體的克隆位點(diǎn)上，經(jīng)酶切后反向插入潮霉素hygB基因，成功構(gòu)建了CCK1毒素基因敲除載體。毛建才等[9]在一種新的大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）基因敲除載體的構(gòu)建中成功構(gòu)建了一個(gè)攜帶GFP篩選標(biāo)記的大麗輪枝菌敲除載體，使隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色，而敲除轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下不呈現(xiàn)綠色。由于該技術(shù)必須單孢分離后才能獲得純正的基因敲除轉(zhuǎn)化子，相對(duì)來(lái)說(shuō)也增加了大量的工作量；王曉亮[18]通過(guò)使用 USER酶克隆技術(shù)，在hph基因兩側(cè)引入U(xiǎn)SER酶特異位點(diǎn)，構(gòu)建了一系列用于禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum Schwabe）基因敲除和熒光融合蛋白表達(dá)的基因敲除載體pKH-KO。但在實(shí)際操作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同基因重疊 PCR條件差異較大，經(jīng)常出現(xiàn)重疊失敗或者重疊擴(kuò)增效率低、產(chǎn)物量少，不足以進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)化的情況，摸索最佳條件往往花費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間。安樂(lè)等[19]利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行核盤(pán)菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]交配型基因mat1-1敲除載體構(gòu)建。此外Zeilinger[20]利用傳統(tǒng)的PEG介導(dǎo)方法對(duì)深綠木霉（Trichoderma atroviride）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，同源重組的頻率很低，而利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得了60%的同源重組轉(zhuǎn)化子，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)tmkl和tga3基因非編碼區(qū)的基因破壞[20]。而本方法所采用的全部是最基礎(chǔ)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，成功率高，更易于上手操作。雖然成功獲得假定基因LV1敲除載體，但如果能把LV1基因與綠色熒光蛋白基因融合后再導(dǎo)入T-900和LV1缺失株中，通過(guò)熒光檢測(cè)LV1基因的初步表達(dá)位置及表達(dá)量（有些基因在菌絲表達(dá)，有些基因在分生孢子表達(dá)，有些在細(xì)胞壁表達(dá)，有些在細(xì)胞核表達(dá)），并通過(guò)比較T-900和LV1缺失株中及野生型菌株RC178的基因表達(dá)差異，分析差異表達(dá)基因功能，以便更深入地了解到LV1基因的作用機(jī)制。

本試驗(yàn)利用反向遺傳學(xué)的手段，應(yīng)用傳統(tǒng)酶切法構(gòu)建了橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌T-900突變體的致病相關(guān)基因LV1敲除載體，以期通過(guò)同源重組策略敲除橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌野生型菌株RC178的LV1基因，為進(jìn)一步研究該基因的功能及其他相關(guān)基因的研究奠定了基礎(chǔ)，結(jié)果還發(fā)現(xiàn)這種方法對(duì)于在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行炭疽菌基因敲除和蛋白定位等基因功能的研究有著很大的應(yīng)用前景。

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